HPLC-UV法測(cè)定魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯

蔡文堅(jiān)，謝春燕，柳文俊，鐘棱，曾少群，岳峰

(廣東嘉博制藥有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511517)

魚油脂肪乳注射液因其豐富的ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFAs)而具有獨(dú)特的藥理作用，尤其在抗感染、降血脂、抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)以及輔助改善記憶等方面有突出的效果[1-5]。魚油含有豐富的ω-3PUFAs，極易發(fā)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致魚油變質(zhì)。開發(fā)魚油脂肪乳需要使用一種安全、有效的抗氧化劑，以避免氧化酸敗。

L-抗壞血酸棕櫚酸酯是一種高效的氧清除劑和增效劑[6]，被《美國(guó)藥典》收載作為醫(yī)藥輔料，具有安全性高和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)[7-8]，在油脂抗氧化領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[9-11]。在開發(fā)魚油脂肪乳制劑時(shí)，采用L-抗壞血酸棕櫚酸酯作為抗氧化劑，可以獲得良好的效果。同時(shí)根據(jù)國(guó)家食品藥品審批中心指導(dǎo)原則的要求，藥品中的抗氧化劑必需進(jìn)行檢測(cè)，并在長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中檢測(cè)控制。

目前，文獻(xiàn)主要報(bào)道的是測(cè)定食品、奶粉以及油脂中抗壞血酸棕櫚酸酯的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)測(cè)定魚油脂肪乳注射液中的L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬建立一種測(cè)定魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的HPLC-UV法，為開發(fā)脂肪乳劑中L-抗壞血酸棕櫚酸酯的檢測(cè)提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀；BT125D十萬(wàn)分之一電子分析天平(Sartorius)。

1.2 試藥

L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)照品(批號(hào)：BCBL 0771V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.9%，Sigma公司)；抗壞血酸對(duì)照品(批號(hào)：20101101-1，分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；魚油脂肪乳注射液(批號(hào)：18150401、18150402、18150403，廣東嘉博制藥有限公司)；甲醇(HPLC級(jí)，Sinence公司)；四氫呋喃(HPLC級(jí)，Merk公司)；水為純化水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(100 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以KH2PO4溶液-甲醇(體積比25∶75)為流動(dòng)相A，以四氫呋喃-水(體積比45∶55)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序(0～30 min，95%A；31～41 min，5%A；42～46 min，100%A)；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：40 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 流動(dòng)相A 取KH2PO41.0 g，置1 000 mL量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，取KH2PO4緩沖液250 mL及甲醇750 mL置1 000 mL燒杯中，用磷酸調(diào)pH至4.0，濾過(guò)并進(jìn)行超聲波脫氣。

2.2.2 流動(dòng)相B 取四氫呋喃450 mL及純化水550 mL置1 000 mL燒杯中，超聲波脫氣，即得。

2.2.3 稀釋液 精密稱取抗壞血酸50 mg，置1 000 mL量瓶中，用甲醇-水(體積比8∶2)溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.4 對(duì)照品溶液 精密稱取L-抗壞血酸棕櫚酸酯25 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置25 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，制成每1 mL中含0.02 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.5 缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯陰性溶液 稱取魚油30 g放置燒杯中，加入蛋黃卵磷脂3.6 g攪拌均勻，得油相，備用。將甘油7.5 g溶于270 mL的水中，得水相。然后將上述油相倒入水相攪拌成乳劑，即得缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯陰性溶液。

2.2.6 供試品溶液 取供試品原液在N2保護(hù)下放置于取樣瓶中。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取稀釋液(空白溶劑)、缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯陰性溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示空白溶劑和其他原輔料不干擾L-抗壞血酸棕櫚酸酯的測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

ABCD180160140120100806040200180160140120100806040200180160140120100806040200180160140120100806040200mAUmAUmAUmAUt/min28.00527.536048121620343832364044

