Stanford A型主動脈夾層患者主動脈壁中簇集素的表達(dá)水平及其臨床意義▲

霍 博 蔣丁勝 魏 翔 劉立剛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心臟大血管外科，湖北省武漢市 430000，電子郵箱：huobo1992@foxmail)

主動脈夾層是指主動脈內(nèi)膜破裂后，主動脈腔內(nèi)的血液從破口進(jìn)入主動脈中膜，并沿主動脈長軸方向擴(kuò)展，導(dǎo)致血管壁分層形成“雙腔主動脈”。主動脈夾層是一類發(fā)病急、病情復(fù)雜多變、進(jìn)展迅速、預(yù)后差、誤診率及病死率高的心血管疾病，許多患者的主動脈夾層隨著病情進(jìn)展逐步擴(kuò)張最終導(dǎo)致血管破裂[1]。因其發(fā)病機制復(fù)雜，除外科手術(shù)和介入治療外，目前主動脈夾層并無有效的保守治療方案，因此進(jìn)一步深入研究主動脈夾層的發(fā)病機制及防治策略具有重要的理論和臨床意義。

簇集素(Clusterin)是由Blaschuk等[2]于1983年在山羊睪丸液中發(fā)現(xiàn)的一種分泌糖蛋白。近年來的研究表明，Clusterin蛋白在心血管疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，在中國人群中血清Clusterin的表達(dá)水平與早期冠狀動脈疾病發(fā)生密切相關(guān)[3]。Clusterin蛋白可以與血漿HDL和極高密度脂蛋白相結(jié)合[4]，廣泛分布于人體多種組織，參與體內(nèi)多種生理功能，如脂類交換和運輸、補體作用的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖，與干眼癥、阿爾茨海默病、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等疾病的發(fā)生都密切相關(guān)[5-7]。目前未見關(guān)于Clusterin與主動脈夾層關(guān)系的研究報道。因此，本研究通過檢測主動脈夾層患者主動脈壁中Clusterin的表達(dá)，分析其對主動脈夾層發(fā)生的影響，并探討其作為潛在治療靶點的可能性。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 樣本來源于2017年至1月至2019年4月間在我院心臟大血管外科進(jìn)行手術(shù)的9例擴(kuò)張型心肌病或冠心病患者(對照組)和13例Stanford A型主動脈夾層患者(病例組)。對照組主動脈壁組織在心臟移植術(shù)中獲得，病例組主動脈壁組織在血管置換術(shù)中獲得，兩組的樣本均取自升主動脈部分。所有主動脈夾層患者術(shù)前均經(jīng)計算機斷層掃描血管造影明確診斷。對照組擴(kuò)張型心肌病經(jīng)超聲心動圖檢查有心腔擴(kuò)大與心臟收縮功能減低，并排除其他特異性病因引起的心臟擴(kuò)大確診。冠心病患者經(jīng)冠狀動脈造影檢查確診。兩組均排除合并馬凡氏綜合征、創(chuàng)傷性或醫(yī)源性主動脈夾層、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等患者。所有涉及人體組織樣本的采集程序均符合世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言的原則，均獲得患者本人或家屬的知情同意。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 資料收集 收集所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、既往史等。

1.3 主要儀器與試劑 BX53光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，CFX Connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。伊紅染液(批號：G1002)、蘇木精染液(批號：G1004)、EVG染色試劑盒(批號：G1042)均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；TRIzol Reagent購自美國Life Technologies公司(批號：15596018)； Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國羅氏公司(批號：4896866001)； ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司(批號：Q711-02)；放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液(批號：P0013)、苯甲基磺酰氟(批號：ST505)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白上樣緩沖液(5×)(批號：P0015L)均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸蛋白質(zhì)定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：23225)，聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司(批號：IPVH00010)，Clusterin一抗購自美國CST公司(批號：34642)，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Jackson ImmunoResearch公司(批號：111-035-003)；丙烯酰胺免染制膠試劑盒(批號：1610183)、ECL化學(xué)發(fā)光底物(批號：170-5061)均購自美國Bio-Rad公司。

1.4 蘇木精-伊紅染色和EVG彈性纖維染色 術(shù)中獲得主動脈組織樣本后，取部分組織立即置于10%福爾馬林中固定。經(jīng)脫水、固定、石蠟包埋等處理，并將主動脈壁橫向切成5 μm厚的石蠟切片，按照標(biāo)準(zhǔn)流程將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和EVG彈性纖維染色。蘇木精染液主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色，伊紅染液主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色；EVG彈性纖維染色顯示彈力纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色。

