抗菌肽brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌的協(xié)同抑菌機理

寧亞維，蘇 丹，付浴男，劉楊柳，王志新，賈英民,

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

為了防止食品腐敗變質，食品加工過程中通常通過添加防腐劑進行防腐保鮮，其中最常用的為化學防腐劑。但隨著人們對食品安全逐漸重視，化學防腐劑的安全性受到質疑，天然防腐劑受到青睞[1-2]。目前研究較多的天然防腐劑主要包括各類植物提取物（如植物精油、迷迭香、大蒜素等）和抗菌肽[3-4]。多數(shù)植物提取物如精油和大蒜素等由于添加后會影響食品本身的風味而需要進行包埋等修飾，這無疑提高了生產(chǎn)成本?？咕闹饕晌⑸锇l(fā)酵產(chǎn)生，具有生產(chǎn)周期短、成本低等優(yōu)勢，在食品防腐領域具有較高的應用潛力?？咕腷revilaterin是由側孢短芽孢桿菌產(chǎn)生的一種小分子肽，具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點[5]。研究發(fā)現(xiàn)brevilaterin對革蘭氏陰性菌的抑菌能力較陽性菌弱，單獨使用時存在用量大的問題，因此在食品中要實現(xiàn)廣譜抑菌則需要增加使用劑量，導致成本增加。

具有協(xié)同作用的防腐劑聯(lián)合使用，可提高防腐劑的抗菌活性，降低單一防腐劑的使用量[6]。為了降低抗菌肽在食品中的使用量，本課題組對多種天然防腐劑進行了篩選，發(fā)現(xiàn)檸檬酸與brevilaterin聯(lián)用對大腸桿菌（Escherichia coli）具有協(xié)同抑菌效應，聯(lián)合使用可增強其抑菌活性[7]。檸檬酸在食品中主要作為酸味調節(jié)劑使用，但是研究也發(fā)現(xiàn)其可以作為協(xié)同抑菌劑來提高Nisin的抑菌活性[8-9]。Campion等[10]發(fā)現(xiàn)檸檬酸與Nisin復配使用可有效降低嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的數(shù)量。Oladunjoye等[11]研究表明檸檬酸、Nisin聯(lián)合使用對番茄切片中的單核細胞增生李斯特菌具有協(xié)同控制作用。檸檬酸與抗菌肽聯(lián)用可發(fā)揮雙功能性，即酸味調節(jié)和抑菌作用。因此，抗菌肽和檸檬酸聯(lián)合使用在食品中具有較好的應用前景，然而兩者聯(lián)用的抑菌機理尚不明確。

大腸桿菌是一種常見的食源性致病菌，不僅會造成食品腐敗變質，還會通過污染食品感染人類，引起食源性疾病。據(jù)美國疾病控制與預防中心報道，產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌每年導致超過26.5萬人患??；2016年，美國報告了5 441 例產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希氏菌感染病例，包括2 323 例O157和3 104 例非O157病例，且與2015年相比非O157感染率增加了15%[12]。因此，控制食品中的食源性致病菌——大腸桿菌具有重要意義。

本研究以食源性致病菌大腸桿菌為指示菌，通過時間-殺菌曲線考察了brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌的協(xié)同抑菌效應，從細胞膜損傷（如跨膜電勢、膜完整性、菌體超微結構），菌體蛋白質合成以及對細菌DNA的影響三方面研究了brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌的協(xié)同抑菌機理，以期為抗菌肽brevilaterin與檸檬酸在食品中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

brevilaterin由河北科技大學食品生物技術與安全實驗室制備[13]；大腸桿菌ATCC 44752由河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏。

檸檬酸 天津永大化學試劑有限公司；DiSC3(5)美國Sigma公司；LIVE/DEAD BacLight細菌活力試劑盒 美國Thermo Fisher Scientific公司；低分子質量蛋白質Marker、DNA Ladder 北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；瓊脂糖G-10 上海玉博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Evolution 220型紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；SepctraMax Plus 384型酶標儀美國Molecular Devices公司；F-7000-FL型熒光分光光度計、H-7650型透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；Accuri C6 plus型流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53型熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 時間-殺菌曲線繪制

將生長至對數(shù)期的大腸桿菌懸液與不同抑菌劑組混合，使菌懸液終濃度為5×105CFU/mL，brevilaterin終濃度分別為160 AU/mL（最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC））、40 AU/mL（1/4 MIC），檸檬酸終質量濃度分別為1.25 mg/mL（MIC）、0.312 5 mg/mL（1/4 MIC），聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC），以質量分數(shù)0.85%生理鹽水作為空白對照。將各處理組置于37 ℃孵育一定時間后，取出涂布平板并于37 ℃培養(yǎng)18 h后進行活菌菌落計數(shù)。

