鐵對(duì)擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)和角星鼓藻(Staurastrum spp.)季節(jié)動(dòng)態(tài)和生長(zhǎng)的影響
——以廣東大沙河水庫(kù)為例*

譚 琳，胡潤(rùn)鵬，鐘慧君，肖利娟,2**，雷臘梅，韓博平

(1:暨南大學(xué)水生生物研究中心，廣州 510632) (2:廣東省水庫(kù)藍(lán)藻水華防治中心，廣州 510632)

擬柱孢藻(Cylindrospermopsisraciborskii)和角星鼓藻(Staurastrumspp.)是熱帶和亞熱帶水體的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，2個(gè)種類(lèi)存在演替現(xiàn)象. 例如，Ndebele-Murisa等對(duì)非洲湖泊研究的綜述中指出，絲狀藍(lán)藻(擬柱孢藻、長(zhǎng)孢藻、假魚(yú)腥藻)常在雨季開(kāi)始之前成為浮游植物群落的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，鼓藻目種類(lèi)(鼓藻、角星鼓藻)常在雨季常成為優(yōu)勢(shì)種類(lèi)[1]；Barbosa和Padisk在巴西多座湖泊中發(fā)現(xiàn)角星鼓藻在分層時(shí)期成為浮游植物群落中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種，擬柱孢藻在去分層時(shí)期常成為優(yōu)勢(shì)種[2].對(duì)海南的赤田水庫(kù)、廣東的大沙河、高州等多座水庫(kù)的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，擬柱孢藻是這些水庫(kù)的優(yōu)勢(shì)種，但通常在水體去分層時(shí)期形成優(yōu)勢(shì)，而在水體強(qiáng)分層時(shí)期浮游植物群落以角星鼓藻為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種[3-5]. 擬柱孢藻是熱帶亞熱帶水庫(kù)中常見(jiàn)的水華藍(lán)藻，具有產(chǎn)毒能力，已有研究表明擬柱孢藻對(duì)常量元素(N和P)具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力，尤其能適應(yīng)低磷環(huán)境[6]. 角星鼓藻為單細(xì)胞綠藻，細(xì)胞個(gè)體大，能耐受資源脅迫，對(duì)低磷環(huán)境有很好的適應(yīng)性[3-4]. 已有的研究主要集中在大量元素對(duì)2種藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響上，對(duì)微量元素的影響尚缺乏充分的認(rèn)識(shí)，而基于常量元素的競(jìng)爭(zhēng)能力能夠解釋擬柱孢藻占優(yōu)勢(shì)卻不能很好地解釋其相對(duì)生物量受到限制.

鐵是浮游植物生長(zhǎng)需求最大的微量元素，主要分布于浮游植物細(xì)胞的光合系統(tǒng)中[7-10]. 光合系統(tǒng)中鐵含量占整個(gè)細(xì)胞總鐵含量的50%～90%，浮游植物鐵需求的種間差異主要由光合系統(tǒng)PSI(含12個(gè)Fe原子)和PSII(含2～3個(gè)Fe原子)的比例決定[7]. 藍(lán)藻比綠藻具有更高的PSI∶PSII比，因此鐵需求更高[8-10]. 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于小球藻、柵藻等綠藻，微囊藻、顫藻等藍(lán)藻的生長(zhǎng)更容易受鐵濃度影響，在低鐵濃度下的比生長(zhǎng)速率明顯降低[11-13]. 在鐵限制條件下，浮游植物能產(chǎn)生高效鰲合鐵離子的鐵載體，同時(shí)在細(xì)胞外膜上產(chǎn)生鐵受體蛋白，特異性識(shí)別鐵離子—鐵載體復(fù)合物，并將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)從而緩解鐵限制，因此鐵載體產(chǎn)量常用于指示細(xì)胞受到鐵限制狀態(tài)[14-16].

