紅景天甙聯(lián)合碳酸鈣對老年雌性大鼠骨量、骨代謝和氧化應(yīng)激水平影響

張翔 顏衛(wèi)文 王雅純

1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?570100 2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570100 3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科/老年科，海南 ?？?570100

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種全身性疾病，其特征在于骨基質(zhì)和礦物質(zhì)的減少，導(dǎo)致骨小梁的破壞和破裂以及骨的脆性增加，從而降低生物力學(xué)性質(zhì)[1]。隨著年齡的增加，人體對鈣的吸收隨著成骨細(xì)胞產(chǎn)生的減少而減少，導(dǎo)致骨質(zhì)流失逐漸增加，最終導(dǎo)致OP的發(fā)生[2]。預(yù)防和治療OP包括攝取足夠的維生素D和鈣，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動和其他生活方式干預(yù)措施[3]。紅景天甙是紅景天根的活性成分，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗癌、抗氧化等[4-5]。近年來的研究表明，紅景天甙對雌激素缺乏引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥有保護(hù)作用[6]。然而，沒有關(guān)于紅景天甙與碳酸鈣結(jié)合預(yù)防和治療OP的報(bào)道。因此，本研究旨在通過在老年雌性大鼠中采用紅景天甙與碳酸鈣結(jié)合，觀察其對骨密度、骨礦物質(zhì)和氧化應(yīng)激的影響，為臨床預(yù)防和治療OP提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇10只年齡為3個(gè)月，體重180～250 g的雌性無特定病原體(SPF)Sprague-Dawley(SD)大鼠作為對照組。選取40只年齡為24個(gè)月的雌性SPF SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)組。50只實(shí)驗(yàn)動物購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心(編號SCXK 2012-000)。將大鼠飼養(yǎng)在塑料籠中，控制溫度和光照周期(24 ℃和12/12光周期)，濕度為40%并自由飲食。該研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器

碳酸鈣、紅景天甙(Sigma-Aldrich，San Francisco，CA，USA)；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，南京)。雙能X射線吸收測定儀(Hologic，Marlborough，MA，USA)；全自動生化分析儀(深圳市邁瑞生物醫(yī)藥電子有限公司)；連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀(Tecan，Salzburg，Austria)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

40只老年雌性SPF大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，然后隨機(jī)分成4組，每組10只動物，即模型組(OP組)，紅景天甙組(H組)，碳酸鈣組(Ca組)和紅景天甙聯(lián)合碳酸鈣組(H+Ca組)，10只3月齡大鼠作為對照組(NC組)。所有大鼠在SPF系統(tǒng)中飼養(yǎng)，飼喂普通飼料，并在實(shí)驗(yàn)過程中自由飲食。H組大鼠每天一次用20 mg/kg紅景天甙灌胃給藥; Ca組大鼠每天一次灌胃給予20 mg/kg碳酸鈣；H+Ca組大鼠每天一次用20 mg/kg紅景天甙和20 mg/kg碳酸鈣灌胃給藥；NC和OP組大鼠每天灌胃生理鹽水連續(xù)12周。

1.4 測量骨密度

在最后一次胃內(nèi)給藥結(jié)束后，給大鼠禁食8 h。大鼠稱重后，腹膜內(nèi)注射50 mg/kg 2%戊巴比妥鈉用于麻醉。將大鼠的四肢固定，通過雙能X射線吸收測定法測量腰椎(L4-L6)和雙側(cè)股骨的骨密度。

1.5 檢測血清指標(biāo)

測量骨密度后，從腹主動脈抽取血液，并在4 ℃以1 200 r/min離心10 min。分離血清并在-80 ℃冰箱中冷凍保存。血清樣品使用ELISA試劑盒(Blue Gene，China)測量血清I型膠原C端肽(CTX-1)、骨鈣素、堿性磷酸酶(ALP)、I型前膠原N端肽(PINP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)。按照檢測試劑和說明檢測血清SOD、MDA和GSH-Px。通過連續(xù)波長多功能酶分析儀在550 nm處測量各組SOD的含量；在532 nm處測定各組的MDA含量，在412 nm處檢測各組GSH-Px含量。

1.6 骨礦物質(zhì)含量的測定

分離大鼠的左股骨，并除去附著的軟組織。將股骨在110 ℃的烘箱中烤至48 h至恒重。通過分析天平稱量骨骨干重，并計(jì)算骨干重與體重的比率。然后，將股骨在室內(nèi)型電阻爐中700 ℃下焚燒6 h。通過分析天平對灰分重量進(jìn)行加權(quán)，并計(jì)算骨灰重量與體重和骨灰重量與骨干重(%)的比率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；通過SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)用于兩組之間的比較，并且單因素方差分析(ANOVA)用于多組之間的比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度的變化

與NC組相比，OP、H、Ca組大鼠腰椎和雙側(cè)股骨骨密度明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠腰椎和雙側(cè)股骨骨密度明顯增加(P<0.05)；與H、Ca組比較，H+Ca組大鼠腰椎和雙側(cè)股骨骨密度明顯升高(P<0.05)；H+Ca組和NC組骨密度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，紅景天甙和碳酸鈣均可顯著改善老年大鼠的骨密度，并且聯(lián)合使用顯示出更顯著的效果，見表1。

