牛蒡苷元通過(guò)OPG/RANKL信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)去卵巢大鼠骨量流失的保護(hù)作用

陳麗英 郭遠(yuǎn)學(xué) 陳洪嬌 袁偉 王玉蕓

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102

骨質(zhì)疏松癥是一種在絕經(jīng)后婦女和老年人中常見(jiàn)的代謝性疾病。這種疾病的特點(diǎn)是無(wú)癥狀情況下出現(xiàn)骨量丟失，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。迄今為止，用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松癥的藥物雖然表現(xiàn)出一定臨床療效，但是一些藥物嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括使用雌激素可增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，以及長(zhǎng)期使用雙膦酸鹽藥物引起下頜骨壞死和胃腸道反應(yīng)限制臨床療效提高[3]。因此，骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療所需藥物亟待開發(fā)或者改進(jìn)。植物雌激素是一類分子結(jié)構(gòu)類似于17-雌二醇的化合物，與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮部分雌激素作用。由于植物雌激素可以抑制雌激素信號(hào)，因此已成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在治療熱點(diǎn)[4]。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，植物雌激素可分為異黃酮和木質(zhì)素。牛蒡苷元(Arctigenin，AGN)是一種木質(zhì)素植物雌激素，具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗纖維化[7]和抗腫瘤[8]等功效。鑒于AGN類雌激素特性以及具有抗炎抗氧化作用，我們假設(shè)AGN具有抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥作用。研究旨在探討AGN對(duì)去卵巢大鼠模型抗骨質(zhì)疏松作用，并揭示其作用的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 模型建立和藥物治療

3月齡雌性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)買于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)在12 h光暗循環(huán)，溫度控制在(22±2) ℃和濕度控制在50%～60%且可以自由接觸食物和水的環(huán)境中。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行背側(cè)雙側(cè)去卵巢術(shù)(OVX)或假手術(shù)(Sham)[9]，并將大鼠在正常條件下飼養(yǎng)。然后將大鼠分成3組，每組10只：Sham組、OVX組、AGN組[OVX大鼠術(shù)后第3天開始給予牛蒡苷元40 mg/(kg.d) 治療，牛蒡苷元購(gòu)于Sigma-St. Louis, MO, USA]。藥物干預(yù)治療12周后，過(guò)量麻醉藥物處死大鼠，解剖出雙側(cè)股骨和收集血液樣本用于檢測(cè)。

1.2 血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè)

用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的AKP(A059-1)試劑盒測(cè)定血清中堿性磷酸酶(AKP，A059-1)。抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP，R052-2)檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(R&D Systems Inc.，美國(guó))。所有檢測(cè)均按廠家說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 Micro-CT檢測(cè)

使用SCAN-CO Medical micro-CT(SCANCO Medical AG, Zurich, Switzerland)掃描大鼠左側(cè)股骨。使用VG Studio 2.1 V軟件(版本2.6)對(duì)股骨進(jìn)行掃描，并對(duì)18 μm(像素)管電壓為80 kV且電流為60μA的X射線進(jìn)行成像。在180 °的范圍內(nèi)總共獲取了450個(gè)投影。使用基于Feldkamp算法(Sky Scan)的錐束重建軟件重建圖像切片。從生長(zhǎng)板末端起近0.3 mm開始，選擇2 mm作為目標(biāo)區(qū)域。通過(guò)使用CT分析儀軟件繪制定制輪廓來(lái)提取皮質(zhì)骨。獲得骨密度(BMD)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、小梁數(shù)(Tb.N)、小梁分離度(Tb.Sp)，來(lái)形成Micro-CT的3D渲染圖像。3D參數(shù)基于對(duì)具有渲染表面的行進(jìn)立方體類型模型的分析。

1.4 股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)

對(duì)大鼠股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲以確定股骨最大負(fù)荷和剛度。簡(jiǎn)短地說(shuō)，將左側(cè)股骨放在力學(xué)測(cè)試裝置上。將股骨放在支架的中間位置，以10 mm/min的持續(xù)測(cè)試速度加載直到股骨骨折。記錄數(shù)據(jù)，最后進(jìn)行分析以獲得極限載荷(N)和剛度(N/mm)。

1.5 組織學(xué)觀察

右股骨在室溫下于4%中性福爾馬林緩沖液中固定過(guò)夜，并在進(jìn)行組織學(xué)分析前用10%EDTA脫鈣28 d。脫鈣骨的石蠟切片厚度為4 μm。進(jìn)行Masson染色以檢查骨組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 WB檢測(cè)

右側(cè)股骨在液氮中粉碎后，用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒定量測(cè)定蛋白濃度。將蛋白與加載緩沖液混合，在100 ℃煮沸5 min，使其變性。用15 %SDS-PAGE分離50 μg總蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后，將膜分別與一抗：OPG及RANKL在4 ℃孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL試劑(美國(guó)Thermo Scientific)顯影印跡。使用GAPDH進(jìn)行歸一化。用Image J軟件測(cè)量各蛋白條帶的總和密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0軟件進(jìn)行?；诜讲詈蛅檢驗(yàn)比較兩個(gè)不同組間差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡苷元治療12周對(duì)骨代謝指標(biāo)的影響

