新疆地區(qū)維吾爾族與漢族阿爾茨海默病患者19號(hào)染色體代表性基因位點(diǎn)多態(tài)性及民族差異研究

那扎克提·努爾買買提，馬衣日木·賽買提，哈斯也提·依不來(lái)音

隨著社會(huì)人口老齡化進(jìn)程加劇，阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）發(fā)病率日益增長(zhǎng)，尤其在中低收入國(guó)家其增長(zhǎng)速度更快［1］，且預(yù)計(jì)到2050年全球范圍內(nèi)AD患者數(shù)量將超過(guò)1億，因此AD的早期診斷及治療一直是臨床研究熱點(diǎn)［2-3］。AD是一種常見(jiàn)的可引起老年人認(rèn)知障礙的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，主要分為家族性AD和散發(fā)性AD兩種類型，其中散發(fā)性AD較為常見(jiàn)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，AD已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，其中遺傳是AD多元病因中的重要因素之一［4］，人們通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)19號(hào)染色體上存在數(shù)個(gè)AD相關(guān)易感基因［5］，如載脂蛋白 Eε4、TOMM40、CD33、ABCA7等。因此，深入了解AD相關(guān)基因并尋找更多客觀證據(jù)對(duì)AD的臨床診斷及治療具有至關(guān)重要的作用。本研究分析了新疆地區(qū)維吾爾族與漢族AD患者19號(hào)染色體上ABCA7、TOMM40、CD33、GALP基因位 點(diǎn) rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444、rs3745833多態(tài)性及民族差異，對(duì)深入研究AD的發(fā)病機(jī)制及治療措施具有重要意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年8月—2018年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床神經(jīng)診療中心及烏魯木齊市六道灣醫(yī)院、昌吉市人民醫(yī)院診治的AD患者131例作為病例組，均符合《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版（DSM-Ⅳ）中的癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)：文盲患者簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）評(píng)分≤17分，小學(xué)文化程度患者M(jìn)MSE評(píng)分≤20分，初中及以上文化程度患者M(jìn)MSE評(píng)分≤24分［6］。另選取同期新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的體檢健康者128例作為對(duì)照組。兩組受試者性別、年齡、民族、文化程度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表1）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥65歲；（2）在新疆地區(qū)居住時(shí)間＞10年。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)Hanchinski缺血指數(shù)量表及顱腦影像學(xué)檢查結(jié)果診斷為血管性癡呆患者；（2）因抑郁癥引起的假性癡呆患者；（3）其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、食物/藥物中毒等引起的癡呆患者；（4）合并心、血管、肺、肝、腎等重要組織/器官疾病急性期患者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采集兩組受試者外周靜脈血3 ml。

1.3.2 基因組DNA的提取 使用TIANamp Genomic DNA kit血液DNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)〕提取全血基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 基因測(cè)定 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增測(cè) 序 技 術(shù) 分 析 ABCA7、TOMM40、CD33、GALP基因位點(diǎn)多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因信息來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/），根據(jù)GenBank發(fā)布的序列（代號(hào)：NM_003105）進(jìn)行設(shè)計(jì)，查詢目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)序列，引物序列見(jiàn)表2。委托博淼生物科技（北京）有限公司通過(guò)連接酶檢測(cè)-聚合酶鏈反應(yīng)（LDR-PCR）方法對(duì)ABCA7、TOMM40、CD33、GALP基因的5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

表1 兩組受試者一般資料比較Table 1 Comparison of demographic information between the two groups

表2 19號(hào)染色體代表性基因位點(diǎn)PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences of representative SNPs on chromosome 19

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用haploview軟件計(jì)算單體型基因型頻數(shù)，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的檢驗(yàn)及計(jì)數(shù)資料、單體型基因型比較均采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)照組與病例組 rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444、rs3745833的基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，見(jiàn)表3。

表3 病例組與對(duì)照組基因位點(diǎn)基因型及等位基因分布情況（例）Table 3 Distribution of genotype and allele of SNPs between case group and control group

