代謝工程改造大腸桿菌MG1655積累L-蘋果酸

何 彬，周志東，曹 陽(yáng)，黃 皓，周 衛(wèi)，陳 俊

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢，430081)

L-蘋果酸是生物體三羧酸(TCA)循環(huán)中的一種重要中間產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等多個(gè)領(lǐng)域[1]。早期生產(chǎn)蘋果酸的方法主要有化工合成法、植物提取法以及采用琥珀酸為原料的酶轉(zhuǎn)化法[2]，然而隨著此類方法所需成本日益增加、人們的環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)，節(jié)能、環(huán)保且高效的微生物發(fā)酵技術(shù)已成為獲取蘋果酸的重要途徑。作為已知的蘋果酸高效生產(chǎn)菌株，曲霉屬菌種諸如黃曲霉、黑曲霉和米曲霉等均能以葡萄糖為碳源積累蘋果酸，尤其使用黃曲霉獲取L-蘋果酸最大積累量可達(dá)100 g/L，但是在其發(fā)酵過程中通常伴有曲霉毒素產(chǎn)生，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[3-6]，因此，研究者開始嘗試使用其它菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸，如劉亞等[7]利用米根霉突變菌株，通過初步優(yōu)化發(fā)酵工藝，以葡萄糖為碳源，經(jīng)72 h發(fā)酵，所得L-蘋果酸積累量達(dá)到了57.71 g/L。同時(shí)，隨著基因工程的發(fā)展，通過基因編輯得到基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的技術(shù)日漸成熟，婁菲等[8]通過敲除大腸桿菌E21中的蘋果酸酶基因maeA和maeB，使得蘋果酸產(chǎn)量提高了36%；陳修來(lái)等[9]通過在釀酒酵母中表達(dá)來(lái)自黃曲霉的丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶以及C4-二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，成功構(gòu)建了L-蘋果酸的合成路徑，使得工程菌能夠積累L-蘋果酸，為相關(guān)合成技術(shù)提供了參考；Dong等[10]通過在大腸桿菌w3110中過表達(dá)pos5基因，增加了NADPH含量，使得最終的L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到9.34 g/L。雖然可通過在大腸桿菌或釀酒酵母等模式菌中過表達(dá)異源的蘋果酸酶基因來(lái)提高L-蘋果酸產(chǎn)量[11]，但因?yàn)椴簧婕熬昊蚪M的改造，其性狀通常難以穩(wěn)定遺傳。另一方面，基因編輯技術(shù)的快速進(jìn)步也為代謝工程改造菌株提供了動(dòng)力，如Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)最初被發(fā)現(xiàn)是細(xì)菌和古細(xì)菌用來(lái)防止外源DNA入侵的一種免疫系統(tǒng)[12-15]，相對(duì)于傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)，Ⅱ型的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有效率高、周期短、操作步驟簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，對(duì)單個(gè)基因的編輯效率最高可達(dá)100%[16]。基于此，本文選取遺傳背景清楚且易于進(jìn)行分子操作的大腸桿菌MG1655，借助CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行代謝工程改造來(lái)積累L-蘋果酸，以期為微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)L-蘋果酸提供參考。

1 試驗(yàn)

1.1 材料及基因改造

1.1.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物及氯化鈉的質(zhì)量濃度分別為10、5、10 g/L，另外，在此基礎(chǔ)上按15 g/L添加瓊脂粉制得LB固體培養(yǎng)基。

M9培養(yǎng)基中Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl及葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為6.78、3、0.5、1、20 g/L，且在使用時(shí)按1%的體積分?jǐn)?shù)添加適量的MgSO4和CaCl2。

1.1.2 酶和試劑

質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒為美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品；DNA Marker、2×ES Taq MasterMix為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸等有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除

本研究所用野生型大腸桿菌MG1655和大腸桿菌DH5α均為本實(shí)驗(yàn)室所保存，質(zhì)粒pTargetF和pCas購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，重組質(zhì)粒和基因敲除菌株均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建?；蚋脑旌蟮拇x途徑如圖1所示，在利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌MG1655進(jìn)行基因敲除之前，需進(jìn)行敲除載體pTargetF-sgRNA的構(gòu)建及同源臂片段的制備。

圖1 大腸桿菌MG1655部分代謝流程圖

在構(gòu)建poxB基因敲除載體時(shí)，以pTargetF質(zhì)粒做模板，以poxB-P1和poxB-P2為引物，通過全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，得到含有poxB 相關(guān)sgRNA的pTargetF，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95 ℃，300 s； 95 ℃，30 s； 58 ℃，30 s；72 ℃，90 s，32個(gè)循環(huán)； 72 ℃，600 s，4 ℃保存。使用DpnⅠ酶進(jìn)行消化，消除pTargetF原始模板，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒，用引物maeA-P3和maeA-P4借助美國(guó)UVP公司GelDoc-It310型凝膠成像儀進(jìn)行PCR鑒定[13]，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pTargetF-poxB。按同樣的方法，分別構(gòu)建pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB和pfkA基因的敲除載體。