1.5 Clusterin基因表達(dá)檢測 取凍存主動脈壁組織約100 mg，采用TRIzol法提取總mRNA后，使用oligo(dT)引物和Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，將所得cDNA產(chǎn)物按1 ∶5體積比稀釋后作為模板，采用實時定量PCR檢測Clusterin基因mRNA的表達(dá)水平。Clusterin的上游引物為5′-AGATCTTGTCTGTGGACTGTTC-3′，下游引物為5′-GTATTTCCTGGTCAACCTCTCA-3′；以18 s核糖體為內(nèi)參基因，上游引物為5′-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3′，下游引物為5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′。取ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL、 上下游引物各0.5 μL、模板cDNA 2 μL和ddH2O 2 μL制備反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，記錄PCR儀返回的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算病例組主動脈壁組織中Clusterin表達(dá)量的倍數(shù)。先分別計算兩組各樣本目的基因的ΔCt，ΔCt1=CtClusterin-Ct18 s；再計算出對照組目的基因ΔCt的均值ΔCt2；分別計算兩組各樣本相對于ΔCt2的ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt1-ΔCt2；最后利用2-ΔΔCt計算出兩組個樣本Clusterin的相對表達(dá)量。

1.6 Clusterin蛋白表達(dá)檢測 取凍存主動脈壁組織約100 mg，將組織剪碎后進(jìn)行研磨。采用RIPA裂解緩沖液提取主動脈壁組織中的總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白質(zhì)定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)將24 μg總蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上(恒壓80 V，電泳2 h)后，將膜置于5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，置于含有相應(yīng)一抗的抗體稀釋液(1 ∶1 000)中4℃孵育過夜；次日用含0.1% Tween 20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3次，5 min/次；隨后加入相應(yīng)堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1 ∶20 000)，室溫下孵育1 h；用含0.1% Tween 20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜3次，5 min/次；加入顯影液立即顯影，在成像系統(tǒng)中檢測蛋白信號。Clusterin有不同剪切體，分子量大小分別為32 000、52 000、53 000，故在蛋白圖像上會顯示3個條帶。按丙烯酰胺免染制膠試劑盒說明書制膠后在250 V電壓下電泳30 min，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)選擇蛋白質(zhì)凝膠免染膠成像模式激活2.5 min后得到樣品的總蛋白條帶；用Image Lab軟件檢測每條泳道的所有蛋白條帶將總蛋白歸一化定量，以Clusterin與總蛋白比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平[8]。

1.7 免疫組化染色 將未經(jīng)染色的石蠟切片置于65℃烤箱中1 h，常規(guī)二甲苯浸洗切片3次進(jìn)行脫蠟；梯度酒精水合，雙蒸水漂洗，微波爐中進(jìn)行檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，置于3% H2O2中孵育20 min，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次；8%山羊血清室溫封閉1 h，滴加Clusterin一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜，次日用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，二抗(1 ∶500)室溫孵育30 min，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次后行二氨基聯(lián)苯胺顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。用Image J圖像處理軟件測定主動脈壁組織Clusterin的平均光密度值，其表達(dá)水平以圖像3個陽性區(qū)積分光密度的平均值表示。

1.8 主動脈直徑測量 在病例組患者的計算機斷層掃描血管造影圖像中分別測量氣管分叉處升主動脈、主動脈弓、降主動脈以及腹腔干處主動脈直徑最大值[9]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣體t檢驗或t′檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(Q)]表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行線性相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般資料的比較 病例組患者的收縮壓、合并高血壓比例均高于對照組(均P<0.05)；兩組患者其余各指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者的一般資料的比較

2.2 HE染色與EVG染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，對照組主動脈壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則；病例組患者主動脈壁中層細(xì)胞明顯減少，平滑肌細(xì)胞排列紊亂。EVG染色結(jié)果顯示，對照組主動脈壁中彈力纖維完整無明顯斷裂，而主動脈夾層患者主動脈壁中彈力纖維有所減少且斷裂明顯。見圖1。

圖1 兩組主動脈壁組織HE和EVG染色結(jié)果(×400)

2.3 兩組Clusterin mRNA的表達(dá)比較 病例組Clusterin mRNA的相對表達(dá)水平為[3.718(11.320)]，對照組為[0.053(1.330)]；病例組Clusterin mRNA的相對表達(dá)水平高于對照組(z=-2.104，P=0.035)。

2.4 兩組Clusterin蛋白的表達(dá) 病例組32 000、52 000、53 000 Clusterin蛋白的相對表達(dá)水平分別為(1.865±0.686)、(0.970±0.282)、(2.429±0.893)，對照組32 000、52 000、53 000 Clusterin蛋白的相對表達(dá)水平分別為(1.000±0.426)、(1.000±0.145)、(1.000±0.761)；病例組32 000、53 000 Clusterin蛋白表達(dá)水平均高于對照組(t=3.348，P=0.003；t=3.911，P=0.001)，而52 000 Clusterin蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.292，P=0.773)。見圖2。

圖2 兩組主動脈壁組織Clusterin蛋白的表達(dá)水平

2.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 結(jié)果顯示，Clusterin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中。病例組多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見有明顯的棕染顆粒沉著，對照組主動脈壁中僅有少量Clusterin的表達(dá)；病例組Clusterin的相對表達(dá)水平為(10.391±0.524)，高于對照組的(0.737±0.110) (t=64.409，P=0.001)。見圖3。

