醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制與定值研究*

謝逸菲，張麗，張寶喜，杜冠華，呂揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所1.藥物晶型研究中心、晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

醋酸甲羥孕酮屬于人工合成孕激素類藥物，大劑量時(shí)能夠通過抑制卵泡發(fā)育和阻止排卵方式減輕子宮內(nèi)膜異位癥所致疼痛，小劑量時(shí)能夠治療非典型子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌及腎癌等疾病[1-3]。此外，該藥能夠通過抑制體內(nèi)性激素水平和減少性腺激素釋放方式達(dá)到女性避孕目的，并可用于制作長(zhǎng)效避孕針[4]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是指用于藥物含量測(cè)定、鑒別以及進(jìn)行純度試驗(yàn)的具特性值的物質(zhì)，在研制過程中通常采用多種方法進(jìn)行聯(lián)合定值，方法間能夠相互補(bǔ)充，使數(shù)據(jù)更加科學(xué)準(zhǔn)確，并通過不間斷的溯源鏈與國際單位進(jìn)行統(tǒng)一，以確保全球量值的準(zhǔn)確和一致[5-9]。

目前，我國避孕節(jié)育類藥物化學(xué)計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尚存在短缺現(xiàn)象，通過查詢國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息服務(wù)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫，筆者未發(fā)現(xiàn)醋酸甲羥孕酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)信息。本研究采用質(zhì)量平衡法(mass balance，MB)與差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)兩種不同原理的方法研制醋酸甲羥孕酮化學(xué)計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可為藥物質(zhì)控及評(píng)價(jià)提供可溯源性標(biāo)準(zhǔn)，也是將藥物推向國際市場(chǎng)的有力支撐，并且對(duì)于我國避孕節(jié)育類藥物及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制具有重要的科學(xué)意義[10-12]。

1 儀器與試藥

1.1儀器及條件 Mettler Toledo DSC 1型差示掃描量熱儀(Mettler Toledo公司，瑞士)，標(biāo)準(zhǔn)40 μL鋁(Al)坩堝，以0.5 ℃·min-1速度升溫，升溫區(qū)間為203～210 ℃，氮?dú)?N2)流速50 mL·min-1；Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，DAD檢測(cè)器，Agilent chemstation工作站，Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流速為1.0 mL·min-1，在波長(zhǎng)254 nm條件下，流動(dòng)相選擇水：甲醇=25：75，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為30 ℃；Mettler MX5型分析用天平(瑞士Mettler Toledo公司)，感量為1 μg(0≤m≤5100 mg)；AV500-III磁共振波譜儀(Bruker公司，德國)；Mettler Toledo V20型卡爾·費(fèi)休滴定儀(瑞士Mettler Toledo公司)；SX2.5-10型箱式電阻爐(上海樹立儀器儀表有限公司)。

1.2藥品與試劑 醋酸甲羥孕酮原料藥(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號(hào)： 20170129，含量：98%)；國家二級(jí)錫標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：熔點(diǎn)(231.81±0.06) ℃[國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，GBW(E)130183]；甲醇(Fisher Chemical公司，美國，色譜純)；實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Millipore純水儀純化制備。

1.3純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的制備 醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。醋酸甲羥孕酮樣品經(jīng)純化、過篩孔內(nèi)徑(150±6.6) μm(100目)篩，采用2 mL棕色安瓿瓶熔封，每瓶50 mg進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品分裝，共分裝樣品600 瓶。

1.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)結(jié)構(gòu)確證 采用質(zhì)譜、磁共振波譜、紅外光譜、熔點(diǎn)分析對(duì)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。①質(zhì)譜結(jié)果： ESI-MS [M+Na]+m/z 409.2， [M+H]+m/z 387.2；②核磁結(jié)果：1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz) δppm：5.6(1H，s，4-H)，2.75(1H， m，6-H)，2.05(3H，s，21-COCH3)，1.95(3H，s，23-OCOCH3)，1.18(3H，s，19-CH3)， 1.01(3H，d，J=6.5Hz，24-CH3)，0.95(m，1H，9-H)，0.66(3H，s，18-CH3)；13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz) δppm：203.4(C-20)，198.10(C-3)，173.61(C-5)， 170.57(C-22)，120.41(C-4)，95.80(C-17)，52.85(C-9)，50.48(C-14)，46.25(C-13)， 39.16(C-7)，38.47(C-10)，35.26(C-1)，34.64(C-8)，33.38(C-2)，32.96(C-6)， 30.43(C-12)，29.67(C-21)，25.97(C-16)，23.31(C-15)，20.89(C-23)，20.30(C-11)， 18.12(C-24)，17.80(C-19)，13.90(C-18)；③紅外結(jié)果：IR 2947，2911，2869 cm-1處為亞甲基的碳?xì)渖炜s振動(dòng)峰，1730，1673 cm-1處為內(nèi)酰胺及酯基的羰基伸縮振動(dòng)峰，1363 cm-1為甲基酮對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；④熔點(diǎn)結(jié)果：DSC吸熱峰值為207.42 ℃。以上數(shù)據(jù)與《化學(xué)藥品對(duì)照品圖譜集》及《中華人民共和國藥典》2015年版(二部)中醋酸甲羥孕酮參考值基本一致[13-14]，綜合確定該化合物為醋酸甲羥孕酮，分子式為C24H34O4，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 醋酸甲羥孕酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 方法學(xué)考察