2.2 基因型及等位基因頻率 對(duì)照組與病例組中漢族受 試 者 rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444基因型、等位基因頻率及rs3745833基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但rs3745833等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表4）。對(duì)照組與病例組中維吾爾族受試者rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444、rs3745833基因型、等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表5）。維吾爾族與漢族AD患者rs2075650、rs3865444、rs3745833基因型、等位基因頻率及rs3826656基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但rs3764650基因型、等位基因頻率及rs3826656等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表6）。

表4 對(duì)照組與病例組中漢族受試者基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較（例）Table 4 Comparison of genotype and allele frequency of SNPs in Han participants between control group and case group

表5 對(duì)照組與病例組中維吾爾族受試者基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較（例）Table 5 Comparison of genotype and allele frequency of SNPs in Uygur participants between control group and case group

表6 漢族與維吾爾族AD患者基因位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較（例）Table 6 Comparison of genotype and allele frequency of SNPs between Han and Uygur participants with AD

2.3 單體型構(gòu)建 19號(hào)染色體上CD33基因rs3826656、rs3865444在漢族受試者、維吾爾族受試者及AD患者中均形成連鎖不平衡，見(jiàn)圖1（高清彩圖見(jiàn)本文OSID碼）。對(duì)照組與病例組中漢族、維吾爾族受試者rs3826656-rs3865444單體型GC、AA、AC基因型頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；漢族與維吾爾族AD患者rs3826656-rs3865444單體型GC、AA基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但維吾爾族AD患者rs3826656-rs3865444單體型AC基因型頻率高于漢族AD患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表 7～9）。

3 討論

散發(fā)性AD發(fā)病年齡較晚（通?！?5歲），病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要包括遺傳、環(huán)境、代謝等多種因素［7］。WANG等［8］研究表明，AD相關(guān)基因顯著富集在19號(hào)染色體上，且染色體區(qū)域19p（Chrl9p）在整個(gè)AD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出非常顯著的擾動(dòng)。本研究旨在分析新疆地區(qū)維吾爾族與漢族AD患者19號(hào)染色體代表性基因位點(diǎn)多態(tài)性及民族差異。

ABCA7基因位于19q13.3，通過(guò)在細(xì)胞膜上形成一種依賴三磷腺苷（ATP）酶的通道而發(fā)揮維持細(xì)胞內(nèi)外膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)膽固醇外流和抑制β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌。既往研究發(fā)現(xiàn)，ABCA7基因位點(diǎn)rs3764650多態(tài)性與AD患者老年斑負(fù)載直接相關(guān)［9］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組與病例組中漢族、維吾爾族受試者rs3764650基因型及等位基因頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但漢族與維吾爾族AD患者rs3764650基因型及等位基因頻率間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示ABCA7基因可能在新疆地區(qū)維吾爾族、漢族AD患者之間存在種族特異性，究其原因可能與兩個(gè)民族人群生活習(xí)慣、民族背景等不同有關(guān)。CUKIER等［10］研究表明，非裔美國(guó)人中ABCA7等位基因形成連鎖不平衡并表現(xiàn)出種族特定的致病性改變。

圖1 CD33基因rs3826656-rs3865444單體型分布的連鎖不平衡圖Figure 1 Linkage disequilibrium diagram for haplotypes of CD33 gene rs3826656-rs3865444

表7 對(duì)照組與病例組中漢族受試者rs3826656-rs3865444單體型基因型頻率比較〔n（%）〕Table 7 Comparison of genotypic frequency of rs3826656-rs3865444 haplotypes in Han participants between control group and case group

表8 對(duì)照組與病例組中維吾爾族受試者rs3826656-rs3865444單體型基因型頻率比較〔n（%）〕Table 8 Comparison of genotypic frequency of rs3826656-rs3865444 haplotypes in Uygur participants between control group and case group

表9 漢族與維吾爾族AD患者rs3826656-rs3865444單體型基因型頻率比較〔n（%）〕Table 9 Comparison of genotypic frequency of rs3826656-rs3865444 haplotypes between Han and Uygur participants with AD