在自然水體中，鐵是否能成為限制性資源，不僅取決于浮游植物的鐵需求，還取決于水體中鐵的生物可利用性[17-19]. 浮游植物生長(zhǎng)主要在真光層，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，熱帶水庫(kù)真光層中總鐵濃度常低于0.5 mg/L，溶解性鐵濃度常低于0.1 mg/L[20]. Morton等[21]提出，水體中總鐵濃度低于0.1 mg/L時(shí)，藍(lán)藻生長(zhǎng)受到限制. 此外，熱帶水庫(kù)中磷主要以有機(jī)顆粒態(tài)形式存在，溶解性活性磷濃度普遍低于0.01 mg/L，有機(jī)磷的利用能力對(duì)維持浮游植物生長(zhǎng)有重要的作用[22]. 在無(wú)機(jī)磷不足的環(huán)境中，通過(guò)產(chǎn)生堿性磷酸酶水解有機(jī)磷是浮游植物利用有機(jī)磷源的主要途徑，這一過(guò)程中的能量傳遞、氮的利用都需要鐵的參與[7,23]. 基于藍(lán)藻和綠藻的鐵需求差異，我們推測(cè)在熱帶水庫(kù)鐵濃度范圍內(nèi)，鐵對(duì)擬柱孢藻和角星鼓藻生長(zhǎng)的限制性作用存在差異，尤其在無(wú)機(jī)磷缺乏條件下，細(xì)胞鐵需求可能增加進(jìn)而導(dǎo)致鐵限制作用增強(qiáng).

為了驗(yàn)證以上推測(cè)，本文選擇具有擬柱孢藻和角星鼓藻季節(jié)演替現(xiàn)象的典型水庫(kù)(大沙河水庫(kù))開(kāi)展野外調(diào)查，分析鐵在擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對(duì)生物量季節(jié)動(dòng)態(tài)中的作用；并選取分離自熱帶水庫(kù)的擬柱孢藻(C.raciborskii, N8)和熱帶亞熱帶常見(jiàn)角星鼓藻(Staurastrumsp., FACHB-1449)為實(shí)驗(yàn)藻株，分別以無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷為磷源，以熱帶水庫(kù)湖上層鐵濃度值和Morton等[21]提出的藍(lán)藻生長(zhǎng)受限制的鐵濃度閾值為參考依據(jù)，設(shè)置3個(gè)鐵濃度，開(kāi)展鐵對(duì)2種藻生長(zhǎng)作用的比較研究. 結(jié)合野外調(diào)查和室內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析鐵對(duì)擬柱孢藻和角星鼓藻生物量季節(jié)動(dòng)態(tài)和生長(zhǎng)的作用，為進(jìn)一步闡明熱帶水庫(kù)擬柱孢藻和角星鼓藻的演替機(jī)制以及為擬柱孢藻水華的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

圖1 大沙河水庫(kù)采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites in Dashahe Reservoir

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查

1.1.1 水庫(kù)概況 大沙河水庫(kù)(22°32′N(xiāo)，112°30′E)位于廣東省開(kāi)平市，是開(kāi)平市區(qū)重要的供水水源地. 水庫(kù)流域面積217 km2，總庫(kù)容2.58×105m3，正常庫(kù)容1.57×103m3，最高水位34 m(珠基)，有效最低水位27.4 m(珠基).

1.1.2 采樣點(diǎn)設(shè)置與采樣頻率 在大沙河水庫(kù)敞水區(qū)設(shè)置采樣點(diǎn)(圖1)，從2016年8月-2017年8月，每月采樣1次.

用采水器采集水樣后，取1 L水樣現(xiàn)場(chǎng)加入1%魯哥試劑，帶回實(shí)驗(yàn)室，取10 mL水樣，采用倒置顯微鏡鏡檢法對(duì)浮游植物進(jìn)行種類(lèi)鑒定和計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)400個(gè)藻類(lèi)個(gè)體.