1.3.2 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌跨膜電勢的影響

參考Lee等[14]的方法并進行適當修改。將大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（含10 mmol/L葡萄糖、100 mmol/L氯化鉀，pH 7.2）清洗并重懸為2×108CFU/mL的菌懸液。將膜電位探針DiSC3(5)添加到菌懸液中（終濃度為1 μmol/L）于30 ℃避光孵育15 min。在比色皿中加入菌懸液與等體積各濃度的抑菌劑（brevilaterin（1/4 MIC）組與MIC組，檸檬酸（1/4 MIC）組與MIC組，以及聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）），以無菌水作為空白對照，以纈氨霉素（valinomycin，Val）為陽性對照，尼日利亞菌素（nigericin，Nig）為陰性對照，終濃度均為10 μmol/L。利用熒光分光光度計進行掃描，其中激發(fā)波長為650 nm，發(fā)射波長為672 nm。

1.3.3 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細胞膜完整性的影響

參考Wang Yao等[15]的方法并進行適當修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌用生理鹽水清洗、重懸制備為濃度為2×108CFU/mL的菌懸液。將等體積的菌懸液與不同濃度抑菌劑混合。在37 ℃條件下孵育1 h，然后用生理鹽水清洗、重懸。以生理鹽水作為陰性對照，以體積分數(shù)70%異丙醇作為陽性對照。向上述菌懸液中加入SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（終濃度為2 μmol/L）并于30 ℃條件下避光孵育15 min。最后通過生理鹽水清洗、重懸后，分別采用流式細胞儀和熒光顯微鏡對染色細胞進行計數(shù)分析與拍照觀察。

1.3.4 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌超微結構的影響

參考Liu Hongxia等[16]的方法并進行適當修改。將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗、重懸制備菌懸液，然后分別向菌懸液（終濃度為2×108CFU/mL）中加入各組抑菌劑，以PBS作為空白對照。37 ℃下培養(yǎng)1 h后，用PBS清洗兩遍，然后用體積分數(shù)4%戊二醛4 ℃固定過夜。再用體積分數(shù)1%鋨酸在4 ℃固定4 h，不同體積分數(shù)（30%、50%、70%、80%、90%）的丙酮逐級脫水，再用無水丙酮置換兩次。用包埋劑包埋、聚合后進行超薄切片，采用醋酸雙氧鈾進行染色后，采用TEM觀察。

1.3.5 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌蛋白質合成的影響

參考Ning Houqi等[17]的方法并進行適當修改。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌用生理鹽水清洗、重懸。將菌懸液與抑菌劑混合使其終濃度為108CFU/mL，并于37 ℃條件下培養(yǎng)1 h。用生理鹽水清洗、重懸至300 μL，加入4×蛋白上樣緩沖液900 μL，在100 ℃沸水中加熱5 min后，放至室溫離心后備用。制備凝膠（10%的分離膠與4%的濃縮膠），安裝好電泳裝置后，于上樣孔中加樣10 μL，調節(jié)電壓至80 V開始十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），待溴酚藍進入分離膠后120 V跑至膠底。將膠塊放置于染色液（考馬斯亮藍G250 1 g/L、45%（體積分數(shù)，下同）甲醇、10%冰醋酸、45%蒸餾水）中搖床染色20 min后，放入脫色液（10%甲醇、10%冰醋酸、80%蒸餾水）中進行搖床脫色，直至條帶清晰后使用凝膠成像儀拍照記錄結果。

1.3.6 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細菌DNA的影響

采用DNA試劑盒提取大腸桿菌基因組DNA，使用超微量紫外分光光度計測定所提DNA的質量濃度（62.4 μg/mL）和純度（OD260nm/OD280nm＝1.83）。制備質量分數(shù)0.8%的瓊脂糖凝膠，其中加入4S Red Plus核酸染色劑（終劑量為0.1 μL/mL）。將DNA與各濃度抑菌劑混合（DNA終質量濃度為31 μg/mL），在37 ℃下水浴30 min后，進行瓊脂糖凝膠電泳并使用凝膠成像儀拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復3 次取其平均值。采用Origin 8.0軟件通過單因素方差分析法對實驗結果進行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌的時間-殺菌曲線

通過時間-殺菌曲線研究了brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用組合的抑菌動力學，從圖1可以看出，brevilaterin、檸檬酸的MIC組和聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）在24 h內(nèi)均呈現(xiàn)抑菌效果，且聯(lián)用組較brevilaterin（1/4 MIC）與檸檬酸（1/4 MIC）單獨使用的菌落數(shù)有明顯下降，結果證實brevilaterin（1/4 MIC）與檸檬酸（1/4 MIC）聯(lián)用具有協(xié)同抑菌效果。