在制備poxB同源臂片段時(shí)，以大腸桿菌MG1655基因組為模板，以引物poxB-P5和poxB-P6擴(kuò)增poxB基因的上游同源臂，以引物poxB-P7和poxB-P8擴(kuò)增poxB基因的下游同源臂。然后以poxB-P5和poxB-P8為引物，以上、下游同源臂做模板，通過SOE-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得到上、下游同源臂的融合片段[15]。按同樣方法，利用不同引物分別制備pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB和pfkA基因上、下游同源臂的融合片段。

在敲除載體構(gòu)建完畢并制得同源臂片段后，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌MG1655進(jìn)行基因敲除。首先敲除其poxB基因，獲得M01菌株，具體敲除步驟如下：1)將pCas質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655中，獲得含有pCas 質(zhì)粒的大腸桿菌MG1655菌株(卡那霉素抗性)；2)挑取單菌落接種到含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，之后以1%的接種量轉(zhuǎn)接到25 mL卡那霉素質(zhì)量濃度為50 mg/L的 LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)pCas質(zhì)粒上red蛋白的表達(dá)，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4左右時(shí)，再利用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司J-26XP型高速冷凍離心機(jī)冷凍離心回收菌體并制作用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞；3)利用BIO-RAD公司165-2100型電轉(zhuǎn)化儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化處理。向50 μL感受態(tài)細(xì)胞中加入100 ng pTargetF-poxB重組質(zhì)粒和100 ng目的基因同源片段，混勻后加入經(jīng)預(yù)冷處理、直徑為1 mm的電轉(zhuǎn)杯中，在1.8 kV電壓下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，然后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1 h以復(fù)蘇細(xì)胞；4)最后將菌體接種于含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L壯觀霉素的雙抗性LB固體培養(yǎng)基上，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，獲得M01菌株，回收菌體，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組，利用引物P5/P8進(jìn)行PCR鑒定[17-18]。按照同樣方法，在M01菌株基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除pta-ackA、ldhA、pflB等基因，依次獲得M02、M03和M04菌株，阻斷相關(guān)副產(chǎn)物的合成以積累丙酮酸，增大TCA循環(huán)的通量；然后在M04菌株基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除maeA和maeB基因以防止蘋果酸的消耗[19]，所得菌株依次為M05和M06；最后再敲除M06菌株的pfkA基因得到M07菌株，確保葡萄糖盡可能通過磷酸戊糖途徑代謝，從而產(chǎn)生更多的輔酶NADPH，為合成蘋果酸提供還原力[20]。本研究中所用重組質(zhì)粒及所制基因敲除菌株列于表1，所用引物列于表2。需要指出的是，每一次基因敲除成功后所得菌株會(huì)同時(shí)含有pCas質(zhì)粒和pTargetF重組質(zhì)粒，為了消除這兩個(gè)質(zhì)粒，首先將菌株接種至含有50 mg/L卡那霉素和終濃度為1.0 mmol/L IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃的溫度下，以200 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)8～16 h，再將其涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，檢測(cè)其壯觀霉素抗性，如無(wú)壯觀霉素抗性，則表明pTargetF重組質(zhì)粒已消除，繼續(xù)挑取該單菌落接種于不含抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的溫度下，以200 r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)8～16 h后涂布無(wú)抗性LB固體培養(yǎng)基，挑取單菌落檢測(cè)其卡那霉素抗性，如無(wú)卡那霉素抗性，則表明pCas已消除。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 引物Table 2 Primers

續(xù)表2

1.2 發(fā)酵處理

對(duì)野生型大腸桿菌MG1655及M04、M05、M06、M07菌株分別進(jìn)行有氧搖瓶發(fā)酵處理。將-80 ℃保存的菌株在添加相關(guān)抗生素的LB平板上劃線，挑取單菌落接種到裝有5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃溫度下以200 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，再以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50 mL液體M9培養(yǎng)基的錐形瓶中，在37 ℃溫度下以200 r/min的轉(zhuǎn)速發(fā)酵處理48 h。

在好氧發(fā)酵條件下，以葡萄糖為底物，通過糖酵解或磷酸戊糖途徑生成丙酮酸，之后經(jīng)過TCA循環(huán)氧化生成L-蘋果酸，通過這一途徑，1摩爾葡萄糖可以合成1摩爾L-蘋果酸并釋放出2摩爾的CO2，最大理論得率為100%，得率η的計(jì)算公式為