1.2 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 藻種來(lái)源與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用藻種擬柱孢藻(C.raciborskii, N8)分離自廣東省江門(mén)市鎮(zhèn)海水庫(kù)；角星鼓藻(Staurastrumsp., FACHB-1449)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，分離自一座亞熱帶富營(yíng)養(yǎng)化水庫(kù)——湖北赤壁陸水湖水庫(kù)，為熱帶亞熱帶常見(jiàn)種. 將N8和FACHB-1449置于BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25.5±1℃，光強(qiáng)35 μmol/(m2·s)，光照周期12 h∶12 h.

1.2.2 培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)(Fe3+濃度為0.689 mg/L)，以檸檬酸鐵銨為鐵源，依據(jù)熱帶水庫(kù)湖上層的鐵濃度范圍(<0.3 mg/L)[20]，共設(shè)置3種鐵濃度實(shí)驗(yàn)組：0.689 mg/L(IPHFe，即BG11對(duì)照組)，0.29 mg/L(IPMFe)，0.029 mg/L(IPLFe)；將BG11磷源替換為有機(jī)磷(OP, D-葡萄糖-6-磷酸)，以檸檬酸鐵銨為鐵源設(shè)置有機(jī)磷源條件下3種鐵濃度實(shí)驗(yàn)組：0.689 mg/L(OPHFe)，0.29 mg/L(OPMFe)，0.029 mg/L(OPLFe). 每個(gè)藻株各有6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(IPLFe、IPMFe、IPHFe、OPLFe、OPMFe和OPHFe)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行.

每天下午5點(diǎn)測(cè)定680 nm處的吸光值，確定培養(yǎng)藻細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期之后，用離心法收集藻細(xì)胞，無(wú)菌水洗滌3次后將藻細(xì)胞接種至不含鐵、磷的BG11培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)3天，饑餓處理后的藻液分別接種至各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中，接種葉綠素a的初始濃度為17.90±1.95 μg/L. 培養(yǎng)條件為：溫度25.5±1℃，光強(qiáng)35 μmol/(m2·s)，光照周期12 h∶12 h. 每隔1天或3天于上午11點(diǎn)取樣，測(cè)定葉綠素a濃度、堿性磷酸酶活性和鐵載體產(chǎn)量，取1 mL藻液加魯哥試劑保存用于細(xì)胞計(jì)數(shù).

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 1)生長(zhǎng)曲線和比生長(zhǎng)速率的計(jì)算 取樣后遮光處理20 min，用TrilogyTMFluorpmeter熒光儀測(cè)定藻液葉綠素a熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成葉綠素a濃度(Chl.a濃度)[24]；取100 μL藻液于生物計(jì)數(shù)框中，采用視野法計(jì)數(shù)，并計(jì)算藻細(xì)胞密度. 比生長(zhǎng)速率計(jì)算公式為[25]：

(1)

式中，C1和C2分別代表時(shí)間t1和t2時(shí)的細(xì)胞密度(cells/L).

2)鐵載體的測(cè)定 參考Schwyn等[27-28]的測(cè)定方法，藻液離心后取上清液(s)1 mL，加入1 mL CAS分析溶液和20 μL 0.2 mol/L 5-磺基水楊酸，搖勻，以不含鐵的BG11培養(yǎng)基作對(duì)照(r). 將樣品(s)和對(duì)照(r)與CAS的混合液在室溫下避光放置1 h后，于630 nm處測(cè)定吸光值(A). 鐵載體產(chǎn)量的計(jì)算公式為：

鐵載體產(chǎn)量=(Ar-As)/Ar

(2)

鐵載體產(chǎn)量低于0.01時(shí)被認(rèn)為是無(wú)鐵載體產(chǎn)生[29]，以單位濃度Chl.a的鐵載體產(chǎn)量用于數(shù)據(jù)分析.

3)堿性磷酸酶活性的測(cè)定 堿性磷酸酶活性測(cè)定方法為分光光度比色法[26]. 參考?jí)A性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)的步驟，采用酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)定對(duì)硝基苯酚的吸光值，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)每微克葉綠素a產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚的量，以此表示細(xì)胞堿性磷酸酶活性(μmol/(μg Chl.a)·min).