本研究聯(lián)合DSC法與MB法兩種不同原理的方法研制醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并進(jìn)行定值研究。首先通過方法學(xué)考察，尋找最優(yōu)定值條件，通過準(zhǔn)確度評(píng)估，以減少定值過程中不同方法引入的不確定度。

2.1DSC法 依據(jù)范霍夫方程(Van’t Hoff Equation)進(jìn)行DSC法純度測(cè)定，通過熱焓與溫度變化過程中的焓變，建立數(shù)學(xué)模型，計(jì)算雜質(zhì)含量并獲得樣品純度。

式中：x為純物質(zhì)的摩爾百分比，T0為純物質(zhì)熔點(diǎn)值，Tm為物質(zhì)真實(shí)熔點(diǎn)值，R表示氣體常數(shù)。在恒定的升溫速率下，通過測(cè)定物質(zhì)的熔融DSC曲線，獲得物質(zhì)的摩爾熔融焓變，通過擬合計(jì)算，最終可以獲得被測(cè)物的純度值。

2.1.1升溫速率考察 考慮到DSC分析過程中升溫速率對(duì)化學(xué)純度測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，考察升溫速率為0.3，0.5，0.7 ℃·min-1時(shí)的3種不同升溫速率對(duì)化學(xué)純度分析結(jié)果的影響，經(jīng)分析，純度結(jié)果分別為：99.51%，99.50%，99.51%，分析結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性。故選用0.5 ℃·min-1作為DSC定值分析的升溫速率。

2.1.2稱樣量考察 精密稱取7份質(zhì)量為1.25，1.65，2.14，2.54，2.88，3.36，3.98 mg的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品，吸熱峰面積結(jié)果依次為108.24，139.57，182.43，218.96，249.85，292.64，353.58 mJ。獲得線性回歸方程：Y=89.970 5X-8.029 2(X為純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品質(zhì)量，Y為吸熱峰面積)，相關(guān)系數(shù)R2為0.9991(n=7)，線性關(guān)系良好，符合純度定值方法的要求。

2.1.3精密度考察 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品約3 mg，共計(jì)6份，獲得吸熱峰面積值，經(jīng)結(jié)果分析，RSD值為1.65%，小于2.0%，符合方法精密度要求。

2.2MB法 MB法是建立在高效液相色譜面積歸一化法的基礎(chǔ)上，通過扣除標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品中的雜質(zhì)含量(包括：水分I水分、熾灼殘?jiān)麵熾灼殘?jiān)?、溶劑殘留I溶劑殘留和有機(jī)雜質(zhì)I有機(jī)雜質(zhì))獲得的物質(zhì)純度值，因此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物純度P物質(zhì)純度的計(jì)算公式為：P物質(zhì)純度=(100%-I有機(jī)雜質(zhì))×(100%-I水分-I熾灼殘?jiān)?I溶劑殘留)×100%，這種方法能夠避免在高效液相色譜中無法檢出的水分、無機(jī)物、溶劑殘留等雜質(zhì)對(duì)純度的影響。

2.2.1供試品溶液配制 精密稱取醋酸甲羥孕酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品5 mg，選擇甲醇作為溶劑，在50 mL量瓶定容，得到供試品溶液，濃度為100 μg·mL-1。

2.2.2高效液相色譜條件優(yōu)化 通過對(duì)不同型號(hào)色譜柱、流動(dòng)相種類、流動(dòng)相比例以及檢測(cè)波長(zhǎng)等因素進(jìn)行考察。最終選用Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱，在波長(zhǎng)254 nm條件下，流動(dòng)相選擇水：甲醇=25：75進(jìn)行純度測(cè)定。