圖1 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌的時間-殺菌曲線Fig. 1 Time-killing curve of brevilaterin in combination with citric acid against E. coli

2.2 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細胞跨膜電勢的影響

DiSC3(5)是一種膜電位敏感染料，能夠在完整的極化細胞膜中累積，處于自猝滅狀態(tài)；當膜電位被破壞時，染料被釋放到介質中，DiSC3(5)熒光強度增加[18-19]。因此采用DiSC3(5)考察大腸桿菌細胞膜電勢的變化。如圖2所示，陰性對照組（Nig）、空白對照組熒光強度無明顯變化，而陽性對照組（Val）可有效提高鉀離子的擴散速率，從而消散膜電位，使熒光強度增加。brevilaterin（1/4 MIC）組熒光強度無明顯變化，brevilaterin（MIC）組熒光強度明顯增加（從230增加至320左右），說明其會消散膜電位。1/4 MIC檸檬酸和MIC檸檬酸組熒光強度均增加，但兩者無顯著差異，表明1/4 MIC和MIC檸檬酸均可以導致細胞膜電勢消散，且1/4 MIC和MIC檸檬酸對細胞膜電勢的消散程度無顯著差異。聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）的熒光強度隨時間的延長不斷增強，其熒光強度明顯高于brevilaterin（MIC）組與檸檬酸（MIC）組的熒光強度。因此可推測，brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌膜電勢有協(xié)同消散作用。

圖2 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌細胞跨膜電勢的影響Fig. 2 Influence of brevilaterin combined with citric acid on transmembrane potential of E. coli

2.3 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌細胞膜完整性的影響

圖3 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌細胞膜完整性影響的流式細胞圖Fig. 3 Effect of brevilatein combined with citric acid on the membrane integrity of E. coli determined by flow cytometry

利用SYTO 9和PI熒光探針研究brevilaterin與檸檬酸對細胞膜完整性的影響[20-21]。SYTO 9探針可以標記所有細菌，而PI只能標記細胞膜受損的細菌[22]；當兩種染料同時存在時，PI會與SYTO 9發(fā)生競爭性結合導致SYTO 9染色熒光的減弱。如圖3所示，空白對照組膜受損率為3.3%，brevilaterin（1/4 MIC）組的膜受損率達到了66.7%，brevilaterin（MIC）組的膜受損率較高，為98.1%；檸檬酸（1/4 MIC）組的膜受損率20.7%，檸檬酸（MIC）組的膜受損率為60.0%，聯(lián)合使用組的膜受損率高達99.5%。因此，上述結果表明brevilaterin（MIC）基本能夠破壞全部細胞的膜完整性，檸檬酸（MIC）僅能破壞部分細胞的膜完整性，聯(lián)用組的膜受損率高于二者單獨作用，說明brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌的膜完整性具有協(xié)同破壞作用。

從圖4可以觀察到，未經(jīng)抑菌劑處理的對照組細胞僅被SYTO 9染色，發(fā)出綠色熒光，表明細胞膜完整，而經(jīng)過brevilaterin（1/4 MIC）組處理后，60%以上細胞發(fā)出紅色熒光；經(jīng)過brevilaterin（MIC）組處理后，幾乎所有細胞都發(fā)出橙紅色熒光。經(jīng)過檸檬酸（1/4 MIC）組處理后，大多數(shù)細胞為綠色，而經(jīng)過檸檬酸（MIC）組處理后，50%以上的細胞呈現(xiàn)紅色，表明檸檬酸處理后的細胞膜受損率較brevilaterin（MIC）組小。而聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）細胞幾乎全部發(fā)出橙紅色熒光，說明幾乎所有的細胞膜完整性受到破壞，上述結果與流式細胞儀檢測結果一致。

圖4 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌細胞膜完整性影響的熒光顯微圖Fig. 4 Effect of brevilatein combined with citric acid on the membrane integrity of E. coli observed by fluorescence microscopy

2.4 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌超微結構的影響

通過TEM觀察brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌菌體形態(tài)變化的影響，結果如圖5所示，空白對照組菌體形態(tài)完好、內(nèi)容物完整；brevilaterin（MIC）組的細胞發(fā)生形變、質壁分離、細胞內(nèi)容物泄漏等變化[23]；檸檬酸（MIC）組細胞膜邊緣模糊且細胞內(nèi)容物泄漏，表明brevilaterin和檸檬酸均可以破壞細胞的超微結構。此外，brevilaterin（1/4 MIC）組部分細胞受損（與時間-殺菌曲線顯示的部分抑菌效果一致），細胞內(nèi)局部出現(xiàn)空腔，檸檬酸（1/4 MIC）組無顯著影響，但聯(lián)用組brevilaterin（1/4 MIC）+檸檬酸（1/4 MIC）處理后細胞發(fā)生形變，菌體內(nèi)出現(xiàn)空洞，表明brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌超微結構有協(xié)同破壞效應。