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

水庫(kù)中擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對(duì)生物量與環(huán)境因子的關(guān)系，采用多元逐步回歸方法分析各因子對(duì)生物量和相對(duì)生物量變化的解釋量及回歸關(guān)系.

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，比較相同磷源條件下3個(gè)鐵濃度實(shí)驗(yàn)組的Chl.a濃度、藻細(xì)胞密度以及比生長(zhǎng)速率的差異；采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，分析磷源、鐵濃度以及兩者交互作用對(duì)比生長(zhǎng)速率、堿性磷酸酶活性和鐵載體產(chǎn)量的影響. 顯著性水平均設(shè)定為P<0.05.

2 結(jié)果

2.1 水庫(kù)中擬柱孢藻和角星鼓藻的季節(jié)動(dòng)態(tài)

2.1.1 生物量和相對(duì)生物量的季節(jié)動(dòng)態(tài) 調(diào)查期間，擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對(duì)生物量均有明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài). 擬柱孢藻的生物量最大值為5.9 mg/L，相對(duì)生物量最大值為70%，出現(xiàn)在2017年的8月；角星鼓藻生物量最大值為2.6 mg/L，相對(duì)生物量最大值為66%，出現(xiàn)在2016年8月. 2016年8-10月期間，發(fā)生擬柱孢藻取代角星鼓藻的演替現(xiàn)象：擬柱孢藻的相對(duì)生物量由8月份的10%上升至9月份的35%，同時(shí)角星鼓藻的相對(duì)生物量由8月的66%逐漸下降至11月的0.5%. 2017年3-8月期間，擬柱孢藻的生物量和相對(duì)生物量逐漸上升，到8月份生物量達(dá)到5.9 mg/L，相對(duì)生物量達(dá)到70%，成為浮游植物群落中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種類(lèi)；角星鼓藻生物量在7-8月期間明顯升高，8月份生物量達(dá)到1.1 mg/L，相對(duì)生物量達(dá)到12.4%，與擬柱孢藻共同占浮游植物總生物量的82%.

圖2 擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對(duì)生物量的季節(jié)動(dòng)態(tài)Fig.2 Seasonal dynamics of biomass and relative biomass of C. raciborskii and Staurastrum spp.

2.1.2 生物量和相對(duì)生物量與環(huán)境因子的回歸關(guān)系 調(diào)查期間，水體溫度在17～32℃之間，pH值在7.6～9.1之間，透明度在0.8～1.4 m之間；TP濃度在0.021～0.047 mg/L之間，TN濃度在0.72～1.7 mg/L之間，TN∶TP質(zhì)量比在25～72之間；溶解性無(wú)機(jī)氮(DIN)濃度在0.18～0.92 mg/L之間，正磷酸鹽濃度在0.004 mg/L以下；總鐵濃度在0.067～0.26 mg/L之間，溶解性鐵濃度在0.049 mg/L以下.

多元逐步回歸分析表明，擬柱孢藻和角星鼓藻生物量均與水溫、pH值和SD沒(méi)有顯著的線性回歸關(guān)系；3種營(yíng)養(yǎng)元素(N、P、Fe)中，只有溶解性氮和溶解性鐵對(duì)擬柱孢藻的生物量和相對(duì)生物量變化有顯著的解釋性作用(P<0.001)，擬柱孢藻的生物量與2個(gè)因子存在顯著的線性回歸關(guān)系(P<0.001)；角星鼓藻的生物量只與溶解性氮有顯著的線性回歸關(guān)系(P<0.001，表1).

表1 擬柱孢藻和角星鼓藻生物量的多元逐步回歸分析

*P<0.05，**P<0.01.