2.4 檢測(cè)限及定量限

取L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋至信噪比約為10∶1的濃度為定量限，信噪比約為3∶1的濃度為檢測(cè)限。L-抗壞血酸棕櫚酸酯定量限為8 μg/mL，檢測(cè)限為2 μg/mL。同時(shí)，進(jìn)樣6針定量限濃度樣品，峰面積的RSD值為1.7%。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取L-抗壞血酸棕櫚酸酯對(duì)照品適量，精密稱定，溶于抗壞血酸溶液中，超聲溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.022 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液0.5、1、2、4、5 mL至10 mL量瓶中，加入抗壞血酸溶液定容至刻度，搖勻，得到系列濃度溶液。分別注入液相色譜儀，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得到線性方程Y=5 171.4X+11.097，r=0.999 7，表明L-抗壞血酸棕櫚酸酯質(zhì)量濃度在0.050 1～0.501 1 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積成良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果測(cè)得主峰峰面積RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品6份，每份溶液連續(xù)進(jìn)樣2次，測(cè)得每份供試品溶液的平均質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL，其RSD值為1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，在N2保護(hù)下密封于取樣瓶，放置2、4、6、8 h后取樣注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積RSD值為1.2%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取L-抗壞血酸棕櫚酸酯16、20、24 mg至100 mL量瓶中，在N2保護(hù)下加入空白溶液(缺L-抗壞血酸棕櫚酸酯處方)充分搖勻溶解并定容，得到相當(dāng)于供試品溶液80%、100%和120%的3個(gè)濃度溶液。取對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果測(cè)得9份溶液的回收率在99.2%～102.0%之間，平均回收率為99.5%，RSD為1.3%，表明方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表1。

2.10 耐用性考察

取供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣，柱溫變化±5 ℃、流速變化20%、波長(zhǎng)變化±5 nm時(shí)，結(jié)果測(cè)得供試品中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的RSD值為0%，表明方法耐用性良好。

2.11 樣品測(cè)定

取批號(hào)為18150401、18150402、18150403的3批魚油脂肪乳注射液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果測(cè)得L-抗壞血酸棕櫚酸酯平均質(zhì)量濃度分別為0.211 3、0.210 4、0.217 3 mg/mL(n=3)。

表1 L-抗壞血酸棕櫚酸酯的加樣回收率試驗(yàn)Table 1 Results of recovery test of L-ascorbgyl palmitate

3 討論

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的L-抗壞血酸棕櫚酸酯檢測(cè)方法主要有碘量法[12]、硅鉬蘭分光光度法[13]、2，6-二氯酚靛酚法[14]、薄層色譜法[15]。碘量法操作簡(jiǎn)單，但魚油脂肪乳注射液為乳白色混懸液體，影響滴定終點(diǎn)的判斷；硅鉬蘭分光光度法需要的試劑多，操作繁瑣，影響結(jié)果的重復(fù)性；2，6-二氯酚靛酚法簡(jiǎn)便易行、快速，以目測(cè)判斷終點(diǎn)，誤差較大；薄層色譜法要經(jīng)過(guò)制板、點(diǎn)樣、展開、顯色等處理，操作較繁瑣。有報(bào)道選擇HPLC-ELSD 法檢測(cè)抗壞血酸棕櫚酸酯[16]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)是一種通用型的檢測(cè)器，可檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品。但考慮脂肪乳劑含有的有機(jī)物質(zhì)組分較多，有可能會(huì)受到其他組分(如油脂)的干擾。

L-抗壞血酸棕櫚酸酯作為脂肪乳劑的抗氧化劑，具有易被氧化的特點(diǎn)。如分析前對(duì)乳劑進(jìn)行分離處理該抗氧化劑容易被氧化，考慮到魚油脂肪乳中油脂含量較低(約占10%)，制備成納米乳粒，流動(dòng)性好，進(jìn)樣后可直接溶于流動(dòng)相中。直接進(jìn)樣可以滿足檢測(cè)要求，同時(shí)也避免處理樣品時(shí)造成L-抗壞血酸棕櫚酸酯氧化。但如直接進(jìn)樣，脂肪乳劑含有一定量的油脂，長(zhǎng)期反復(fù)進(jìn)樣有使反相柱柱效下降的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本方法在主峰出來(lái)之后繼續(xù)使用較高濃度的四氫呋喃對(duì)殘留在色譜柱中的油脂進(jìn)行洗脫，可減緩色譜柱柱效下降。同時(shí)，L-抗壞血酸棕櫚酸酯含有酯結(jié)構(gòu)容易水解，需要注意pH值。

本文建立了測(cè)定魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的HPLC-UV法，該方法操作快捷簡(jiǎn)便，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為魚油脂肪乳注射液中L-抗壞血酸棕櫚酸酯含量的檢查方法。