迷迭香酸對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡、遷移的影響及與自噬的關(guān)系

唐陽芳，陳蕊，廖立冬，王亞玲

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居女性惡性腫瘤的第2位，其發(fā)病率呈逐年升高及年輕化趨勢(shì)，對(duì)婦女健康造成的損害僅次于乳腺癌[1]。目前宮頸癌的治療方法主要是手術(shù)、化療及放療，但手術(shù)適用于惡性腫瘤早期，放、化療的不良反應(yīng)大，復(fù)發(fā)率高，中晚期宮頸癌普遍預(yù)后不良[2-3]。因此，探尋新的治療方法對(duì)于提高患者的生存質(zhì)量意義重大。近年研究表明，天然植物中的多種有效成分具有明顯的抗腫瘤作用，越來越多的中藥成分逐漸成為臨床治療惡性腫瘤的新興藥物[4]。

迷迭香酸是一種在自然界廣泛分布的水溶性多酚羥基化合物，已證實(shí)其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁等多種藥理作用，在多種疾病中展現(xiàn)出治療潛能[5]。近年來，迷迭香酸在腫瘤的防治領(lǐng)域研究較多，但在宮頸癌中的作用報(bào)道較少[6]。細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，自噬失調(diào)與宮頸癌的發(fā)生存在緊密聯(lián)系，但機(jī)制尚未完全明確[7]。本研究以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察迷迭香酸對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡及遷移的影響，探討自噬在其中的作用，旨在為明確迷迭香酸對(duì)宮頸癌中的治療作用及相關(guān)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料迷迭香酸（上海恒斐生物科技有限公司），DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.25%胰酶（美國Gibco公司），細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），Transwell（美國BD公司），兔多抗 LC3-Ⅱ/Ⅰ（14/16 ku，美國Affinity公司），兔單抗Beclin-1（52 ku，英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司），Dako REAL EnVision Detection System（丹麥Dako公司）。臨床宮頸癌及因其他原因切除子宮的宮頸組織來自西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組把解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細(xì)胞，室溫離心（1200r/min，3min），棄上清。用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，吹打混勻，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。每2～3 d傳代換液1次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞用培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按照每孔5×105個(gè)將細(xì)胞接種至6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。然后加入不同濃度的迷迭香酸（0、20、40、80 μmol/L）處理細(xì)胞 48 h。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡用不含EDTA的0.25%胰酶消化上述處理48 h的細(xì)胞，收集細(xì)胞離心（1 500 r/min，5 min），棄上清，加磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)胞。PBS潤洗細(xì)胞2次，離心（1 500 r/min，5 min）。嚴(yán)格按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移取上述處理48 h的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，終止消化后收集細(xì)胞，離心（1 200 r/min，3 min）后去上清，PBS潤洗2次，去除殘余血清。無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/mL，備用。在24孔板中加入800 μL培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及雙抗），放入Transwell小室，在上室分別接入200 μL各組細(xì)胞懸液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。取出Transwell，PBS清洗后用70%冰乙醇溶液固定1 h。0.5%結(jié)晶紫染色，室溫放置20 min，PBS清洗后擦凈上室一側(cè)未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下觀察拍照，在3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)視野下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測宮頸組織中LC3及Beclin-1的表達(dá)取臨床宮頸癌及因其他原因切除子宮的宮頸組織，按照常規(guī)方法制作石蠟切片（脫水，透明，浸蠟，包埋，切片烤片，脫蠟，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶），根據(jù)Dako REALTM En Vision DetectionTM system（Peroxidase/DAB+,K5007）說明書進(jìn)行操作。血清封閉后滴加稀釋的LC3一抗（1∶100），Beclin-1 一抗（1∶100）4 ℃濕盒中孵育過夜，然后加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育20 min，加DAB顯色劑顯色，Harris蘇木素復(fù)染2 min，脫水后封片，在顯微鏡下觀察、采集圖像。每張切片選取3張400倍照片，使用IPP6.0軟件對(duì)照片進(jìn)行光密度分析，計(jì)算平均光密度。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測自噬蛋白表達(dá)取上述處理48 h的細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度，取40 μg等量蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液室溫封閉2 h，加入一抗LC3-Ⅰ（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、Beclin-1（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）。4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）37℃搖床孵育2 h，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 迷迭香酸對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（0 μmol/L迷迭香酸組）相比，處理細(xì)胞48 h后，各濃度迷迭香酸組HeLa細(xì)胞有不同程度的凋亡，見圖1。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況，0、20、40、80 μmol/L 迷迭香酸組的細(xì)胞凋亡率分別為（4.62±0.74）%、（9.80±0.14）%、（14.88±0.82）%、（23.74±1.43）%。4組的細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=241.70，P＜0.05），且細(xì)胞凋亡率隨著迷迭香酸濃度的升高而增加，不同濃度組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 2（見后插二）。