2.2 擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的生長(zhǎng)比較

2.2.1 生長(zhǎng)曲線 擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的Chl.a濃度和細(xì)胞密度均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖3). 無(wú)機(jī)磷源條件下，擬柱孢藻N8的Chl.a濃度和細(xì)胞密度均隨鐵濃度降低而顯著降低(One-way ANOVA,P<0.05). 有機(jī)磷條件下，OPLFe組擬柱孢藻N8的Chl.a濃度和細(xì)胞密度顯著低于OPHFe組和OPMFe組(One-way ANOVA,P< 0.05)，但OPHFe組和OPMFe組之間沒(méi)有顯著差異. 培養(yǎng)期間，角星鼓藻FACHB-1449的Chl.a濃度差異和藻細(xì)胞密度差異均不顯著(One-way ANOVA,P>0.05).

圖3 擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的生長(zhǎng)曲線 (擬柱孢藻N8的Chl.a濃度(a)和細(xì)胞密度(b)；角星鼓藻FACHB-1449的Chl.a濃度(c)和細(xì)胞密度(d))Fig.3 The growth curve for the Chl.a concentration and cell density of C. raciborskii N8 (a and b) and Staurastrum sp. FACHB-1449(c and d)

2.2.2 比生長(zhǎng)速率 無(wú)機(jī)磷條件下，IPHFe、IPMFe和IPLFe實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的比生長(zhǎng)速率分別為0.098±0.01、0.075±0.004、0.04±0.007 d-1，比生長(zhǎng)速率隨鐵濃度的降低而顯著降低(One-way ANOVA，P<0.05；圖2). 有機(jī)磷源條件下，OPHFe、OPMFe和OPLFe實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的比生長(zhǎng)速率分別為0.071±0.005、0.056±0.014和0.025±0.004 d-1，比生長(zhǎng)速率隨鐵濃度降低而顯著降低(One-way ANOVA，P<0.05；圖4). 雙因素方差分析結(jié)果表明，磷源和鐵濃度對(duì)擬柱孢藻N8的比生長(zhǎng)速率均有顯著作用(Two-way ANOVA,P<0.05；圖4)，但交互作用不顯著.

與擬柱孢藻N8組間有明顯差異不同，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中角星鼓藻FACHB-1449的比生長(zhǎng)速率約為0.079±0.001 d-1，各組之間無(wú)顯著差異(Two-way ANOVA，P>0.05；圖4).

2.2.3 鐵載體產(chǎn)量 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組的角星鼓藻FACHB-1449均未檢出鐵載體，而擬柱孢藻N8均檢出較高的鐵載體產(chǎn)量. 無(wú)機(jī)磷源下，IPLFe、IPMFe和IPHFe組擬柱孢藻N8的鐵載體產(chǎn)量均值分別為0.0041、0.0037、0.0028，組間差異不顯著. 有機(jī)磷源下，各實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的鐵載體產(chǎn)量顯著高于無(wú)機(jī)磷條件各實(shí)驗(yàn)組，OPLFe組擬柱孢藻N8的鐵載體產(chǎn)量均值明顯高于OPMFe組和OPHFe組. 雙因素方差分析表明，磷源對(duì)擬柱孢藻N8鐵載體產(chǎn)量具有顯著影響，有機(jī)磷源條件下的鐵載體產(chǎn)量顯著高于無(wú)機(jī)磷源條件. 鐵濃度及其與磷源的交互作用對(duì)擬柱孢藻N8鐵載體產(chǎn)量的影響不顯著(Two-way ANOVA，P>0.05；圖5).

圖4 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻N8和角星鼓藻 FACHB-1449的比生長(zhǎng)速率Fig.4 The specific growth rate of C. raciborskii N8 and Staurastrum sp. FACHB-1449 in six treatments

圖5 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻 N8鐵載體產(chǎn)量Fig.5 The siderophore production of C. raciborskii N8 in six treatments

