IL-8與FeNO 在不同炎癥表型的咳嗽變異性哮喘患者中的水平及臨床意義

張星慧 常曉悅

包頭市中心醫(yī)院呼吸科014040

咳嗽變異性哮喘 (cough variant asthma,CVA)的主要或唯一的臨床常見表現(xiàn)是慢性咳嗽,這種咳嗽常發(fā)生在夜間和凌晨,咳嗽持續(xù)時間一般會超過8周,且無明顯的氣喘、呼吸急促等典型哮喘癥狀,在國內(nèi)多中心調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)CVA 氣道的高反應(yīng)性咳嗽約占慢性咳嗽原因的1/3,但常因胸片無明顯異常體征,臨床上容易被誤診,從而錯過早期干預(yù)的最佳時機,因此對CVA 早期診治具有重要的臨床意義[1]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),隨著病情發(fā)展約有34%～73%的CVA 患者經(jīng)數(shù)年后會發(fā)展成為典型的哮喘[2-3],CVA 其實是典型哮喘的前期狀態(tài)或輕微哮喘,同典型哮喘的病理生理相似,是一種由多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥性疾病,依據(jù)誘導(dǎo)痰分類標準,將哮喘氣道浸潤炎癥細胞分為:中性粒細胞 (neutrophil,Neu)、嗜酸粒細胞(eosinophil,Eos)、混合細胞 (mixed granulocyte,Mix)、寡粒細胞(pauci-granulocytic,Pau)4型,CVA 患者的氣道存在高反應(yīng),也有神經(jīng)調(diào)節(jié)參與等,因此用支氣管擴張劑或茶堿等治療CVA 患者會有一定的療效,目前臨床中常應(yīng)用吸入性激素聯(lián)合吸入性支氣管擴張劑來治療CVA,但治療中發(fā)現(xiàn)有一部分CVA 患者對上述藥物并不敏感[4],這引起研究者好奇,進一步分析原因發(fā)現(xiàn)其氣道浸潤的細胞以Neu為主,因此了解中性粒細胞型CVA的發(fā)病機制,對于CVA 早期預(yù)防及治療有重要意義,在此基礎(chǔ)上進一步研究CVA 氣道炎癥表型,推測不同炎癥表型可能存在不同病理生理機制。Hosoki等[5]研究也發(fā)現(xiàn),IL-8濃度與肺泡灌洗液中的Neu百分比顯著相關(guān),此外還發(fā)現(xiàn)與第1秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比 (forced expiratory volume in one second as a percentage of expected value,FEV1%pred)呈負相關(guān),提示IL-8可反映肺功能下降程度[6-8]。FeNO 測定可能間接反映氣道Eos炎癥水平[9],這對CVA 炎癥表型的治療和早期臨床干預(yù)有重大意義我們的實驗主要通過研究不同炎癥表型CVA 患者與FeNO、IL-8這兩個指標之間關(guān)系,推測它們在不同炎癥表型CVA 病理生理中的具體可能機制,可以使臨床醫(yī)師不僅對CVA 病理生理有了深入了解,同時也可以幫助臨床醫(yī)師對不同炎癥表型的CVA 進行進一步鑒別,為不同炎癥表型CVA 患者進行針對性治療提供可能,同時IL-8拮抗劑為CVA 患者的靶向治療提供可能[10-12]。

1 對象與方法

1·1 研究對象

1·1·1 病例組 隨機選取就診于包頭市中心醫(yī)院呼吸科門診及住院的病例。診斷為CVA 患者87例,男49 例,女38 例,年齡 (39.93±10.58)歲,年齡范圍為18～64歲。分別為Neu組患者21例,男8 例,女13 例;Eos組患者45 例,男20例,女25 例;Mix 組患者13 例,男8 例,女5例;Pau組8例,男3例,女5例。

入選及排除標準:均須符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會2009 年制訂的 《咳嗽的診斷與治療指南》中CVA 的診斷標準,排除標準[1]。

