COPD 大鼠肺組織和骨骼肌中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量變化

賀佳林 胡瑞成 戴愛國

1深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科518109;2湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,長沙410016;3長沙醫(yī)學(xué)院410000

COPD 其病變與慢性支氣管炎(杯狀細(xì)胞黏液分泌過多與黏膜下腺增生)、肺氣腫 (氣道實質(zhì)性破壞)、肺間質(zhì)纖維化和小氣道的炎癥相關(guān)聯(lián),COPD 肺組織的慢性炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中存在著氧化應(yīng)激反應(yīng),多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其COPD 的形成過程[1-3]。近年來COPD 導(dǎo)致骨骼肌萎縮的改變其相關(guān)分子機(jī)制引起人們的高度關(guān)注,其中涉及各種細(xì)胞因子介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等因素[4]。本研究通過被動吸煙致大鼠COPD 模型探討COPD 形成過程中肺組織和肺外組織、外周血、骨骼肌中活性氧(reactive oxygen species, ROS)、 丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量的改變。

1 材料與方法

1·1 實驗動物 選擇健康8周齡SPF 級雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量 (184.05±13.61)g。動物購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司,由湖南省動物檢疫二站檢驗合格,許可證書編號:SCXK (湘)2009-0012。將實驗用大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)房喂養(yǎng),晝/夜12/12 h,溫度22℃左右,濕度60%～70%,自由飲水進(jìn)食,本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1·2 儀器和試劑 主要儀器:小動物呼吸機(jī) (江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司),光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司),紫外/可見光分光光度計(美國Perkin Elmar公司),精密分析天平(瑞士Mettler公司),-80 ℃超低溫冰箱 (日本Sanyo公司),低溫臺式離心機(jī) (長沙鑫奧儀器儀表有限公司),全自動酶標(biāo)洗板機(jī) (匯松PW-812),多功能酶標(biāo)分析儀 (匯松MB-530)。主要試劑:芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,尼古丁1.0 mg/支,焦油12 mg/支);ROS檢測試劑盒 (酶聯(lián)生物),MDA 檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所),TNF-α 檢測試劑盒 (美國Multi Sciences 公司),IL-6 檢測試劑盒 (美國Multi Sciences公司)。

1·3 建立COPD 動物模型 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為COPD 模型組和對照組,每組10只。參考彭艷[5]的方法建立COPD 大鼠模型:每天將COPD 模型組大鼠置于專用被動式吸煙裝置(60 cm×60 cm×40 cm)內(nèi),采用單純被動吸煙方法將香煙(芙蓉王牌)置于被動式吸煙裝置底部燃燒形成煙霧,被動吸煙期間保持裝置中含氧量為18%左右。每天單純被動吸煙8次共計20支,上午和下午分別吸4次,每次間隔1 h,持續(xù)被動吸煙4個月后建立COPD 大鼠模型。對照組大鼠置于相同另一被動吸煙裝置內(nèi)不給予特殊處理,其時間和環(huán)境條件與實驗組一致。被動吸煙過程中大鼠易聚堆,可利用長條驅(qū)散。持續(xù)被動吸煙4個月以后,在中南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)實驗室采用小動物呼吸機(jī)對大鼠肺功能進(jìn)行檢測確認(rèn)COPD 模型建立成功,采集支氣管肺泡灌洗液、肺中葉組織、外周全血和外周肌中的小腿伸趾長肌作為本實驗的標(biāo)本。

1·4 觀察指標(biāo) (1)肺組織HE染色觀察肺組織病理改變;(2)小動物呼吸機(jī)測定肺功能;(3)硫代巴比妥酸法測定支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿上清液、外周血血清和骨骼肌勻漿上清液MDA 含量,按試劑盒說明書進(jìn)行檢測;(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿上清液、外周血血清和骨骼肌勻漿上清液ROS、IL-6和TNF-α的含量,按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1·5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s 表示,組間比較采用t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2·1 大鼠肺組織病理改變比較 大鼠肺組織經(jīng)HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變,結(jié)果可見模型組4個月后肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)出典型的COPD 病理改變:大量肺泡融合,肺泡壁變薄、破裂,炎癥細(xì)胞大量浸潤,有典型肺氣腫表現(xiàn)提示COPD 大鼠模型建立成功。對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常,管腔內(nèi)未見滲出物,肺泡腔未見病理性擴(kuò)大,見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理改變 HE ×100 A:COPD模型組;B:對照組