圖3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

2.6 病例組Clusterin mRNA表達(dá)水平與各主動脈直徑的相關(guān)性 病例組患者主動脈壁Clusterin mRNA的表達(dá)水平與降主動脈、腹腔干處主動脈直徑均呈正相關(guān)(均P<0.05)。見圖4。

圖4 病例組患者主動脈壁Clusterin mRNA表達(dá)水平與各主動脈直徑的相關(guān)性

3 討 論

Clusterin在人體精液、尿液、乳液等多種體液以及心、腦、肝、腎等多種組織器官中均有表達(dá)，且該蛋白質(zhì)有不同的分型，包括分泌型和核型[10-11]。有研究顯示，分泌型Clusterin具有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用[12]，如在肺動脈高壓大鼠模型中，分泌型Clusterin的表達(dá)水平顯著升高；且分泌型Clusterin能通過調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2信號通路來促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制其凋亡[13]。在動脈粥樣硬化或損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生過程中，Clusterin的表達(dá)均增加，而敲除Clusterin基因能顯著抑制通過敲除載脂蛋白E基因而誘導(dǎo)形成的動脈粥樣硬化斑塊[14]，但通過腺病毒在主動脈中過表達(dá)Clusterin可抑制主動脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制球囊損傷誘導(dǎo)的主動脈內(nèi)膜增生[15]。由此可見，Clusterin在血管性疾病中發(fā)揮重要作用，且在血管損傷過程中會代償性升高。本研究結(jié)果顯示，在主動脈夾層患者的主動脈壁中，Clusterin mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，且Clusterin mRNA的相對表達(dá)水平與降主動脈和腹腔干處主動脈直徑呈正相關(guān)性，提示Clusterin表達(dá)升高可能不僅參與主動脈夾層的發(fā)生，還與主動脈擴(kuò)張的進(jìn)展相關(guān)。

目前認(rèn)為，主動脈夾層的基礎(chǔ)病理變化與主動脈中層退行性變有關(guān)。主動脈中層退行性變致使主動脈中層彈力纖維斷裂、發(fā)生中層空泡變性，并出現(xiàn)大量蛋白聚糖和黏多糖等胞外基質(zhì)成分聚集[16]。此外，主動脈夾層中層退行性變還包括因平滑肌細(xì)胞凋亡和過度自噬而導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞丟失[17]。分泌型Clusterin是一種細(xì)胞保護(hù)的分子伴侶，具有抗凋亡的作用，但核型Clusterin的表達(dá)上調(diào)卻是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志[18]。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，在主動脈夾層患者主動脈壁中，Clusterin蛋白的表達(dá)顯著升高，且Clusterin主要定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中，提示在主動脈中主要表達(dá)的是分泌型Clusterin。因此，我們認(rèn)為主動脈夾層患者主動脈壁組織中分泌型Clusterin表達(dá)上調(diào)很可能是一種代償性升高，并不能夠逆轉(zhuǎn)主動脈夾層患者的細(xì)胞損傷。

主動脈夾層發(fā)生的分子機制是近年的研究熱點。有研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)信號通路在主動脈夾層的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用[19]，其主要通過調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡參與主動脈夾層的病理過程；此外，TGF-β2、轉(zhuǎn)化生長因子β受體(transforming growth factor β receptor,TGFBR)1、TGFBR2、信號傳導(dǎo)蛋白Smad3以及Smad4的基因突變均可導(dǎo)致主動脈夾層的發(fā)生[20]。TGF-β1能誘導(dǎo)Clusterin蛋白的表達(dá)升高[21]，而升高的Clusterin可與TGFBR2結(jié)合，增加TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3轉(zhuǎn)錄活性并增加Smad2/3蛋白表達(dá)；此外，Clusterin可通過正反饋調(diào)控Smad2/3蛋白的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)TGF-β信號通路[22]。炎癥是參與主動脈夾層發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，有研究報告，Clusterin能夠調(diào)控核因子κB的轉(zhuǎn)錄活性，參與炎癥信號通路的調(diào)節(jié)[23]。Clusterin參與調(diào)節(jié)TGF-β信號通路和炎癥信號通路，而TGF-β和炎癥信號通路與主動脈夾層發(fā)生相關(guān)，由此推測Clusterin升高對主動脈夾層的發(fā)生可能有影響。

此外，有研究報告，高血壓是主動脈夾層發(fā)生的主要危險因素之一[24]，而本研究結(jié)果也顯示，病例組患者的收縮壓、合并高血壓比例均高于對照組，與既往文獻(xiàn)報道一致。

綜上所述，在急性Stanford A型主動脈夾層患者的主動脈壁中Clusterin表達(dá)水平升高，且其表達(dá)水平與主動脈夾層患者的降主動脈直徑、腹腔干處主動脈直徑呈正相關(guān)。但調(diào)控Clusterin表達(dá)水平升高的分子機制有待進(jìn)一步闡明，且Clusterin對主動脈夾層的發(fā)生有何影響，以及何種分子機制參與其中，這些問題均有待更深入的研究加以證實。