1·1·2 健康對照組 同期選擇本院體檢健康者25人,男/女人數(shù)分別為12/13人,年齡范圍為21～51歲,為對照組。

1·2 方法

1·2·1 檢查 所有人員安靜狀態(tài)下進行檢查,FeNO 及肺功能測定,于清晨取外周靜脈血2 ml,送酶聯(lián)免疫熒光法定量測定血清IgE濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測IL-8的含量。

1·2·2 峰速儀的使用方法 將透明口與峰速儀接口部套緊,然后將分流速儀的紅色游標指針輕輕撥到標尺刻度最低處,一開始先盡量吸足氣,然后將嘴唇嚴密的包住透明口部(注意在吹氣過程中不能漏氣),然后快速的在最短的時間內(nèi)用力將氣一下子吹出、吹凈,這時將紅色游標針會一下移動到一定刻度位置,在此刻度處記錄下來的數(shù)值就是你的最高呼氣流量 (peak expiratory flow rate,PEF)值(如果進行重復(fù)測試時需要將紅色的游標指針歸位到最初的位置處),PEF 測定時間為每天早、晚,每個時間分別測試3次,選擇最高一次PEF,與測試的日期、時間,一起記錄在測試記錄表中,每次測試后將峰速儀進行妥善保管,根據(jù)每日所測PEF來推算日間變異率。公式為:PEF變異率=2(PEF 晚間值-PEF 早晨值)/ (PEF 晚間值+PEF早晨值)×100%,最常用連續(xù)監(jiān)測2周,將每天的變異率相加除以監(jiān)測天數(shù),以監(jiān)測天數(shù)(最少7 d)計算PEF平均變異率。依此判定患者肺功能監(jiān)控情況。

1·2·3 誘導(dǎo)痰及分型 入組的檢查者在清潔漱口后超聲霧化吸入3%～5%氯化鈉溶液,每3～5分鐘囑用力咳嗽,直至咳出痰液,最長不超過20 min。痰咳于無菌培養(yǎng)皿中,向痰液內(nèi)加入4倍體積的0.1%的二硫蘇糖醇,渦旋震蕩10 min;再加等量磷酸鹽緩沖液震蕩5 min,離心半徑15 cm,2 000 r/min,離心10 min;制作細胞涂片,空氣中自然晾干。痰涂片用Wright氏染色液染色。然后在光鏡下進行細胞學(xué)分類并計算細胞總數(shù)、各細胞及各種炎性細胞 (Eos、Neu、Mix、Pau)百分比。光鏡下進行200個非鱗狀細胞分類。(合格痰標本的標準:低倍鏡下白細胞與上皮細胞比例＜2.5)哮喘炎癥表型分類根據(jù)誘導(dǎo)痰細胞學(xué)分類標準之一:進行分組分別為Eos組 (誘導(dǎo)痰中Eos比例≥3%),Neu 組 (誘導(dǎo)痰中Neu 比例≥64%),Mix組 (誘導(dǎo)痰中Neu 比例≥64%,Eos比例≥3%),Pau 組 (誘導(dǎo)痰中Eos比例＜3%,Neu比例＜64%)。

1·2·4 血清IL-8 測定 使用一次性空針采集CVA、對照組人員空腹靜脈血2 ml,注入干燥的滅菌試管內(nèi)(避免溶血),室溫下血液自然凝固10～20 min,離心20 min (以2 000～3 000 r/min,離心半徑為15 cm),仔細收集上清于另一干凈EP管中,置-20 ℃凍存待檢。保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。采用ELISA 法檢測IL-8的含量。采用ELISA 法檢測。標準品經(jīng)過稀釋、加樣、溫育、洗滌、加酶再次溫育、洗滌、顯色等步驟:最后測定,以空白空調(diào)零,450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(original date,OD )值。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行。根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù),通過標準曲線計算樣品中IL-8的濃度。