2·2 大鼠肺功能的改變 對COPD 模型組與對照組大鼠進(jìn)行肺功能指標(biāo)最大呼氣量 (peak expiratory flow,PEF)、0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 0.3 second,FEV0.3)和FEV0.3/FVC 的測定,模型組大鼠肺功能指標(biāo)PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC與對照組肺功能指標(biāo)比較顯著降低,兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=13.58、7.71、13.87,P 值均＜0.001),提示小氣道氣道阻力增加、殘氣量增加,存在明顯氣流受阻、阻塞性通氣功能障礙的變化。對照組未見肺功能氣道阻力和殘氣量增加的變化。檢測結(jié)果進(jìn)一步支持本實驗建立的被動吸煙致大鼠COPD 模型成立,見表1。

表1 大鼠肺功能指標(biāo)的測定結(jié)果 (±s)

表1 大鼠肺功能指標(biāo)的測定結(jié)果 (±s)

注:PEF為最大呼氣量;FEV0.3為0.3秒用力呼氣容積

組別鼠數(shù)PEF(ml/s)FEV0.3(ml)FEV0.3/FVC(%)COPD 模型組10 23.89±2.49 3.68±0.28 62.48±3.54對照組10 43.06±4.49 4.77±0.33 83.14±3.11 t 值13.58 7.71 13.87 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2·3 大鼠支氣管肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定 通過對COPD 模型組與對照組大鼠支氣管肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果表明,COPD 模型組中支氣管肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量均出現(xiàn)明顯增高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=30.135、16.489、26.549、25.346,P值均＜0.001),見表2。

2·4 大鼠肺組織勻漿中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量的測定 通過對COPD 模型組與對照組大鼠肺組織勻漿中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果分析,COPD 模型組與對照組比較,肺組織中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α 含量均出現(xiàn)明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t =25.632、15.551、23.422、27.319,P 值均＜0.001),見表3。

2·5 大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量的測定 通過對COPD 模型組與對照組大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果分析,COPD 模型組外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量均出現(xiàn)明顯增高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t =24.146、10.905、17.327、24.243,P 值均＜0.001),見表4。

表2 大鼠肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

表2 大鼠肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

注:ROS為活性氧;MDA 為丙二醛;TNF-α為腫瘤壞死因子-α

組別鼠數(shù)ROS (×103 U/L)MDA (μmol/L)IL-6 (ng/L)TNF-α(ng/L)COPD模型組10 89.67±7.02 25.29±2.46 65.58±6.59 62.81±5.92對照組10 18.37±2.59 9.96±1.61 13.48±2.02 11.61±2.40 t值30.135 16.489 26.549 25.346 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表3 大鼠肺組織勻漿中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

表3 大鼠肺組織勻漿中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

注:ROS為活性氧;MDA 為丙二醛;TNF-α為腫瘤壞死因子-α

組別鼠數(shù)ROS (×103 U/g)MDA (μmol/g)IL-6 (ng/g)TNF-α(ng/g)COPD模型組10 90.24±8.15 25.22±2.42 63.94±6.55 83.70±7.35對照組10 18.25±3.46 9.93±1.95 12.62±2.26 14.31±3.24 t值25.632 15.551 23.422 27.319 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2·6 大鼠骨骼肌組織勻漿中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定 通過對COPD 模型組與對照組大鼠骨骼肌勻漿中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量的測定結(jié)果分析,COPD 模型組骨骼肌組織中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量均出現(xiàn)明顯增高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.082、7.573、15.832、21.206,P 值均 ＜0.001),見表5。骨骼肌中IL-6與血、肺及支氣管肺泡灌洗液中IL-6 的相關(guān)性分析結(jié)果呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.923、0.964、0.942;骨骼肌中TNF-α水平與血、肺及支氣管肺泡灌洗液中TNF-α的相關(guān)性分析結(jié)果呈正相關(guān),其相關(guān)系數(shù)分別為r=0.913、0.966、0.935。

3 討論

研究表明COPD 的特征性病理性改變存在肺組織小氣道、肺實質(zhì)及肺血管的慢性炎癥反應(yīng),多種炎癥細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞被激活后,可釋放一些致炎性細(xì)胞因子主要包括IL-6、IL-8、TNF-α等,這些細(xì)胞因子可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的啟動[6-8]。在炎癥過程中產(chǎn)生的自由基如超氧陰離子自由基和羥基自由基可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),引起細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化,從而進(jìn)一步導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的破壞,引起肺氣腫、外周氣道的炎癥和水腫、黏液過度分泌和纖維化。

ROS包括超氧陰離子自由基、羥基自由基以及過氧化氫等。ROS主要由中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等激活的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生,當(dāng)ROS生成過多時,可導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 過氧化。ROS對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有一定的溶解作用,可減弱上皮細(xì)胞參與損傷后修復(fù)的能力,影響細(xì)胞外基質(zhì)重建。MDA 是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一,通過測定MDA 可以了解細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞膜受損的程度。文獻(xiàn)報道在COPD患者肺泡灌洗液和肺組織中可檢測到超氧陰離子自由基和過氧化氫等ROS增加,ROS的增多與肺泡中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活化有關(guān)。COPD 患者的肺組織中檢測到脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物MDA 表達(dá)增多[9-10]。羅勇等[11]通過大鼠被動吸煙方式實驗結(jié)果顯示煙熏后大鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤,氣道發(fā)生異常炎癥反應(yīng)。同時遠(yuǎn)隔氣道組織的骨骼肌也存在脂質(zhì)過氧化損傷,煙熏12 周以上的大鼠骨骼肌組織MDA 顯著升高。

