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    高壓均質(zhì)對大豆分離蛋白-大豆異黃酮相互作用及其復(fù)合物功能性質(zhì)的影響

    2020-10-29 06:17:20吳長玲陳凡凡
    食品科學(xué) 2020年19期
    關(guān)鍵詞:殘基均質(zhì)溶解度

    王 娜,吳長玲,陳凡凡,李 楊,滕 飛

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    高壓均質(zhì)是一種非熱能技術(shù),它不僅能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化并改變其理化性質(zhì),從而導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)(如溶解性、乳化性、起泡性和凝膠化性)得到改善,還具有開發(fā)食品工業(yè)新產(chǎn)品的潛力,因此得到廣泛的應(yīng)用[1]。李楊等[2]研究了不同處理條件對大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)-磷脂酰膽堿相互作用的影響,發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)具有比超聲更為顯著的效果。大豆蛋白作為植物蛋白的主要來源,可提供良好的營養(yǎng)價值和功能特性。它不僅具有優(yōu)異的凝膠特性、乳化能力、持水性和持油性,還含有一定的益生成分,可以降低患有高膽固醇、高脂血癥和心血管疾病的風(fēng)險[3]。大豆異黃酮(soybean isoflavone,SI)作為一種酚類化合物,是大豆的重要食物成分,其已被證明具有降低與年齡相關(guān)激素疾病風(fēng)險,包括癌癥、更年期癥狀和骨質(zhì)疏松癥的功能[4]。

    蛋白質(zhì)和多酚共存于食品基質(zhì)中,主要通過疏水相互作用以及氫鍵相互作用締合成復(fù)合物[5]。蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物的形成一方面影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和營養(yǎng)特性;另一方面,又對食品中酚類化合物的抗氧化能力和生物利用度產(chǎn)生積極的影響。Chen Gang等[6]研究了SPI與茶多酚在不同高壓條件下的相互作用,發(fā)現(xiàn)SPI溶解度從0.258 mg/mL提高到0.5 mg/mL,乳化活性是天然SPI的3 倍。Ren Cong等[7]研究了熱處理對SPI-多酚(黑大豆種皮提取物)復(fù)合物的影響,結(jié)果表明多酚有助于抑制SPI熱聚集,并且形成的復(fù)合物顯示出強烈的自由基清除能力。研究發(fā)現(xiàn),SPI和分離的SI用作膳食補充劑有助于緩解骨質(zhì)疏松癥[8]。近幾年,SI對幾種慢性疾病的治療與預(yù)防已成為研究的焦點。然而,關(guān)于SPI-SI復(fù)合物特有的物理化學(xué)和功能特性的應(yīng)用還有待探索。

    因此,本實驗探討不同均質(zhì)壓力(40、80 MPa和120 MPa)對不同質(zhì)量比的SPI-SI復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能影響,并確定最佳的處理條件,以更好地了解酚類化合物-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系,為SPI-SI復(fù)合物在食品開發(fā)中的應(yīng)用提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    SPI(蛋白質(zhì)量分數(shù)89.21%) 黑龍江哈爾濱農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司;SI(異黃酮質(zhì)量分數(shù)80%) 上海源葉生物科技有限公司;Lowry法測定溶解度試劑盒上海荔達生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) 北京新光化工試劑廠;其余試劑為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    ULTRA-TURRAX UTL2000高壓均質(zhì)機 上海標本模型有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GL-20G-II高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司;ZetaPALS-Zeta電位儀 美國布魯克海文儀器公司;F2000熒光光譜儀 日本日立公司;MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,F(xiàn)TIR)儀 美國Thermo儀器股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 高壓均質(zhì)處理SPI-SI復(fù)合體系

    準確稱取2 g的SPI以及0.04 g和0.4 g的SI樣品分別分散在100 mL去離子水中,使SPI的質(zhì)量濃度為20 mg/mL,S I 的質(zhì)量濃度分別為0.4 m g/m L 和4 m g/m L。2 5 ℃下攪拌2 h 制備S P I 和S I 溶液,4 ℃下過夜以完全水合。將SPI溶液與SI溶液混合,并加入NaN3(0.2 mg/mL)以抑制細菌的生長,pH值調(diào)節(jié)至7.0,使最終樣品含有10 mg/mL SPI和0.2 mg/mL或2 mg/mL SI。以單獨的SPI(10 mg/mL)作為對照,分別在均質(zhì)壓力40、80、120 MPa下均質(zhì)2 次,制備出不同的復(fù)合物(表1),置于4 ℃條件下貯藏。將部分溶液凍干,凍干后的樣品置于干燥器中保存。