2.2.3雜質(zhì)含量的測(cè)定 對(duì)MB法中無法直接通過高效液相色譜法獲得的雜質(zhì)含量進(jìn)行考察。①水分雜質(zhì)含量：采用卡爾·費(fèi)休滴定儀測(cè)定，樣品中水分含量平均值為(0.266 4±0.004 50)%(n=10)；②熾灼殘?jiān)浚簻y(cè)定樣品中熾灼殘?jiān)科骄禐?0.031 1±0.017 7)%(n=10)；③溶劑殘留含量：采用氣相色譜法對(duì)制備過程中常用的甲醇、乙醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯5種溶劑進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)線性回歸方程計(jì)算溶劑殘留總含量為(0.028 0±0.021 0)%(n=10)。

3 均勻性與穩(wěn)定性考察

根據(jù)JJG1006-1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》與JJF1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》中的技術(shù)要求，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品的均勻性與短期、長(zhǎng)期穩(wěn)定性進(jìn)行考察，獲得的均勻性結(jié)果通過單因素方差分析，穩(wěn)定性經(jīng)t檢驗(yàn)，最終確定該物質(zhì)是否符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)要求。

3.1均勻性考察 隨機(jī)抽取25瓶已封裝樣品，每瓶取樣3份，采用MB法進(jìn)行均勻性考察。檢查結(jié)果經(jīng)單因素方差分析：組間平均方差為9.72×10-9，組內(nèi)平均方差為7.07×10-9，F(xiàn)=1.38，小于臨界值F0.05(24，50)=2.04。結(jié)果說明醋酸甲羥孕酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品符合樣品均勻性要求。

3.2穩(wěn)定性考察 將封裝后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物置于高溫(60 ℃)、光照[強(qiáng)度(4500±500) lx]條件下，于0，5，10，15，20 d取樣，采用MB法進(jìn)行穩(wěn)定性考察。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，表明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物能夠滿足短期運(yùn)輸?shù)姆€(wěn)定性要求。將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品置于常溫(20 ℃)條件下，于0，1，2，4，6，12個(gè)月取樣，進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。通過線性擬合分析，直線斜率不顯著，表明醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物符合有效期內(nèi)儲(chǔ)存的穩(wěn)定性要求。

4 DSC法與MB法聯(lián)合定值及不確定度評(píng)定

本研究選取DSC法與MB法聯(lián)合進(jìn)行醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物特性值定值分析，能夠避免單一方法的局限性，使候選物樣品定值結(jié)果的準(zhǔn)確性得到提高，兩種方法在定值過程中存在多種因素引入的不確定度。

4.1DSC法定值及不確定度影響因素 精密稱取10份樣品，采用DSC法測(cè)定其純度值(表1)，通過Grubbs檢驗(yàn)剔除可疑值，獲得DSC法定值結(jié)果。

表1 DSC法定值結(jié)果

4.2MB法定值及不確定度影響因素分析 精密稱取10份醋酸甲羥孕酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品，經(jīng)MB法測(cè)定純度標(biāo)準(zhǔn)值P(MB)，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 MB法定值結(jié)果

DSC法與MB法不確定度影響因素與結(jié)果見表3。

4.3MB法與DSC法聯(lián)合定值 采用MB法與DSC法對(duì)醋酸甲羥孕酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合定值，通過t檢驗(yàn)方法對(duì)兩種不同原理定值的結(jié)果進(jìn)行比較，并對(duì)結(jié)果的一致性進(jìn)行考察。經(jīng)t檢驗(yàn)，兩種方法獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果符合一致性要求。因此，醋酸甲羥孕酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物樣品的純度值為兩種方法的算術(shù)平均值，即99.54%。

表3 DSC法與MB法不確定度影響因素與結(jié)果

5 討論

采用MB法與DSC法2種不同原理的方法對(duì)醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物進(jìn)行純度特性值和不確定度值標(biāo)定。在特性值測(cè)定過程中綜合考慮對(duì)醋酸甲羥孕酮純度準(zhǔn)確性及不確定度產(chǎn)生影響的多種因素，最終醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果為(99.5±0.5)%(k=2，P=0.95)，滿足國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求的均勻性、穩(wěn)定性、量值溯源性及量值傳遞性的要求，并已取得國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局資格認(rèn)證，國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書編號(hào)為GBW 09592。醋酸甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制填補(bǔ)了我國在避孕節(jié)育類藥物化學(xué)計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面的短缺，為該藥物的科學(xué)儲(chǔ)存、運(yùn)輸、質(zhì)量控制以及計(jì)量監(jiān)控等提供了更有效的物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。