IL-6是一種主要由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T 和B 淋巴細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等分泌的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,IL-16是炎癥反應(yīng)的早期啟動因素,是COPD 發(fā)病過程中的重要炎性細(xì)胞因子之一。文獻(xiàn)報道COPD 患者痰液和血清中IL-6水平明顯增多,且與FEV1%pred呈負(fù)相關(guān)。COPD 患者血清IL-6水平在治療前明顯高于正常人,且血清IL-6水平與COPD 的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān),隨氣道受限嚴(yán)重程度增高而顯著升高[7-8]。朱木林等[12]通過檢測COPD 合并外周骨骼肌障礙的患者血漿IL-6、IL-8水平結(jié)果顯示COPD合并外周骨骼肌障礙的患者血漿IL-6、IL-8水平顯著高于COPD 無骨骼肌障礙組和對照組。

表4 大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

表4 大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

注:ROS為活性氧;MDA 為丙二醛;TNF-α為腫瘤壞死因子-α

組別鼠數(shù)ROS (×103 U/L)MDA (μmol/L)IL-6 (ng/L)TNF-α(ng/L)COPD模型組10 68.52±6.21 19.43±2.31 45.49±5.24 62.80±5.35對照組10 18.24±2.19 9.72±1.61 13.29±2.66 15.59±3.05 t值24.146 10.905 17.327 24.243 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表5 大鼠骨骼肌組織勻漿中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

表5 大鼠骨骼肌組織勻漿中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的測定結(jié)果 (±s)

注:ROS為活性氧;MDA 為丙二醛;TNF-α為腫瘤壞死因子-α

組別鼠數(shù)ROS (×103 U/g)MDA (μmol/g)IL-6 (ng/g)TNF-α(ng/g)COPD模型組10 56.63±6.43 16.41±2.25 42.43±4.89 52.60±4.58對照組10 18.20±2.06 9.77±1.62 14.44±2.71 15.21±3.18 t值18.082 7.573 15.832 21.206 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞而分泌具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子,TNF-α可促進(jìn)炎性細(xì)胞黏附、游走和浸潤,破壞溶酶體導(dǎo)致溶酶體酶的釋放,從而損傷肺泡上皮細(xì)胞,破壞肺組織結(jié)構(gòu)。TNF-α通過激活核因子κB,促使IL-6、IL-8 m RNA 的轉(zhuǎn)錄與IL-6、IL-8 表達(dá)增加,TNF-α可通過產(chǎn)生的IL-6和IL-8等細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)[13-14]。對COPD 急性發(fā)作期的患者進(jìn)行研究結(jié)果顯示,急性期血清TNF-α水平明顯增高,緩解后TNF-α 水平有所下降,TNF-α 水平與FEV1%pred 和FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān),與肺功能受損程度呈正相關(guān)。何大川等[15]研究發(fā)現(xiàn),COPD合并外周骨骼肌障礙患者血清炎癥因子TNF-α和IL-8水平顯著高于COPD 非萎縮組和健康組,COPD 萎縮組患者血清IL-8及TNF-α與運動耐力和肺功能均呈負(fù)相關(guān)。

本研究COPD 模型組經(jīng)肺組織病理檢測和肺功能測定均支持本實驗建立的連續(xù)被動吸煙4個月致大鼠COPD 模型成立。通過測定支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿上清液、外周血血清和骨骼肌勻漿上清液中ROS、MDA、IL-6 以及TNF-α 的含量結(jié)果顯示,被動吸煙大鼠4 個月COPD 形成過程中支氣管肺泡灌洗液、肺組織勻漿上清液、外周血血清和骨骼肌勻漿上清液中ROS、MDA、IL-6以及TNF-α的含量均呈現(xiàn)顯著增高的表現(xiàn),與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＜0.001);且骨骼肌中IL-6和TNF-α水平與支氣管肺泡灌洗液、肺及血中IL-6和TNF-α水平呈正相關(guān)。該結(jié)果提示當(dāng)COPD 形成過程中肺組織和外周骨骼肌組織中存在炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。骨骼肌組織中炎癥反應(yīng)如何促進(jìn)骨骼肌蛋白分解增多,破壞骨骼肌蛋白的合成與分解的平衡,進(jìn)而引起COPD 骨骼肌萎縮的發(fā)生有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突