表1 各組大鼠腰椎和雙側(cè)股骨的骨密度比較

2.2 每組大鼠的骨礦物質(zhì)代謝比較

與NC組比較，OP組骨干重、骨干重與體重比、骨灰重、骨灰重與體重比顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠的這些指標(biāo)均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與H組和Ca組相比，H+Ca組大鼠的這些指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)；H+Ca和NC組間這些指標(biāo)的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)果顯示，紅景天甙和碳酸鈣均可顯著降低骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨礦物質(zhì)損失，并且該組合顯示出更顯著的效果，見表2和3。

表2 各組大鼠骨干重的比較

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)比較

與NC組相比，OP組大鼠血清ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平明顯降低(P<0.05)；與H組和Ca組相比，H+Ca組大鼠血清ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平顯著降低(P<0.05)；H+Ca和NC組之間的這一水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果顯示，紅景天甙和碳酸鈣可明顯降低骨質(zhì)疏松癥大鼠的血清ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平，并且聯(lián)合治療顯示出更顯著的效果，見表4。

表4 各組大鼠骨代謝水平比較Table 4 Comparisons of calcium and phosphorus levels in rats among

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量的變化

與NC組相比，OP、H、Ca組大鼠血清SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05或P <0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠血清SOD和GSH-Px活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與H、Ca組比較，H+Ca組大鼠血清SOD和GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)；H+Ca和NC組之間的這些水平的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果顯示，紅景天甙和碳酸鈣均可顯著提高血清SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，并且聯(lián)合治療顯示出更顯著的效果，見圖1。

圖1 組間超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的比較注：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01；與OP組相比，#P<0.05，##P<0.01；與H組比較，△P<0.05；與Ca組比較，▲P <0.05。Fig.1 Comparison of superoxide dismutase (SOD), activity malondialdehyde (MDA) content and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity among groups

3 討論

近年來，隨著中國進(jìn)入老齡化時(shí)期，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年上升，其骨折等并發(fā)癥嚴(yán)重影響人們的生活。對骨質(zhì)疏松癥的研究引起了中國和其他學(xué)者的廣泛關(guān)注。鈣是人體礦物質(zhì)中重要的微量元素之一，骨質(zhì)疏松癥的主要病理變化是骨礦物質(zhì)流失。其中，缺鈣是骨質(zhì)疏松癥的重要原因，因此，補(bǔ)鈣是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的最有效和最安全的方法[7]。適當(dāng)補(bǔ)充鈣可以增強(qiáng)骨鈣水平并增加骨密度，從而顯著改善骨形成[8]。紅景天甙是從玫瑰紅景天根中提取的主要生物活性化合物，研究表明，紅景天甙可改善雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松[9]和鏈脲佐菌素引起的糖尿病[10]的癥狀。但是，尚無證據(jù)表明紅景天甙聯(lián)合碳酸鈣治療對老年大鼠骨量的影響。

本研究在老年大鼠模型中觀察到BMD和骨量降低，骨代謝水平增加和氧化應(yīng)激增加。紅景天甙治療12周后，BMD和血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)均顯著改善，表明紅景天甙聯(lián)合碳酸鈣能夠緩解年齡引起的骨量流失。骨轉(zhuǎn)換生物標(biāo)志物反映了骨的形成和吸收，因此可以反映骨重塑的狀態(tài)，這是骨質(zhì)疏松癥的潛在機(jī)制[11]。BTM包括骨形成和再吸收標(biāo)志物。骨形成生物標(biāo)志物是由成骨細(xì)胞合成的，因此反映了特定的成骨細(xì)胞功能，其中包括ALP、骨鈣蛋白和PINP[12]。已經(jīng)提出增加骨形成標(biāo)記物作為絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的可能預(yù)測指標(biāo)[13-14]。在本研究中，老年大鼠血清中骨形成增加可能是由于活躍的成骨細(xì)胞試圖補(bǔ)償由于雌激素缺少引起的骨質(zhì)流失。骨吸收標(biāo)記包括CTX-1和TRACP-5b。據(jù)報(bào)道，女性中CTX-1和TRACP -5b水平升高與BMD呈負(fù)相關(guān)[15]。在這項(xiàng)研究中，老年大鼠的骨形成(ALP、骨鈣蛋白、PIPN)和骨吸收(CTX-1和TRACP-5b)標(biāo)志物均增加，表明骨轉(zhuǎn)換率增加；而紅景天甙的補(bǔ)充可顯著提高老年大鼠骨密度、降低骨代謝水平、減少骨礦物質(zhì)流失，與碳酸鈣有協(xié)同作用，聯(lián)合用藥效果顯著。

由活性氧引起的有害作用在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用[16]。生物體中過多的骨吸收會增加活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致骨量減少。隨著年齡的增長，體內(nèi)自由基的含量逐漸增加，而吸煙、飲酒等不健康的生活方式可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，提高自由基水平，從而增加骨吸收[17]。本研究表明，紅景天甙和碳酸鈣可以增加老年大鼠的SOD和GSH-Px活性，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用；它們具有協(xié)同效應(yīng)，并且顯示出更顯著的效果。

總之，該研究顯示老年大鼠的骨密度、骨礦物質(zhì)損失、骨代謝水平明顯升高和氧化應(yīng)激顯著下降，但紅景天甙和碳酸鈣的補(bǔ)充可顯著提高抗氧化應(yīng)激能力，增加骨密度，降低血清骨代謝水平；并減少骨礦物質(zhì)流失，從而預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。這兩種物質(zhì)具有協(xié)同作用，并且該聯(lián)合使用顯示出更顯著的效果，這為臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。當(dāng)然也需要進(jìn)一步研究相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制。