圖1 顯微鏡下觀察各組HeLa細(xì)胞形態(tài)（Bar=100 μm）

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組HeLa細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.2 迷迭香酸對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0、20、40、80 μmol/L 迷迭香酸組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為（105.33±5.03）個(gè)、（94.33±2.89）個(gè)、（71.67±4.93）個(gè)、（56.33±4.16）個(gè)。4 組 HeLa細(xì)胞遷移數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=77.63，P＜0.05），且細(xì)胞遷移數(shù)隨著迷迭香酸濃度的升高而減少，不同濃度組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 3（見后插二）。

圖3 Transwell檢測各組HeLa細(xì)胞遷移結(jié)果（Bar=100 μm）

2.3 迷迭香酸對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組織和宮頸癌組織中LC3的表達(dá)（平均光密度）分別為0.019 6±0.001 3和0.002 7±0.000 6，Beclin-1的表達(dá)（平均光密度）分別為 0.035 2±0.003 6 和 0.004 6±0.000 9。宮頸癌組織中LC3及Beclin-1的表達(dá)均低于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LC3：t=28.00，P＜0.05；Beclin-1：t=19.99，P＜0.05），見圖4（見后插二）。以上結(jié)果提示自噬水平下調(diào)與宮頸癌的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)。

圖4 免疫組織化學(xué)法檢測宮頸組織中自噬蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)（n=6，DAB法×400）

進(jìn)一步采用Western blotting法檢測自噬蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，0、20、40、80 μmol/L 迷迭香酸組的 LC3-Ⅱ/Ⅰ比值分別為 0.20±0.01、0.44±0.02、0.69±0.04 和0.79±0.04，Beclin-1 的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.10±0.02、0.18±0.03、0.42±0.03 和 0.63±0.04。4 組 HeLa細(xì)胞表達(dá)自噬蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（LC3：n=3，F(xiàn)=240.83，P＜0.05；Beclin-1：n=3，F(xiàn)=154.72，P＜0.05），且這兩種蛋白的表達(dá)隨著迷迭香酸濃度的升高而增加，不同濃度組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5。

圖5 Western blotting法檢測HeLa細(xì)胞表達(dá)自噬蛋白LC3和Beclin-1

3 討論

宮頸癌是世界范圍內(nèi)最為常見的一種婦科惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約52萬，死亡病例約27萬。在發(fā)展中國家，宮頸癌的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)，占全球?qū)m頸癌發(fā)病的80%，嚴(yán)重威脅著育齡婦女的健康和生命[8-9]。近年來對(duì)宮頸癌的研究不斷深入，但其具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前，中晚期宮頸癌仍多采取聯(lián)合放療和化療的綜合治療，化療在宮頸癌高危病例和晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的治療中是必不可少的重要手段，但其不良反應(yīng)及耐藥性也嚴(yán)重影響治療效果[10]。因此，目前迫切需要深入探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，并尋找有潛力的、不良反應(yīng)小的新藥，為宮頸癌的治療提供新思路。

迷迭香酸是一些中草藥的主要活性成分，如迷迭香、紫蘇、夏枯草、滇丹參、薄荷、腎茶、牛至等中藥的有效成分，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中[11]。迷迭香酸已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域，而在大力發(fā)展民族醫(yī)藥研究的今天，迷迭香酸的藥理作用受到了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。大量醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等多種藥理作用，其各種藥理學(xué)活性在體內(nèi)相互作用，共同促進(jìn)疾病的治療[5，12]。在腫瘤治療方面，大量研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，如調(diào)節(jié)致癌物質(zhì)的代謝，抗氧化和抗炎，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管形成、腫瘤細(xì)胞遷移和侵入，對(duì)化療和放療增敏等，對(duì)肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤均有治療作用[6，13]。