η=[n(生成的L-蘋果酸)/n(初始葡萄糖)]

×100%

(1)

1.3 細(xì)胞代謝及產(chǎn)物分析

使用UV-2000型紫外分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)量，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm；利用P680型高效液相色譜儀檢測(cè)發(fā)酵液中有機(jī)酸，分析條件為：色譜柱為AcclaimTM120C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1 mol/L的KH2PO4，用H3PO4調(diào)節(jié)液體pH為2.8，進(jìn)樣量為20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm，柱溫為20 ℃，流速為1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體pTargetF-sgRNA的構(gòu)建與鑒定

各個(gè)基因敲除載體pTarget-sgRNA的構(gòu)建及驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示，其中圖2(a)中泳道1到泳道6及圖2(b)中泳道1分別為poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB、pfkA敲除載體的pTargetF-sgRNA全質(zhì)粒PCR檢測(cè)結(jié)果，上述質(zhì)粒片段大小均與pTargetF相應(yīng)值接近，約2000 bp左右；圖2(c)中泳道1到泳道6及圖2(d)中泳道1分別為poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB、pfkA敲除載體的pTargetF-sgRNA全質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果，檢測(cè)上游引物來(lái)自于pTargetF原始載體，下游引物來(lái)自各個(gè)基因相對(duì)應(yīng)的20 bp sgRNA，上下游引物之間片段大小為536 bp。由檢測(cè)結(jié)果可知，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符。對(duì)經(jīng)PCR鑒定的敲除載體進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果表明，含20 bp目的基因的片段已成功克隆至pTargetF載體。

(a)poxB、pta-ackA、ldhA等的檢測(cè)結(jié)果 (b)pfkA的檢測(cè)結(jié)果

(c)poxB、pta-ackA、ldhA等的鑒定結(jié)果 (d)pfkA的鑒定結(jié)果

2.2 上下游同源臂的制備結(jié)果與分析

敲除基因的上下游融合同源臂片段的制備結(jié)果如圖3所示，其中圖3(a)中泳道1到泳道6及圖3(b)中泳道1分別是poxB、pta-ackA、ldhA、pflB、maeA、maeB、pfkA基因的上、下游同源臂的融合片段。由圖3可知，上述同源臂片段大小約為1000 bp，與預(yù)期一致，表明同源片段融合成功。

(a)poxB、pta-ackA、ldhA等的同源臂 (b)pfkA的同源臂

2.3 基因敲除菌株的構(gòu)建結(jié)果與分析

基因敲除菌株利用引物P5/P8進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果見圖4，其中圖4(a)中1泳道到6泳道為以野生型大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板并分別以poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA的P5/P8為引物的PCR鑒定結(jié)果，7泳道到12泳道為以重組菌株大腸桿菌基因組DNA為模板并分別以poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA的P5/P8為引物的PCR鑒定結(jié)果；圖4(b)中第1泳道為以野生型大腸桿菌MG1655基因組DNA為模板并以pfkA的P5/P8為引物的PCR鑒定結(jié)果，第2泳道為以重組菌株大腸桿菌基因組DNA為模板并以pfkA的P5/P8為引物的PCR鑒定結(jié)果。因?yàn)閜oxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA、pfkA等基因的片段大小分別為1719、2284、2280、990、1698、3421、963 bp，基因上下游同源臂的融合片段大小約為1000 bp，若上述基因沒有敲除成功，相應(yīng)擴(kuò)增的片段大小應(yīng)分別為2719、3284、3280、1990、2698、4421、1963 bp，即上下游同源臂加上基因本身片段大?。蝗艋蚯贸晒?，擴(kuò)增的片段大小均為1000 bp左右，即僅僅是上下游同源臂融合片段的大小。由圖4可知，圖4(a)中1泳道到6泳道及圖4(b)中1泳道所示poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA、pfkA基因敲除前擴(kuò)增片段大小與圖4(a)中7泳道到12泳道及圖4(b)中2泳道所示上述基因敲除后的相應(yīng)片段大小之差正好與所敲除基因片段大小相同，這與預(yù)期相符，可以判斷相關(guān)基因已被成功敲除。

(a)以poxB、pflB、maeB等的P5/P8為引物 (b)以pfkA的P5/P8為引物

2.4 發(fā)酵液中有機(jī)酸分析

將野生型大腸桿菌MG1655及M04、M05、M06、M07菌株分別進(jìn)行發(fā)酵處理，在搖瓶發(fā)酵48 h時(shí)對(duì)發(fā)酵液中的丙酮酸、L-蘋果酸、乳酸和乙酸進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。

圖5 發(fā)酵液中有機(jī)酸的檢測(cè)