圖5 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌超微結構影響的TEM圖Fig. 5 Effect of brevilatein combined with citric acid on the ultrastructure of E. coli examined by TEM

2.5 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌蛋白質合成的影響

蛋白質在細胞代謝與物質合成中發(fā)揮關鍵作用，因此考察了brevilaterin與檸檬酸對蛋白質表達的影響。通過SDS-PAGE分析考察大腸桿菌的蛋白質條帶變化，如圖6所示，brevilaterin（MIC）組（泳道6）在分子質量31 kDa附近有一個條帶顏色加深（箭頭處），其他條帶均無明顯變化，可能是由于高濃度的brevilaterin促進了此分子質量蛋白質的合成。上述結果表明brevilaterin、檸檬酸對蛋白質表達無顯著影響。

圖6 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌蛋白質合成影響的SDS-PAG圖Fig. 6 Effect of brevilatein combined with citric acid on protein synthesis in E. coli evaluated by SDS-PAGE

2.6 brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌DNA的影響

DNA是最重要的遺傳物質之一，DNA的損傷會影響基因的表達，導致酶和受體蛋白質等合成受阻，最終導致細胞死亡[24]。從圖7可以看出，空白對照組的DNA條帶亮度最強，brevilaterin（1/4 MIC）和brevilaterin（MIC）組條帶亮度與對照組相比輕微減弱；檸檬酸（1/4 MIC）組DNA條帶亮度明顯降低，檸檬酸（MIC）處理組的DNA條帶彌散消失；聯(lián)用組的DNA條帶亮度較brevilaterin（1/4 MIC）、檸檬酸（1/4 MIC）顯著降低。結果表明，檸檬酸對大腸桿菌菌體DNA具有較強的降解作用，brevilaterin和檸檬酸聯(lián)用組對DNA具有協(xié)同降解作用。

圖7 brevilaterin與檸檬酸聯(lián)用對大腸桿菌 DNA影響的凝膠阻滯圖Fig. 7 Effect of brevilatein combined with citric acid on DNA of E. coli evaluated by gel retardation

3 討 論

近年來，抗菌肽作為天然防腐劑愈來愈受到人們青睞，且天然防腐劑之間復配使用因可有效提高抗菌活性，降低使用量而受到人們關注。Khorsandi等[25]研究發(fā)現(xiàn)Nisin與天然防腐劑聯(lián)用可有效延長香腸貨架期；Shi Ce等[26]研究發(fā)現(xiàn)Nisin與肉桂醛聯(lián)用對巴氏殺菌奶中的金黃色葡萄球菌有很好的協(xié)同抑菌效果；Najjar等[27]研究發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸與Nisin A聯(lián)用可以有效抑制人體口腔中的變形鏈球菌的生長。Jia Shiliang等[28]發(fā)現(xiàn)聚賴氨酸與低溫貯藏可延緩太平洋白蝦變質。本研究所考察的brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌具有較好的協(xié)同抑制作用，且聯(lián)用可降低brevilaterin與檸檬酸單獨使用的劑量，在食品防腐中具有較大的應用潛力。

目前，關于抗菌肽的機理研究已有大量報道，抗菌肽主要作用于微生物細胞膜，如在細胞膜上形成離子通道、跨膜孔，造成膜大面積破裂，最終導致微生物細胞的裂解；同時，抗菌肽也可能會破壞靶向DNA和伴侶蛋白，改變細胞質膜隔膜的形成，抑制細胞壁合成，減少核酸合成，抑制蛋白質合成或抑制酶的活性[29-30]?；诖?，本實驗通過細胞壁膜、蛋白質合成和核酸合成對brevilaterin的抑菌機理進行研究。通過細菌跨膜電勢、細胞膜通透性實驗和菌體超微結構觀察分析發(fā)現(xiàn)抗菌肽brevilaterin、檸檬酸均對大腸桿菌細胞膜有破壞作用；通過對菌體DNA影響的研究發(fā)現(xiàn)brevilaterin、檸檬酸對菌體DNA有降解作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，brevilaterin與檸檬酸相比對大腸桿菌膜的破壞性較強，推測可能與其作用方式有關，即抗菌肽在細胞膜表面形成跨膜孔增大了細胞膜的通透性。

綜上，brevilaterin與檸檬酸對大腸桿菌具有協(xié)同抑菌作用，可以通過消散細胞跨膜電勢，破壞細胞膜完整性，造成菌體DNA降解和細胞內(nèi)容物泄漏。本研究為brevilaterin與檸檬酸復配組合在食品防腐中的應用中提供了理論參考。