    表1 不同處理樣品編號Table 1 Numbers of SPI:SI mixtures subjected to high pressure homogenization at different pressures

    1.3.2 粒徑分布的測定

    參照文獻[9]的方法,使用動態(tài)光散射技術(shù)測定復(fù)合物的粒度分布。在分析之前,將復(fù)合物在磷酸鈉緩沖液中稀釋1 000 倍,以防止多次散射,復(fù)合物顆粒的折射率為1.46,分散介質(zhì)的折射率為1.33,每個樣品重復(fù)測定3 次。

    1.3.3 Zeta電位的測定

    將復(fù)合物溶液在0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中稀釋1 000 倍,之后將其注入ZetaPALS-Zeta電位儀中進行測定,每個樣品重復(fù)測定3 次。

    1.3.4 FTIR分析

    參照文獻[10]的方法進行FTIR分析,將1 mg冷凍干燥樣品與150 mg的KBr粉末混合,壓片后在室溫下記錄FTIR。設(shè)定掃描波數(shù)范圍400~4 000 cm-1,分辨率設(shè)定為4 cm-1,掃描32 次。

    1.3.5 紫外光譜分析

    參照文獻[11]的方法進行紫外光譜分析,將復(fù)合物分別溶于0.01 mol/L pH 7. 0磷酸鹽緩沖液,使蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,波長范圍在200~400 nm之間,分辨率為0.5 nm,掃描速率為50 nm/min,重復(fù)掃描3 次記錄平均值,經(jīng)Origin 8.5軟件微分化獲得紫外吸收曲線。

    1.3.6 熒光光譜分析

    參照文獻[12]的方法,使用熒光分光光度計在25 ℃下進行分析。激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射波長為300~500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

    1.3.7 熒光猝滅分析

    參照文獻[13]的方法,在SI質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 μg/mL,恒定的SPI質(zhì)量濃度(0.5 mg/mL)下分別測定蛋白質(zhì)內(nèi)在熒光強度。激發(fā)波長為280 nm,發(fā)射波長為300~500 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

    1.3.8 溶解性的測定

    參照文獻[14]測定SPI溶解性,高壓均質(zhì)處理后,將樣品溶液倒入離心管,然后在25 ℃下12 000×g離心20 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后,使用Lowry法測定上清液蛋白質(zhì)含量,并以牛血清白蛋白作為標準。蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白含量與樣品中總蛋白含量的比例。

    1.3.9 表面疏水性的測定

    參照文獻[15]的方法,使用ANS作為熒光探針測定復(fù)合物的H0。將樣品分散在磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 7.2)中,稀釋至0.1~1.0 mg/mL。此后,將10.0 μL 8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)(4 mg/mL)加入到4.0 mL稀釋的蛋白質(zhì)溶液中。使用分光光度計在370 nm的激發(fā)波長和470 nm的發(fā)射波長下測定熒光強度。通過線性回歸分析計算熒光強度對蛋白質(zhì)濃度的回歸方程,曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    本實驗數(shù)據(jù)均平行、重復(fù)測定3 次,采用SPSS 22.0軟件中方差分析法進行差異顯著性分析,以P<0.05表示差異顯著,通過Origin 9.1軟件作圖,采用Peak fitting 4.12軟件對紅外吸收曲線進行擬合處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高壓均質(zhì)對SPI-SI復(fù)合物粒徑的影響