從圖5中可以看出，對(duì)比野生型大腸桿菌MG1655菌株和菌株M04發(fā)酵處理后的發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，野生型大腸桿菌MG1655菌株發(fā)酵后生成了較多的乳酸和乙酸等副產(chǎn)物，丙酮酸和L-蘋果酸的積累量分別只有0.675、0.812g/L，而菌株M04發(fā)酵液中乳酸和乙酸積累量大量減少，丙酮酸和L-蘋果酸的積累量分別達(dá)到5.621、4.012 g/L。這是因?yàn)榫闙04被敲除了丙酮酸副產(chǎn)物代謝途徑上的4個(gè)基因，造成生成副產(chǎn)物的代謝途徑被阻斷，從而丙酮酸得到了大量積累，同時(shí)，丙酮酸的積累又促進(jìn)了TCA循環(huán)的加速，從而導(dǎo)致TCA循環(huán)中對(duì)應(yīng)的中間產(chǎn)物如L-蘋果酸的積累量也相應(yīng)增加。在菌株M04基礎(chǔ)上敲除基因maeA后，所得菌株M05經(jīng)發(fā)酵處理后，發(fā)酵液中L-蘋果酸的積累量進(jìn)一步增加至7.783 g/L，而丙酮酸的積累量則降低至4.016 g/L，這表明缺少蘋果酸酶maeA催化后，L-蘋果酸生成丙酮酸這一途徑得到了有效的抑制，L-蘋果酸的流失明顯減少。而對(duì)于進(jìn)一步敲除了蘋果酸酶maeB的菌株M06來(lái)說，其發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果顯示L-蘋果酸的積累量相比M05相應(yīng)值并沒有明顯的增加，這應(yīng)該是此時(shí)菌株胞內(nèi)NAD(P)H/NAD(P)+值過低，還原力不足所致。相比菌株M06發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果，菌株M07發(fā)酵液中的丙酮酸積累量有所下降，但L-蘋果酸積累量明顯增加，達(dá)到了9.893 g/L，實(shí)際得率為66%，這是因?yàn)榍贸闙06的pfkA基因后，能改善胞內(nèi)還原力不足的狀況，有效提高胞內(nèi)TCA循環(huán)速率。

2.5 基因敲除對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)影響

以M9培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，檢測(cè)了野生型大腸桿菌MG1655以及經(jīng)基因敲除所得M06、M07菌株在發(fā)酵處理36 h時(shí)的生長(zhǎng)情況及相應(yīng)的葡萄糖消耗量，結(jié)果分別如圖6和圖7所示。結(jié)合圖6和圖7可見，上述3種菌株在發(fā)酵處理36 h時(shí)，M9培養(yǎng)基中的葡萄糖逐漸消耗殆盡，在此期間，三者按生長(zhǎng)速率和葡萄糖消耗速率從大到小的排序?yàn)椋阂吧痛竽c桿菌MG1655、M07、M06菌株。可見相關(guān)基因的敲除對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)造成了一定的影響，相比于野生型大腸桿菌MG1655，菌株M06和M07菌株的生長(zhǎng)速率均有所下降，同時(shí)，由于pfkA基因的敲除使得M07菌株胞內(nèi)氧化還原更加平衡，所以其生長(zhǎng)速率較M06菌株相應(yīng)值更大?？偟膩?lái)說，基于野生型大腸桿菌MG1655，進(jìn)行相關(guān)基因敲除后對(duì)所得M07菌株的生長(zhǎng)影響較小，后者具有成為生產(chǎn)L-蘋果酸的工程菌株的潛力。

圖6 菌株的生長(zhǎng)曲線

圖7 菌株的葡萄糖消耗曲線

3 結(jié)論

(1)以pTargetF質(zhì)粒做模板，借助引物通過全質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，成功構(gòu)建了基因敲除載體pTargetF-sgRNA。以大腸桿菌MG1655基因組為模板，借助引物擴(kuò)增相關(guān)基因的上、下游同源臂，再以相關(guān)基因上、下游同源臂做模板，借助引物通過SOE-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，成功制得相應(yīng)基因上、下游同源臂的融合片段。

(2)在敲除載體構(gòu)建完畢并制得同源臂片段后，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對(duì)野生型大腸桿菌MG1655進(jìn)行基因敲除，依次敲除poxB、pflB、maeB、ldhA、maeA、pta-ackA、pfkA基因后得到菌株M07，經(jīng)好氧發(fā)酵48 h后所得L-蘋果酸積累量為9.893 g/L，得率為66%，相比野生型大腸桿菌MG1655相應(yīng)值明顯增加，且基因敲除對(duì)該菌株的生長(zhǎng)影響不大。