TOMM40基因位于19q13，與載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）相鄰，其中幾個(gè)SNP與ApoE基因形成連鎖不平衡［11］。TOMM40是在蛋白進(jìn)入線粒體的重要入口通道形成的亞基，對(duì)蛋白質(zhì)導(dǎo)入線粒體而言必不可少，與AD密切相關(guān)，其可變長(zhǎng)度的多態(tài)性?？深A(yù)測(cè)遲發(fā)型AD患者的年齡［12］。MA等［13］通過(guò)分析TOMM40基因3個(gè)SNP位點(diǎn)（rs157580、rs2075650、rs11556505）多態(tài)性與中國(guó)北方漢族遲發(fā)型AD患者的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，rs157580、rs2075650、rs11556505多態(tài)性可能參與中國(guó)北方漢族遲發(fā)型AD的發(fā)病過(guò)程。但本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組與病例組中漢族、維吾爾族受試者rs2075650基因型及等位基因頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，漢族與維吾爾族AD患者rs2075650基因型及等位基因頻率間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示新疆地區(qū)漢族及維吾爾族TOMM40基因位點(diǎn)rs2075650多態(tài)性與AD發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。

CD33基因位于19q13.3，可編碼Siglecs，屬于Ⅰ型膜蛋白家族成員，常表達(dá)于紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞及神經(jīng)元，其表達(dá)下調(diào)可使腦內(nèi)促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）水平升高并促進(jìn) AD 發(fā)?。?4］。BERTRAM 等［15］于2008年通過(guò)GWAS發(fā)現(xiàn)CD33基因位點(diǎn)rs3826656與AD發(fā)病相關(guān)。一篇關(guān)于高加索人群的研究發(fā)現(xiàn)，CD33基因位點(diǎn)rs3865444的（A）等位基因?yàn)锳D的保護(hù)因素［16］。毛艷芳等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CD33基因位點(diǎn)rs3826656和rs3865444的G等位基因可能是中國(guó)散發(fā)性AD的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。本研究結(jié)果顯示，病例組中漢族、維吾爾族受試者CD33基因rs3826656、rs3865444基因型及等位基因頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，漢族與維吾爾族AD患者rs3826656基因型頻率及rs3865444基因型、等位基因頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但漢族與維吾爾族AD患者rs3826656等位基因頻率間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，rs3826656-rs3865444存在較高連鎖不平衡，提示新疆地區(qū)漢族與維吾爾族CD33基因位點(diǎn)rs3826656多態(tài)性存在差異，但需進(jìn)一步完善維吾爾族與對(duì)照組健康體檢者間的研究以排除種族帶來(lái)的偏差。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)GALP基因的研究甚少。GALP是一種參與機(jī)體能量代謝的神經(jīng)肽，其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，可參與學(xué)習(xí)和記憶、神經(jīng)損傷修復(fù)和保護(hù)等多種生理過(guò)程，進(jìn)而可能在AD、癲癇、神經(jīng)性疼痛、抑郁癥等多種疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮潛在作用［18］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組與病例組中維吾爾族受試者及漢族與維吾爾族AD患者GALP基因位點(diǎn)rs3745833基因型、等位基因頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)照組與病例組中漢族受試者rs3745833基因型頻率間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但rs3745833的G/C等位基因頻率間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示GALP基因位點(diǎn)rs3745833多態(tài)性可能與新疆地區(qū)漢族人群AD發(fā)病有關(guān)。

綜上所述，GALP基因位點(diǎn)rs3745833多態(tài)性可能與新疆地區(qū)漢族人群AD發(fā)病有關(guān)，ABCA7基因位點(diǎn)rs2075650、CD33基因位點(diǎn)rs3826656多態(tài)性在新疆地區(qū)維吾爾族與漢族AD患者中存在差異。但本研究納入樣本量較小，患者來(lái)源局限，不能很好地代表新疆地區(qū)，因此民族間的基因差異仍有待大樣本量研究進(jìn)一步證實(shí)。

志謝：感謝烏魯木齊市六道灣醫(yī)院、昌吉市人民醫(yī)院在本研究病例收集過(guò)程中給予的大力支持與幫助。

作者貢獻(xiàn)：那扎克提·努爾買買提、哈斯也提·依不來(lái)音進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析；那扎克提·努爾買買提進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，并負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；那扎克提·努爾買買提、馬衣日木·賽買提進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析及論文的修訂；哈斯也提·依不來(lái)音負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。