2.2.4 堿性磷酸酶活性 所有實(shí)驗(yàn)組角星鼓藻FACHB-1449的堿性磷酸酶活性均較低，且無(wú)顯著差異(圖6). 擬柱孢藻N8的堿性磷酸酶活性顯著高于角星鼓藻FACHB-1449(One-way ANOVA，P<0.05). 雙因素方差分析表明，磷源和鐵濃度對(duì)擬柱孢藻N8酶活性均有顯著影響. 無(wú)機(jī)磷組的酶活性顯著低于有機(jī)磷組(P<0.05). 無(wú)機(jī)磷條件下，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的酶活性均呈下降趨勢(shì)，其中IPHFe組下降幅度最大，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢贗PHFe組酶活性接近0，顯著低于IPMFe組和IPLFe組(One-way ANOVA，P<0.05)；IPLFe組的酶活性下降速度和幅度均最低(圖6). 有機(jī)磷條件下，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的酶活性一直維持在0.05～0.075 μmol/((μg Chl.a)·min)之間，在實(shí)驗(yàn)后期OPHFe組的酶活性顯著高于OPMFe組和OPLFe組(One-way ANOVA，P<0.05). 磷源和鐵濃度的交互作用對(duì)擬柱孢藻N8堿性磷酸酶活性的影響不顯著.

圖6 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的堿性磷酸酶活性Fig.6 The alkaline phosphatase activity of C. raciborskii N8 and Staurastrum sp. FACHB-1449 in six treatments

3 討論

3.1 鐵對(duì)擬柱孢藻和角星鼓藻季節(jié)動(dòng)態(tài)的作用比較

調(diào)查期間，擬柱孢藻和角星鼓藻生物量最高占到浮游植物總生物量的82%，是浮游植物群落中最重要的類(lèi)群. 2種浮游植物的季節(jié)動(dòng)態(tài)有明顯的不同，表明其種群對(duì)環(huán)境條件變化的響應(yīng)存在差異. 環(huán)境因子數(shù)據(jù)表明，調(diào)查期間水體TN:TP質(zhì)量比在25以上，溶解性磷濃度一直在0.004 mg/L以下，該磷濃度條件對(duì)大多數(shù)浮游植物生長(zhǎng)都有限制作用[30]. 擬柱孢藻和角星鼓藻是典型適應(yīng)低磷環(huán)境的種類(lèi)[5,30]，該生理特征可能是2種浮游植物能夠在大沙河水庫(kù)成為優(yōu)勢(shì)種的重要原因. 統(tǒng)計(jì)分析表明溶解性磷濃度對(duì)擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對(duì)生物量的季節(jié)變化沒(méi)有顯著的解釋性作用，在長(zhǎng)期低無(wú)機(jī)磷濃度條件下，2種浮游植物的季節(jié)動(dòng)態(tài)主要由溶解性氮和溶解性鐵濃度變化解釋. 擬柱孢藻和角星鼓藻生物量均與溶解性氮濃度呈顯著的負(fù)線性回歸關(guān)系，但只有擬柱孢藻生物量與溶解性鐵濃度有顯著的線性回歸關(guān)系. 該結(jié)果表明，2種浮游植物生物量對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)主要體現(xiàn)在對(duì)溶解性鐵濃度的響應(yīng)差異上；鐵對(duì)擬柱孢藻的季節(jié)動(dòng)態(tài)有重要作用，溶解性鐵濃度的減少是導(dǎo)致擬柱孢藻競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)降低的重要原因.

3.2 鐵對(duì)擬柱孢藻和角星鼓藻生長(zhǎng)的作用比較

3.2.1 無(wú)機(jī)磷源條件下鐵濃度對(duì)2種藻生長(zhǎng)影響的差異 以細(xì)胞密度和Chl.a濃度表示生長(zhǎng)曲線，兩者趨勢(shì)基本一致. 無(wú)機(jī)磷條件下，擬柱孢藻N8的比生長(zhǎng)速率均隨鐵濃度的降低而顯著降低，而各實(shí)驗(yàn)組角星鼓藻FACHB-1449比生長(zhǎng)速率沒(méi)有明顯差異(圖4). 當(dāng)一定的資源濃度條件下細(xì)胞生長(zhǎng)速率小于最大生長(zhǎng)速率，且該資源濃度小于最大生長(zhǎng)速率對(duì)應(yīng)的資源濃度時(shí)，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)受到限制，比生長(zhǎng)速率隨該資源濃度的上升而增加[31]. 0.029 mg/L和0.29 mg/L鐵濃度條件下擬柱孢藻生長(zhǎng)受到限制作用，但角星鼓藻的生長(zhǎng)限制作用不明顯. 該結(jié)果表明，與擬柱孢藻N8相比，角星鼓藻FACHB-1449能在更低的Fe3+濃度條件下正常生長(zhǎng).