    由圖1可知,對于添加相同質(zhì)量濃度的SI,復(fù)合物粒徑也隨著均質(zhì)壓力的增加而減小,這是由于較高的壓力導(dǎo)致較高的剪切速率,從而造成粒徑減小。在相同均質(zhì)壓力下,對于SPI-SI復(fù)合物(1∶0.02),具有較小的粒徑且小于單獨的SPI,可能主要是SPI在高壓均質(zhì)前保持天然狀態(tài),并且大多數(shù)疏水結(jié)構(gòu)域埋在核心內(nèi),高壓導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,暴露出疏水氨基酸殘基,并且解開多肽鏈[16],SPI和SI之間的疏水相互作用大大增強,并且產(chǎn)生了更緊湊的復(fù)合物,這可以通過FTIR結(jié)果進一步證實;對于SPI-SI復(fù)合物(1∶0.2),復(fù)合物顆粒尺寸較大,且分布范圍寬,這可能是SI的質(zhì)量濃度過高,使得兩個肽分子形成了SI包被的二聚體,形成的聚集體導(dǎo)致顆粒尺寸輕微增大。O’sullivan等[17]研究乳清蛋白與綠茶多酚復(fù)合時發(fā)現(xiàn),復(fù)合物顯示尺寸隨著多酚濃度的增加而增加。這種現(xiàn)象可以解釋為多酚可以作為蛋白質(zhì)分子的橋接劑,隨著多酚濃度的增加,導(dǎo)致形成更大的復(fù)合物。

    圖1 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的粒徑分布Fig. 1 Particle size distribution of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

    圖2為不同高壓均對體積平均粒徑(D[4,3])的影響。隨著均質(zhì)壓力的增加,樣品粒徑減小,其中HP-6具有最小的D[4,3],為182.8 μm。在相同均質(zhì)壓力條件下,SPI-SI(1∶0.02)復(fù)合物顯示出較小的D[4,3],這與粒徑分布結(jié)果一致。

    圖2 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的D[4,3]Fig. 2 D[4,3] of SPI and SPI-SI complexes under different homogenization pressures

    2.2 高壓均質(zhì)對SPI-SI復(fù)合物Zeta電位的影響

    圖3 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的Zeta電位Fig. 3 Zeta potential of SPI and SPI-SI compounds under different homogeneous pressures

    膠體顆粒表面的電荷是評判懸浮顆粒分散和聚集的重要指標。具有低電位絕對值的聚合物傾向于凝聚或絮凝,而具有高電位絕對值的溶液是穩(wěn)定的[18]。圖3顯示了不同高壓均質(zhì)條件下處理SPI和SPI-SI復(fù)合物的Zeta電位。對于單獨的SPI,經(jīng)40 MPa高壓均質(zhì)處理后,Zeta電位絕對值約為3.24 mV。當(dāng)壓力增加到120 MPa時,Zeta電位絕對值達到最大值7.51 mV。高壓均質(zhì)處理SPI Zeta電位絕對值顯著提高,表明具有更大的電負性。

    通過添加SI進一步增加了復(fù)合物的Zeta電位絕對值。結(jié)果表明,SI可能包圍蛋白質(zhì)分子表面,改變了蛋白質(zhì)的表面電荷分布,進一步增強了顆粒間的靜電排斥,導(dǎo)致膠體聚集體破壞,防止進一步聚集,提高了分散體的穩(wěn)定性。在120 MPa下,Zeta電位絕對值降低,可能是由于蛋白質(zhì)溶解度的降低。當(dāng)SI質(zhì)量濃度增加至0.2 mg/mL時,觀察到Zeta電位絕對值出現(xiàn)明顯下降趨勢,這種趨勢可能是由于在均質(zhì)過程中電荷重排,SPI聚集體的形成引起一些帶電基團可能埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部并且對表面電荷沒有貢獻[19]。

    2.3 復(fù)合物FTIR分析結(jié)果

    圖4 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的FTIR圖Fig. 4 FTIR spectra of SPI and SPI-SI complex under differenthomogenization pressures

    表2 不同高壓均質(zhì)下的SPI和SPI-SI二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 2 Relative contents of secondary structures in SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

    蛋白質(zhì)的紅外光譜擁有多個特征吸收譜區(qū)域組成,其中酰胺I區(qū)波數(shù)范圍是1 600~1 700 cm-1。主要由C=O伸縮振動引起,其主要對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)敏感[20]。高壓均質(zhì)處理后,SPI的FTIR光譜圖如圖4所示,F(xiàn)TIR光譜可以靈敏地反映肽鏈結(jié)構(gòu)的變化。根據(jù)FTIR數(shù)據(jù)擬合過程的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化如表2所示。從40 MPa升高到80 MPa時,α-螺旋相對含量降低(HP-7和HP-8除外),β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量顯著下降,β-折疊相對含量逐漸升高。α-螺旋是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),其含量降低表明適宜的高壓均質(zhì)壓力可以改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變得更加拉伸,可能會影響SPI與其他物質(zhì)的結(jié)合程度。據(jù)報道,β-折疊含量的增加表明負責(zé)疏水相互作用的蛋白質(zhì)位點暴露,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的增強[21],這在蛋白質(zhì)表面疏水性分析中得到進一步證實。但在120 MPa下,呈現(xiàn)α-螺旋含量升高(HP-7和HP-8除外),β-轉(zhuǎn)角含量顯著上升。這種現(xiàn)象表明高壓均質(zhì)處理處理改變了SPI的氫鍵,導(dǎo)致不同二級結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)化。