1·3 統(tǒng)計學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計描述中,所有計量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗法進行正態(tài)檢驗,符合正態(tài)分布的定量資料采用±s 表示,不符合正態(tài)分布的資料采用M(QR)表示;定性資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示。多組計量資料間服從正態(tài)分布和方差齊同的條件,采用單因素方差分析,并用SNK-q 法進行組間比較;方差不齊,采用Kruskal-Wallis 檢驗比較,進行兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。多個樣本率比較采用行列表資料χ2檢驗,雙變量服從正態(tài)分布的采用Pearson相關(guān)分析分析相關(guān)性,不符合則使用Spearman秩相關(guān)分析。α=0.05。

2 結(jié)果

2·1 基本資料數(shù)據(jù) 本研究共納入Neu組患者21例,男8 例,女13 例;Eos組患者45 例,男20例,女25 例;Mix 組患者13 例,男8 例,女5例;Pau組型8 例,男3 例,女5 例;對照組25例,男10例,女15 例。比較5 組實驗者基本資料,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5組實驗者分別在年齡、性別、體質(zhì)量、FEV1/FVC水平方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=3.012、2.223、5.077、3.951、6.912,P 值均＞0.05),Eos組與對照組在身高方面有差異,除了Pau組外,其余3組的FEV1%pred、75%肺活量位最大呼氣流速 (75% maximal mil-expiratory flow,MEF75)、50% 肺活量位最大呼氣流速(50% maximal mid-expiratory flow,MEF50)分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (Z =-2.130、-2.585、-3.354、-5.680、-2.606、-3.581、-3.309、-3.301、-2.146,P 值均＜0.05),而且Neu組、Eos組的MEF75 與Pau組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (Z = -2.585、-3.016,P 值均＜0.05)。見表1。

2·2 血清IL-8濃度比較 Neu組、Eos組、Mix組、Pau組、對照組IL-8濃度比較 比較5 組間IL-8濃度,發(fā)現(xiàn)5組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (H =55.840,P ＜0.001)。分別進行兩兩比較時,Neu組和Mix組IL-8濃度分別高于對照組、Eos組和Pau組3組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-5.447、-3.660、-5.392、-3.968、-3.331、-4.785,P 值均＜0.05)。Neu組與Mix組比較有差異,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.357,P ＜0.001)。Eos組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (Z =-2.305,P ＜0.05)。其他組間兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (Z =-1.071、-0.735,P 值均＞0.05),表明無論是Neu組還是Mix組IL-8 濃度相對于Pau組和對照組明顯升高,說明IL-8參與CVA 患者的氣道炎癥形成,同時與炎癥所在的表型有一定聯(lián)系。見圖1、表2。

圖1 Neu 組、Eos組、Mix 組、Pau 組及對照組5 組間IL-8濃度

表1 5組主要基本臨床特點的比較

2·3 血清總IgE濃度及呼出氣一氧化氮 (fraction of exhaled nitric oxide,FeNO)值比較 Neu組、Eos組、Mix組、Pau組、對照組IgE 值的比較 因為Neu和EoS組血清Ig E 濃度值不服從正態(tài)分布,所以采用Kruskal-Wallis檢驗比較5組的血清Ig E的濃度,發(fā)現(xiàn)5組間存在差異,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H =24.590,P ＜0.001)(表3)。進行兩兩比較時,Eos組和Mix組與其他3組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (Z = -2.751、 -2.484、-4.497、-1.050、-2.277,P 值均＜0.05),Eos組與Mix組比較也有差別,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z =-2.158,P ＜0.05)。見表3、圖2。

表2 Neu組、Eos組、Mix組、Pau組、對照組IL-8濃度的比較

表3 Neu組Eos組Mix組Pau組對照組Fe NO 的IgE水平比較 [M(QR)]