為進(jìn)一步明確鐵的限制作用的種間差異，我們對(duì)鐵載體產(chǎn)量進(jìn)行了比較. 擬柱孢藻N8各組均檢出較高的鐵載體產(chǎn)量，且各組的鐵載體組內(nèi)方差較大，而角星鼓藻FACHB-1449各實(shí)驗(yàn)組均未檢出鐵載體(圖5). 鐵載體是藻細(xì)胞在鐵限制條件下產(chǎn)生的有機(jī)小分子物質(zhì)，為八面體結(jié)構(gòu)的異羥肟酸型和鄰苯二酚型小分子物質(zhì)，對(duì)Fe3+具有較強(qiáng)的鰲合作用，同時(shí)鐵離子—鐵載體復(fù)合物能被細(xì)胞外膜上的鐵受體蛋白特異性識(shí)別并將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)從而緩解鐵限制[16,32]. 已有研究提出，藍(lán)藻細(xì)胞能直接利用Fe2+，而對(duì)Fe3+的吸收主要通過(guò)鐵載體途徑完成[33]，鐵載體產(chǎn)量指示細(xì)胞生長(zhǎng)受到鐵限制及環(huán)境Fe2+供應(yīng)不足. 本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基鐵源為Fe3+，通過(guò)鐵載體獲取鐵可能是擬柱孢藻利用鐵的主要途徑，這可能是高鐵實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻N8也能檢出鐵載體產(chǎn)量的重要原因. 綠藻能通過(guò)多種途徑利用鐵元素. 除了能分泌鐵載體途徑利用鐵外[34-35]，綠藻還能直接吸收Fe3+[36]，或通過(guò)分泌還原酶(FCR)，將Fe3+螯合物還原成Fe2+和螯合物配體[35,37]. 本實(shí)驗(yàn)中所有角星鼓藻FACHB-1449實(shí)驗(yàn)組均未檢測(cè)到鐵載體，表明角星鼓藻可能不通過(guò)鐵載體途徑利用鐵.

此外，在無(wú)機(jī)磷源條件下，各實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8在實(shí)驗(yàn)初期均有檢到堿性磷酸酶活性，這與接種前進(jìn)行了磷饑餓處理有關(guān). 堿性磷酸酶為一類(lèi)誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)生受一系列生理過(guò)程調(diào)控. 酶活性對(duì)胞外磷濃度的響應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)滯后現(xiàn)象[38-39]. 隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，高鐵組的酶活性逐漸降低，但中鐵組和低鐵組酶活性降低緩慢(圖6). 低鐵組胞外無(wú)機(jī)磷濃度并不限制其生長(zhǎng)，但較低的鐵濃度可能不利于細(xì)胞對(duì)磷的吸收.

3.2.2 有機(jī)磷源條件下鐵對(duì)2種藻生長(zhǎng)影響的差異 有機(jī)磷條件下，所有實(shí)驗(yàn)組的擬柱孢藻N8比生長(zhǎng)速率都低于無(wú)機(jī)磷高鐵組，且隨鐵濃度降低而降低(圖4). 此外，有機(jī)磷條件下的鐵載體產(chǎn)量和堿性磷酸酶活性均顯著高于無(wú)機(jī)磷條件(圖5和圖6). 上述結(jié)果表明，有機(jī)磷條件下細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)受磷和鐵的限制. 與擬柱孢藻N8不同，角星鼓藻FACHB-1449各實(shí)驗(yàn)組的比生長(zhǎng)速率與無(wú)機(jī)磷高鐵組的差異不顯著，且無(wú)鐵載體產(chǎn)生，堿性磷酸酶活性也較低，3個(gè)指標(biāo)均表明磷源和鐵濃度對(duì)角星鼓藻FACHB-1449的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯限制作用.