    2.4 復(fù)合物溶液紫外光譜分析結(jié)果

    圖5 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的紫外光譜(A)和最大吸光度(B)Fig. 5 Ultraviolet spectra (A) and maximum absorbance (B) of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

    色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫氨基酸在230~310 nm的波長范圍內(nèi)具有吸收峰。其中,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸由于其不同的顏色組而具有不同的吸收光譜。色氨酸和酪氨酸殘基的共軛雙鍵在280 nm波長處具有吸收峰[22]。如圖5B所示,隨著均質(zhì)壓力的增加,樣品的最大吸光度下降,這可能是由于高壓均質(zhì)處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊,使更多的發(fā)色團轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)表面,從而降低紫外吸收。隨著SI質(zhì)量濃度的增加,紫外吸收光譜最大吸收峰從254 nm到262 nm,發(fā)生了紅移(圖5A),說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化。這可能是由于SPI和SI的相互作用影響了蛋白質(zhì)分子的微環(huán)境,使更多芳香族氨基酸殘基附近微環(huán)境親水性增強,從而導(dǎo)致不同高壓均質(zhì)處理SPI-SI復(fù)合物結(jié)構(gòu)的不同。此外,可以推測SPI-SI的猝滅機理是靜態(tài)猝滅,因為動態(tài)猝滅僅影響猝滅分子的激發(fā)態(tài),而不會改變猝滅物質(zhì)的吸收光譜[23]。

    2.5 復(fù)合物溶液熒光光譜分析結(jié)果

    圖6 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

    內(nèi)源性熒光特性是因為蛋白質(zhì)內(nèi)部含有不同的發(fā)色基團,主要是芳香族氨基酸,常用于監(jiān)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。當(dāng)在280 nm波長處激發(fā)時,蛋白質(zhì)的熒光光譜主要歸因于Tyr和Trp殘基的熒光發(fā)射[24]。圖6為高壓均質(zhì)處理后SPI和SPI-SI復(fù)合物的熒光光譜。與40 MPa相比,均質(zhì)壓力為120 MPa明顯降低了SPI的熒光強度,已有研究已經(jīng)證明Lys、His和Cys殘基具有猝滅Trp和Tyr殘基熒光的能力[25],高壓均質(zhì)處理可使這些殘基更接近Trp和Tyr殘基。另外本研究還發(fā)現(xiàn),隨著壓力增加,導(dǎo)致最大波長發(fā)生輕微的紅移,這些結(jié)果表明,SPI中Trp和Tyr殘基附近微環(huán)境親水性增強,高壓均質(zhì)也改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

    蛋白質(zhì)熒光的變化與Trp周圍氨基酸殘基的移動有關(guān)。如圖6所示,與單獨SPI相比,高壓均質(zhì)處理后SPI-SI的熒光強度明顯降低,證實了SI對熒光的猝滅作用,可能由于高壓均質(zhì)處理使更多的Try和Tyr殘基暴露,從而增強了與SI的芳香環(huán)的疏水相互作用,這導(dǎo)致Trp和Tyr熒光的更強猝滅。另外,隨著SI質(zhì)量濃度的增加,熒光強度明顯下降,可能是經(jīng)過高壓均質(zhì)處理產(chǎn)生的松散肽處于熱力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)并且傾向于通過疏水相互作用與更多SI締合,從而具有較高的聚集程度,這可以從顆粒尺寸中證實[26]。很明顯,添加SI后,復(fù)合物的最大峰位置略微紅移,表明Trp和Tyr處于極性更強的環(huán)境,這可能與壓力引起的SPI二級結(jié)構(gòu)的改變有關(guān),或者可能歸因于SI分子中的苯環(huán)[27]。