圖2 Neu組、Eos組、Mix組、Pau組、對照組IgE 值的比較

Neu組、Eos 組、Mix 組、Pau 組、對照組FeNO 值的比較 因?qū)φ战M中FeNO 值也不服從正態(tài)分布,采用Kruskal-Wallis檢驗比較,Fe NO 在5組間進行總體對比時,發(fā)現(xiàn)FeNO 值在5組間不同或不全相同,5組間進行兩兩比較,結(jié)果Eos組和Mix組的FeNO 值明顯高于其他3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (Z =-3.846、-3.130、-6.225、-3.739、-3.586、-5.003,P 值均＜0.05)。Eos組和Mix 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (Z =-0.137,P ＞0.05),其他組間進行兩兩比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (Z = -0.415、-0.355、-0.416,P 值均＞0.05)。見圖3。

圖3 Neu組、Eos組、Mix組、Pau組、對照組FeNO 值的比較

2·4 FeNO 測定值與基本資料相關(guān)性研究 因國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),FeNO 測定值會受到上述基本資料的影響,如年齡、性別、身高、體質(zhì)量等,因此需要對CVA 患者的FeNO 進行進一步分析,分析與年齡、性別、身高、體質(zhì)量以及肺功能等各項指標值間有無相關(guān)性。同時也進一步研究CVA 患者的IL-8濃度是否也會受到上述指標影響。見表4。

表4 CVA 的FeNO 與各指標相關(guān)分析

在對CVA 患者進行相關(guān)性分析時,考慮到FeNO 值是否受一些因素影響,如IL-8 濃度,年齡、身高、體質(zhì)量、Ig E、FEV1%pred、MEF75、MEF50。由表4得出CVA 患者FeNO 值與身高、體質(zhì)量、Ig E、FEV1%pred、MEF75、MEF50 有相關(guān)性(P ＜0.05),與年齡、IL-8濃度無相關(guān)性(P ＞0.05)。因同樣是炎癥指標,我們進一步去探究CVA 患者IL-8是否與上述指標有相關(guān)性,分析后發(fā)現(xiàn)IL-8濃度不受年齡、身高、體質(zhì)量等的影響,與這些指標間無相關(guān)性 (P ＞0.05),IL-8與MEF75呈負相關(guān) (r =-0.225,P ＜0.05),見表5。