溶解性無(wú)機(jī)磷缺乏時(shí)，細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生堿性磷酸酶水解和利用有機(jī)磷，滿(mǎn)足藻細(xì)胞的磷需求[40-41]. 堿性磷酸酶是一類(lèi)蛋白酶，其合成需要氮的參與，鐵是氮還原酶的組成部分，決定氮同化速率及酶的合成[42]. 此外，F(xiàn)e3+是PhoX型堿性磷酸酶活性中心的關(guān)鍵組成部分[43]. 鐵參與堿性磷酸酶的產(chǎn)生和有機(jī)磷利用過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié). 有機(jī)磷條件下，擬柱孢藻N8鐵載體產(chǎn)量顯著高于無(wú)機(jī)磷條件. 表明有機(jī)磷條件下細(xì)胞對(duì)鐵的需求高于無(wú)機(jī)磷條件. 低鐵組鐵載體明顯高于其他組，但由于各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)方差較大，不能通過(guò)鐵載體產(chǎn)量識(shí)別藻細(xì)胞鐵限制程度的組間差異.

大部分浮游植物能夠產(chǎn)生堿性磷酸酶，但堿性磷酸酶的產(chǎn)生以及對(duì)有機(jī)磷的利用能力存在明顯的種間差異[44-45]. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，2種藻均能在有機(jī)磷環(huán)境生長(zhǎng)，但堿性磷酸酶活性存在顯著差異. 所有角星鼓藻FACHB-1449實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶活性一直維持在較低的水平，且不受鐵濃度變化的影響. 擬柱孢藻N8的堿性磷酸酶活性遠(yuǎn)高于角星鼓藻FACHB-1449，且高鐵組酶活性顯著高于低鐵組(圖6). 我國(guó)熱帶水庫(kù)的溶解性無(wú)機(jī)磷濃度普遍較低，水體磷主要以有機(jī)磷形式存在. 角星鼓藻和擬柱孢藻均能適應(yīng)這種低無(wú)機(jī)磷環(huán)境[3,46]，本實(shí)驗(yàn)也支持該結(jié)論. 在這類(lèi)溶解性無(wú)機(jī)磷濃度偏低的水體中，鐵濃度的降低可能限制擬柱孢藻的生長(zhǎng)，而角星鼓藻維持正常生長(zhǎng). 野外調(diào)查結(jié)果顯示，在熱帶水庫(kù)分層強(qiáng)烈的季節(jié)，湖上層常出現(xiàn)高pH值和富氧條件，不利于溶解性鐵尤其是Fe2+的存在，此時(shí)的水環(huán)境即為低無(wú)機(jī)磷和低鐵環(huán)境[20]. 角星鼓藻常在該地區(qū)水庫(kù)處于水體強(qiáng)分層時(shí)成為優(yōu)勢(shì)種，而擬柱孢藻在該時(shí)期的生物量較低. 擬柱孢藻和角星鼓藻的演替現(xiàn)象常出現(xiàn)在這類(lèi)水體[47]，這可能與2種藻的限制性鐵濃度差異有關(guān).

4 結(jié)論

在溶解性無(wú)機(jī)磷長(zhǎng)期偏低的大沙河水庫(kù)中，擬柱孢藻和角星鼓藻是浮游植物群落的主要優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，2種浮游植物生物量具有明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài)，其生物量對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)的區(qū)別主要體現(xiàn)在對(duì)溶解性鐵濃度的響應(yīng)差異上. 與角星鼓藻相比，擬柱孢藻更易受到鐵的限制，有機(jī)磷源條件擬柱孢藻的鐵需求明顯高于無(wú)機(jī)磷條件，有機(jī)磷源條件會(huì)增強(qiáng)鐵對(duì)擬柱孢藻生長(zhǎng)的限制作用.