    2.6 熒光猝滅機理分析

    根據(jù)Stern-Volmer方程(式(1))計算不同溫度條件下的猝滅常數(shù),從而可以初步判斷該反應(yīng)的熒光猝滅機制。

    式中:F0和F分別是SPI中未加入和加入猝滅劑時的熒光強度;[Q]是猝滅劑質(zhì)量濃度/(μg/mL);KSV是猝滅常數(shù)/(L/mol);Kq是雙分子猝滅速率常數(shù)/(L/(mol·s));τ0為不存在猝滅劑時熒光體的壽命,生物大分子的平均壽命約為10-8s[8]。

    因此,可通過F0/F對[Q]的線性回歸確定KSV。熒光猝滅可進一步分類為動態(tài)或靜態(tài)猝滅。對于靜態(tài)猝滅,猝滅數(shù)據(jù)可以根據(jù)修改的Stern-Volmer方程(式(2))來分析。

    式中:fa是蛋白質(zhì)(熒光基團)是可接近熒光的分數(shù);Ka是可獲得熒光基團的猝滅常數(shù)/(L/mol),其可作為猝滅劑和受體之間的結(jié)合常數(shù)。

    通過F0/(F0-F)和1/[Q]之間的線性回歸,能夠確定1/faKa(斜率)和1/fa(截距),因此可求得Ka。

    圖7 不同均質(zhì)壓力下SI對SPI的熒光光譜影響Fig. 7 Fluorescence spectra of SPI-SI complex under different homogenization pressures

    熒光猝滅法用于進一步研究SPI和SI之間的結(jié)合反應(yīng)。蛋白質(zhì)的固有熒光光譜對疏水性殘基發(fā)色團(例如Trp或Tyr)的環(huán)境變化非常敏感,在280 nm的激發(fā)波長下,蛋白質(zhì)的固有熒光發(fā)射主要來自其Trp殘基[22]。如圖7所示,可以看出在沒有SI存在時,樣品顯示出最強的熒光強度。隨著SI的質(zhì)量濃度增加,SPI的最大熒光強度逐漸降低,且出現(xiàn)明顯的紅移,表明SPI與SI之間存在明顯的相互作用,SPI空間構(gòu)象發(fā)生改變。紅移表明Trp殘基微環(huán)境親水性增強。在SPI-花青素相互作用和SPI-白藜蘆醇相互作用中也觀察到類似的熒光現(xiàn)象[13,28]。

    表3 SPI-SI復(fù)合物的熒光猝滅速率常數(shù)、雙分子猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)Table 3 Fluorescence quenching constants, bimolecular quenching rate constant and binding constants of SPI-SI complex

    根據(jù)Stern-Volmer方程,研究在不同均質(zhì)壓力下,SI猝滅SPI的程度。一般來說,各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq為2×1010L/(mol·s)[8],本研究中40、80、120 MPa下Kq分別為2.74×1013、2.55×1013、2.34×1013L/(mol·s),均高于最大動態(tài)猝滅常數(shù)(表3)。這表明SPI和SI之間的猝滅過程主要是由于相互作用形成了復(fù)合物而引發(fā)了靜態(tài)猝滅。從圖7中插圖可以觀察到,在不同均質(zhì)壓力下,F(xiàn)0/(F0-F)對1/[Q]的圖形呈良好的線性關(guān)系(R2=0.991 2~0.997 6)。圖中曲線呈線性關(guān)系意味著所有猝滅劑分子(如本實驗中SI)均勻地進入蛋白質(zhì)的結(jié)合位點。此外,通過修改的Stern-Volmer等式計算猝滅常數(shù)Ka,其大小反映猝滅劑對熒光基團的接觸程度和反應(yīng)速度[28]。80 MPa下Ka均高于40 MPa和120 MPa下Ka,表明經(jīng)過均質(zhì)壓力為80 MPa處理的SPI使其與SI接觸程度更高,有利于形成SPI-SI復(fù)合物。

    2.7 復(fù)合物溶解性分析結(jié)果

    圖8 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的溶解度Fig. 8 Solubility of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