表5 CVA 的IL-8與各項指標相關(guān)分析

3 討論

以上研究結(jié)果顯示,無論是Eos組還是Mix組,呼出氣的Fe NO 值均高。這與國內(nèi)研究結(jié)果相似,就是當CVA 患者痰液中Eos增多,或者BALF中Eos增高時,患者FeNO 水平也會相應(yīng)高于健康者[2,13],說明FeNO 值在一定程度上可能能夠協(xié)助以Eos參與為主的氣道炎癥的判斷。研究發(fā)現(xiàn)IL-8在Neu組中和Mix組中濃度較其他幾組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,血清IL-8水平可能會間接反應(yīng)出Neu相關(guān)的氣道炎癥,Hosoki等[5]研究顯示,IL-8濃度與肺泡灌洗液中的Neu百分比顯著相關(guān),Neu的百分比和肺泡灌洗液中IL-8濃度均與FEV1%pred呈負相關(guān),這些研究進一步證明血清IL-8可能與Neu關(guān)系密切。在上述研究中發(fā)現(xiàn)Fe NO 值在Eos組、Mix 組中無差別,而后發(fā)現(xiàn)IL-8濃度在Eos組中低于Mix組,這個研究發(fā)現(xiàn)檢測FeNO 同時聯(lián)合檢測血清IL-8濃度,以后有可能用炎癥指標可以對Neu 組、Eos組及Mix組這3組進行區(qū)分,為不能配合誘導(dǎo)痰操作進行炎癥分型患者提供有一定意義的理論依據(jù),從而也進一步了解Mix組患者產(chǎn)生炎癥的機制,為其進行合理的臨床治療及未來的靶向治療提供依據(jù)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),Fe NO 測定會受到年齡、身高、性別、體質(zhì)量等因素的影響,以上數(shù)據(jù)結(jié)果顯示FeNO 與體質(zhì)量和身高有一定相關(guān)性,這與目前全球關(guān)于FeNO 測定在CVA 中的臨床意義研究結(jié)論是相同的,因此目前FeNO 測定在診斷CVA 中只能起輔助參考作用,但從實驗結(jié)果來看,在鑒別Eos在參與的氣道炎癥時有重要參考價值,同時研究中還發(fā)現(xiàn)CVA 組中IL-8濃度與年齡、身高、體質(zhì)量沒有相關(guān)性,說明血清IL-8濃度可能不受這些因素的影響,在與肺功能指標中進行相關(guān)性分析時,血清IL-8濃度與MEF75呈負相關(guān),與其他指標不相關(guān),也說明這兩項炎癥指標可能與小氣道功能異常有關(guān)聯(lián)。理解Fe NO 和血清IL-8在不同炎癥表型CVA 中的作用機制,能有力的推動免疫干預(yù)和治療不同炎癥CVA 疾病的能力。監(jiān)測FeNO和血清IL-8水平可能成為一種便捷、安全、有效區(qū)分CVA 炎癥狀態(tài)的指標,也可能早期的辨別出CVA 所在的炎癥狀態(tài),從而可以對其進行早期的干預(yù),為早期的防止疾病進展提供可能。由于這兩項炎癥指標在CVA 研究中的初始探索階段,且研究中一些組的樣本量相對較少,結(jié)果可能存在誤差,需要加大樣本量進行更深入的研究,有可能會進一步發(fā)現(xiàn)其在CVA 中的病理生理機制及臨床中的實際意義。并且進一步分析出這兩項炎癥指標在不同炎癥表型中的可能閾值,為CVA 患者的早期診斷、分型及治療提供依據(jù)。Eos是參與CVA 的發(fā)病的主要炎癥細胞之一[2,13-14],在CVA 發(fā)病的病理生理過程中有重要作用。研究表明,不同炎癥表型CVA 患者氣道炎癥中其所含相關(guān)炎癥細胞及炎癥因子比例也不同,因此我們進行一些不同炎癥表型CVA 患者氣道炎癥標志物及血清中相關(guān)炎癥介質(zhì)(Fe NO 測定與IL-8)的比較研究,以探討其在不同炎癥性疾病中的作用機制,為CVA 早期診斷提供理論依據(jù),同時進一步對其所處的炎癥表型進行分析,為不同炎癥表型CVA 患者進行針對性治療提供依據(jù)。即使FeNO 測定代替不了支氣管激發(fā)試驗診斷CVA 金標準的位置,但它可以成為一種具有無創(chuàng)性、便利性、可重復(fù)性及靈敏度高的監(jiān)測氣道炎癥的一種標志物,因為氣道炎癥診斷的金標準依賴于支氣管肺泡灌洗和支氣管內(nèi)膜活檢,但其操作過程中創(chuàng)傷度大,患者配合難度高,費用高及并發(fā)癥危險等問題,一直難以被患者接受。然而Fe NO 測定對技術(shù)人員及受試者要求低、沒有年齡段限制,測試方法通俗易懂,所以FeNO 具體臨床價值值得更加深入的研究和探索。

總之,我們可以認為FeNO、IgE及IL-8參與了不同表型CVA 患者的發(fā)病,參與了CVA 的病理生理過程,目前FeNO 作為一項簡單快捷的測定氣道所處炎癥狀態(tài)的標志物,而廣泛用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)在以Eos浸潤為主氣道炎癥中其血清IgE值也較其他組高,我們聯(lián)合FeNO 及Ig E 進一步去分析其Eos為主患者氣道炎癥機制,有可能發(fā)現(xiàn)其早期炎癥表型,然后進行及時干預(yù)和治療。血清IL-8水平可反映CVA 患者的另一種氣道炎癥狀態(tài),靶向IL-8 可作為新的靶向藥物治療,同時FeNO 也能夠用于監(jiān)測CVA 患者的抗炎治療療效。聯(lián)合所有的檢測指標,進一步研究其在不同炎癥表型CVA 患者的氣道炎癥中的病理生理作用可能會有新的意外的發(fā)現(xiàn),同時更有助于探索新靶點及干預(yù)措施。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突