目前，迷迭香酸在宮頸癌中的作用研究報(bào)道較少，一些研究提示迷迭香酸具有治療宮頸癌的生物學(xué)活性及降低化療藥耐藥性的潛能。Yoshida等[14]的研究證實(shí)迷迭香酸對(duì)HeLa細(xì)胞增殖有顯著抑制效果。Elansary等[15]對(duì)埃及的草藥湯茶研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分迷迭香酸可顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且凋亡相關(guān)基因p21的表達(dá)顯著上調(diào)。此外，Nabekura等[16]發(fā)現(xiàn)，迷迭香植物素可顯著抑制宮頸癌KB-C2細(xì)胞的主動(dòng)外排系統(tǒng)，顯著升高細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，從而降低細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。凋亡是研究最為廣泛的程序性細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是目前臨床化療藥物抗腫瘤作用的主要機(jī)制。本研究觀察了不同濃度的迷迭香酸作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞后凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率隨著迷迭香酸藥物濃度的升高而增加，表明迷迭香酸可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[15]一致。侵襲和遷移是所有惡性腫瘤的特征性生物學(xué)行為，密切關(guān)系著疾病的發(fā)展和預(yù)后。本研究還檢測了HeLa細(xì)胞的遷移情況，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸可顯著抑制細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性。

自噬普遍存在于真核細(xì)胞中，是細(xì)胞利用溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器等，重新利用降解物質(zhì)及胞內(nèi)有害物質(zhì)的過程，對(duì)于保持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定和平衡十分重要。近年研究證實(shí)，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、藥物抵抗等方面發(fā)揮著重要作用[17-18]。自噬失調(diào)與宮頸癌的產(chǎn)生存在緊密聯(lián)系，通過利用宮頸癌發(fā)展進(jìn)程中自噬作用及分子機(jī)制研究，可為宮頸癌的藥物標(biāo)靶和治療方式作重要借鑒[7]。細(xì)胞自噬及凋亡分別被稱為細(xì)胞的Ⅱ型和Ⅰ型程序性死亡，兩者在特定的條件下可以轉(zhuǎn)化，并可通過重要的生長因子和關(guān)鍵的細(xì)胞反應(yīng)與其他的凋亡啟動(dòng)通路連接[19]。目前越來越多的研究表明，中藥有效成分能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬，在直接和輔助抗腫瘤方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用[20]。鑒于自噬和凋亡在惡性腫瘤中的作用，本研究進(jìn)一步探討了迷迭香酸促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡的機(jī)制。LC3是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自噬體標(biāo)記蛋白，包括LC3A、LC3B、LC3C 3種亞型，每種亞型又分為LC3-Ⅰ（胞漿型）、LC3-Ⅱ（膜型）2種形式。當(dāng)自噬形成時(shí)，LC3-Ⅰ則酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值常被用作自噬體形成的檢測指標(biāo)。Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)的一種與自噬相關(guān)的基因，也被公認(rèn)為可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。近年研究證實(shí)，LC3和Beclin-1的表達(dá)下調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，人宮頸癌組織中LC3和Beclin-1的表達(dá)低于正常宮頸組織，而迷迭香酸可明顯促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞中這2種自噬蛋白的表達(dá)，與同類中藥紫草素的作用相似[23]。

中藥在抗腫瘤治療上擁有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其毒副作用低，不良反應(yīng)少，還可減輕放化療不良反應(yīng)等。隨著研究的深入，其優(yōu)勢(shì)及作用機(jī)制必將進(jìn)一步闡明。自噬的過程是高度保守的，當(dāng)自噬與疾病相關(guān)聯(lián)時(shí)會(huì)產(chǎn)生多樣化的結(jié)果，而自噬又與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，因此自噬調(diào)控疾病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，具有極高的研究價(jià)值。本研究顯示迷迭香酸在體外能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移，呈濃度依賴性，且作用可能與誘導(dǎo)自噬有關(guān)，但其具體機(jī)制及體內(nèi)效果尚待進(jìn)一步研究。此外，由于科研經(jīng)費(fèi)所限，未進(jìn)行HPV16陽性、HPV陰性宮頸癌細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)和在體研究，對(duì)于迷迭香酸的效應(yīng)，還需采用其他宮頸癌細(xì)胞株，如C33A及Siha細(xì)胞以及相應(yīng)動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。