    溶解度是蛋白質(zhì)變性和聚集的最實用的量度,因此是蛋白質(zhì)功能的良好指標。高壓均質(zhì)處理后,所有樣品的溶解度均得到改善(天然SPI溶解度約為40%)[29],并在80 MPa時達到最大值。對這種現(xiàn)象的解釋是高壓均質(zhì)處理可以減小SPI的粒徑,使蛋白質(zhì)分子的表面區(qū)域變大,從而增加蛋白質(zhì)-水相互作用,進而提高蛋白質(zhì)的溶解度[30]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)溶解度增加可能是暴露的基團通過氫鍵與水相互作用造成的[20]。然而,SPI在120 MPa下的溶解度略低于在80 MPa下的(圖8),這可能是均質(zhì)過程中產(chǎn)生的熱量導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性和聚集體形成。SI質(zhì)量濃度較低時,溶解度得到改善,當(dāng)質(zhì)量濃度進一步增加至2 mg/mL時,導(dǎo)致溶解度降低。這些結(jié)果表明,SI具有增加蛋白質(zhì)溶解度的能力。高壓處理改變了SPI的性質(zhì),其與構(gòu)象變化相關(guān),例如疏水基團的暴露,SPI的疏水性明顯增強。因此,帶電基團可以在蛋白質(zhì)表面上重新分布,這將影響基團電離。同時,SPI分子部分展開,更容易與SI發(fā)生疏水相互作用和氫鍵作用,這將改變蛋白質(zhì)的電位。高溶解度歸因于疏水殘基的數(shù)量少和電荷升高。因此,SI的添加可以明顯改善高壓均質(zhì)處理的SPI的性質(zhì)。

    2.8 復(fù)合物表面疏水性分析結(jié)果

    圖9 不同高壓均質(zhì)條件下SPI和SPI-SI復(fù)合物的表面疏水性Fig. 9 Surface hydrophobicity of SPI and SPI-SI complex under different homogenization pressures

    蛋白質(zhì)表面疏水性表征與極性溶劑接觸蛋白質(zhì)表面上疏水基團數(shù)量,用于評估蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)特征之一,并且與其功能性質(zhì)密切相關(guān)[31]。如圖9所示,高壓均質(zhì)處理后H0明顯增加。H0的增加是由大蛋白質(zhì)聚集體的破壞引起的,其誘導(dǎo)埋藏的疏水基團的暴露。H0從40 MPa逐漸增加到80 MPa,并在80 MPa下達到最大值。當(dāng)壓力升至120 MPa時,H0與80 MPa相比減弱。這可能是經(jīng)高壓均質(zhì)處理引起的空化現(xiàn)象使SPI分子發(fā)生一定程度的展開,因此增加了疏水基團的數(shù)量以及最初在SPI分子內(nèi)暴露于外部環(huán)境的區(qū)域,但其中一些聚集體會在較高壓力下發(fā)生疏水相互作用而重新聚集。這與文獻[32]所報道高壓處理后乳清蛋白的疏水性增加相似。對于低質(zhì)量濃度SI樣品的H0高于無SI樣品,表明SI促進ANS與蛋白質(zhì)表面的疏水位點的結(jié)合。SI質(zhì)量濃度增大,表面疏水性的降低可能是SPI構(gòu)象發(fā)生變化造成的,SPI與SI形成分子間相互作用和聚集,會使疏水基團逐漸埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部[24]。

    3 結(jié) 論

    本實驗研究不同均質(zhì)壓力對不同比例SPI-SI復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能的影響。均質(zhì)壓力為80 MPa、SI質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時,Zeta電位絕對值、蛋白質(zhì)溶解度和表面疏水性分別增加了6.18 mV、28%和33%。同時,提高均質(zhì)壓力顯著降低了復(fù)合物的粒徑。通過分析FTIR、紫外光譜、熒光光譜變化發(fā)現(xiàn),SPI二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,隨著壓力的增加,α-螺旋相對含量先減少后增加,β-折疊相對含量先增加后減少,芳香族氨基酸殘基附近微環(huán)境親水性增強。這表明高壓均質(zhì)會影響SPI-SI之間相互作用,適度的壓力和低質(zhì)量濃度的SI有利于提高復(fù)合物的功能特性。功能特性的變化可以滿足食品工業(yè)中制成復(fù)雜食品的需求,但需要進一步研究以了解其具體機制。本實驗結(jié)果可為蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)。

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