圖1顯示了AGN治療對(duì)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的影響。與Sham組相比，OVX組AKP和TRACP水平顯著升高(P<0.05)。與OVX組相比，AGN組骨代謝指標(biāo)AKP和TRACP水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 AGN治療對(duì)骨代謝指標(biāo)的影響注：和Sham組比較，##P<0.05；和OVX組比較，■■P<0.05。Fig.1 Effect of AGN treatment on the bone metabolism indexes

2.2 Micro-CT分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2 A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖2B～F所示。OVX組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。AGN組左側(cè)股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測(cè)結(jié)果注：a Sham組，b OVX組，c AGN組；和Sham組比較，##P<0.05；和OVX組比較，■■P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.3 股骨組織病理學(xué)

股骨干骺端骨小梁的Masson染色如圖3所示，Sham組顯示股骨干骺端骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)正常。OVX組表現(xiàn)為疏松均勻的骨小梁變薄，導(dǎo)致骨小梁間隙變寬。AGN組骨小梁數(shù)量和連接增加明顯，表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

圖3 三組股骨的組織病理學(xué)注：A Sham組，B OVX組，C AGN組；Masson染色(10×)。Fig.3 Histopathology of femurs from the three groups

2.4 股骨的生物力學(xué)變化

股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)表明，Sham組的極限載荷和剛度均高于OVX組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AGN組的極限載荷和剛度均高于Mod組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)結(jié)果Table 1 results of three-point bending

2.5 WB分析

和Sham組比較，OVX組OPG表達(dá)水平明顯下調(diào)，而RANKL表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，和OVX組比較，AGN組OPG表達(dá)水平明顯上調(diào)，而RANKL表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 使用WB檢測(cè)OPG、RANKL和GAPDH的相對(duì)表達(dá)注：和Sham組比較，##P<0.05；和OVX組比較，■■P<0.05。Fig.4 Relative expression of OPG and RANKL to GAPDH use Western blotting

3 討論

本研究使用去卵巢大鼠模型證實(shí)了AGN能減少去卵巢大鼠骨量流失，降低骨轉(zhuǎn)換(AKP和TRACP)水平，提高骨密度和骨強(qiáng)度，提示AGN能改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。AGN存在于一系列用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性疾病和感染的藥用植物中[5]。體內(nèi)和體外研究顯示AGN能抑制破骨細(xì)胞分化，這有利于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥的治療[10]。有學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)成骨細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的共培養(yǎng)，AGN顯著抑制破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的形成[11]。本研究證實(shí)AGN可減少去卵巢大鼠骨量丟失可能是通過(guò)改善骨代謝，從而改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

眾所周知，雌激素缺乏是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥)的主要危險(xiǎn)。雙側(cè)去卵巢導(dǎo)致子宮濕重、股骨干重、BMD、骨生物力學(xué)強(qiáng)度和骨量顯著降低，這些變化是由于雌激素缺乏引起的[12]。在過(guò)去的幾十年中，去卵巢大鼠被確認(rèn)為雌激素缺乏誘導(dǎo)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的有力動(dòng)物模型[13]。由于去卵巢大鼠骨骼發(fā)育與人類骨骼發(fā)育高度相似，因此被廣泛使用[14]?？傊?，使用去卵巢大鼠模型可評(píng)估AGN在治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中的作用。更重要的是，本研究采用經(jīng)典的去卵巢模型，可以更全面地驗(yàn)證分子AGN對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥作用和機(jī)制。

根據(jù)OVX大鼠的骨吸收和骨形成指標(biāo)改變，本研究表明AGN能顯著降低血清AKP和TRACP的作用，表明成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性均被降低。但是，本研究更加關(guān)注藥物在抑制骨吸收方面的功效。為了觀察松質(zhì)骨的骨表面重塑改變，本研究使用Micro-CT檢測(cè)了骨組織形態(tài)學(xué)以解釋BMD的變化。BV/TV是評(píng)估重要的骨量和骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th是評(píng)估小梁骨和骨吸收的主要微觀結(jié)構(gòu)變化指標(biāo)。用AGN治療12周可降低因BV/TV、Tb.Th和Tb.N升高以及Tb.Sp.降低引起的骨質(zhì)流失。該結(jié)果表明AGN通過(guò)抑制骨吸收改善了小梁骨的微觀結(jié)構(gòu)。與假設(shè)一致的是，AGN處理可以顯著改善極限載荷和剛度。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在調(diào)節(jié)骨重建中起關(guān)鍵作用[15]。RANK是一種位于破骨細(xì)胞表面的受體[16]。RANK的配體是OPG和RANKL，它們主要由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成和分泌[17]。RANKL激活RANK，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨吸收。RANKL的誘餌受體OPG阻斷了這種相互作用。藥物阻斷RANKL是治療骨質(zhì)疏松癥的有效方法，證實(shí)了OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的作用。如果配體與OPG結(jié)合，阻斷了OPG與RANK的結(jié)合，從而減弱了配體對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用。另一方面，如果配體與RANKL聯(lián)合抑制RANKL和RANK的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和增殖，則表現(xiàn)為抑制骨吸收。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，AGN上調(diào)OPG表達(dá)同時(shí)下調(diào)RANKLE表達(dá)，調(diào)控OPG/RANKL比率來(lái)改善骨形成和骨吸收失衡，最終達(dá)到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效。

綜上，牛蒡苷元治療對(duì)去卵巢大鼠骨量流失起到保護(hù)作用，而這種效果可能通過(guò)調(diào)控OPG/RANKL信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。