硫辛酸通過抑制NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)老年大鼠骨量和骨密度保護(hù)作用

劉偉 趙寶輝 劉曉峰

河北大學(xué)附屬醫(yī)院骨三科，河北 保定 071000

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種全身性疾病，其特征在于骨基質(zhì)和礦物質(zhì)的減少，導(dǎo)致骨小梁的破壞和破裂以及骨的脆性增加，從而降低生物力學(xué)性質(zhì)[1]。OP主要影響絕經(jīng)后的婦女和老年人，導(dǎo)致髖和脊柱骨折[2-5]。在過去的幾十年中，已經(jīng)使用了雙膦酸鹽，地諾單抗和PTH類似物進(jìn)行干預(yù)，它們是骨吸收的抑制劑或骨形成的刺激物[2-5]。 研究表明使用抗氧化劑可以清除自由基、改善睡眠、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和其他生物功能[6]；進(jìn)一步研究這類藥物還可以介導(dǎo)體內(nèi)甲狀腺素和降鈣素的分泌，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣代謝[7]。近年來，抗氧化劑已被一些學(xué)者用于預(yù)防和治療OP[8]。然而，沒有關(guān)于硫辛酸與碳酸鈣結(jié)合預(yù)防和治療老年OP的報(bào)道。因此，本研究旨在通過在老年雌性大鼠中采用硫辛酸干預(yù)，觀察其對(duì)骨密度、骨量和氧化應(yīng)激的影響，為臨床預(yù)防和治療老年骨質(zhì)疏松提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只24月齡和10只3月齡雌性SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd(許可證編號(hào)SCXK 2012-0002；中國(guó)上海)。將大鼠飼養(yǎng)在籠中，控制溫度和光照周期(24 ℃和12/12光周期)，濕度為40 %并自由飲食。該研究經(jīng)河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器

硫辛酸(Sigma-Aldrich，San Francisco，CA，USA)。雙能X射線吸收測(cè)定儀(Hologic，Marlborough，MA，USA)；全自動(dòng)生化分析儀(深圳市邁瑞生物醫(yī)藥電子有限公司)；連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Tecan，Salzburg，Austria)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

20只老年雌性大鼠隨機(jī)分成2組，每組10只動(dòng)物，老年組(Old組)和硫辛酸治療組(ALA組)；10只3月齡大鼠作為青年組(Con組)。所有大鼠在SPF系統(tǒng)中飼養(yǎng)，飼喂普通飼料，并在實(shí)驗(yàn)過程中自由飲食。ALA組大鼠每天一次用60 mg/kg硫辛酸腹腔注射給藥； Con組和Old組大鼠每天腹腔注射生理鹽水連續(xù)治療12周。

1.4 影像學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)

使用微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)(Skyscan 1176，Aartselaar，Belgium)對(duì)右股骨干骺端骨小梁結(jié)構(gòu)進(jìn)行了評(píng)估。分析了包括骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)在內(nèi)的骨小梁參數(shù)。骨密度(BMD)使用Micro-CT檢測(cè)。使用Skyscan Nrecon軟件重建掃描圖像，并使用CTan軟件(Kontich，比利時(shí))進(jìn)行分析。使用CT Vox軟件(3.0版，Skyscan)獲得右股骨遠(yuǎn)端區(qū)域的3D模型。隨后按照標(biāo)準(zhǔn)組織切片操作步驟，股骨干骺端使用EDTA(0.5 mol/L，pH=8.0)脫鈣后并包埋在石蠟中。使用切片機(jī)器切成5 μm厚切片，并用蘇木精和曙紅(HE)染色在顯微鏡下觀察。

1.5 檢測(cè)血清指標(biāo)

測(cè)量骨密度后，從腹主動(dòng)脈抽取血液，并在4 ℃以2 000 r/min離心10 min。分離血清并在-80 ℃下冷凍保存。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清鈣和磷。使用ELISA試劑盒(江林生物技術(shù)有限公司，中國(guó) 上海)測(cè)量血清抗酒石酸鹽酸性磷酸酶異構(gòu)體5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRACP-5b)。使用ELISA試劑盒(Zeye Biotechnology，中國(guó) 上海)測(cè)量血清I型膠原羧基端肽β特殊序列(β isomer of C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX)、骨組織骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)和骨特異性堿性磷酸酶(bone alkalin phosphatase, BALP)水平。

1.6 蛋白印記(WB)檢測(cè)

在添加了蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中溶解骨髓組織，并進(jìn)行低頻超聲處理。通過離心獲得含有總蛋白的上清液，其濃度通過二辛可寧酸蛋白測(cè)定法(Beyotime，中國(guó) 上海)測(cè)量。 根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，將等量的總蛋白上樣至10%或15%SDS PAGE。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)上，并在5%脫脂牛奶中于室溫下封閉2 h，然后在4℃下與NF-κB一級(jí)抗體(1∶2 000，Abcam)，Caspase-3(1∶2 000，CST)，PARP(1∶2 000，CST)，GAPDH(1∶10 000，Abcam)一起孵育過夜。用TBST洗滌3次后，將膜與第二抗體HRP山羊抗小鼠(ASPEN)在室溫下孵育1 h。 用Chemi Lumi One Ultra(Tanon，中國(guó))檢測(cè)蛋白條帶的灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨量和骨密度改變

所有組的大鼠股骨干骺端進(jìn)行HE染色，以進(jìn)一步觀察組織學(xué)變化，如圖1 A所示。在Old組中，組織學(xué)檢查顯示出大量的骨小梁已經(jīng)消失和少量不規(guī)則排列的骨小梁。而使用ALA治療后，骨小梁的數(shù)量和之間的連接在一定程度上得到了改善。

Micro-CT三維重建結(jié)果和骨小梁定量結(jié)果如圖1 B所示；與Con組大鼠相比，Old組大鼠SMI的顯著升高，而Tb.Th、Tb.N和BV/TV的水平顯著降低(P均<0.05)。在ALA治療后，老年大鼠的骨小梁參數(shù)和骨密度表現(xiàn)出顯著改善。其中BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th值顯著升高；而SMI顯著降低。

圖1 各組大鼠股骨干骺端骨小梁形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果注：與 Con組比較，*P<0.05、**P<0.01；與 Old組比較，#P<0.05。Fig.1 Morphological test results of femoral metaphyseal trabeculae in each group of rats

2.2 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)的變化

各組之間的血清骨代謝水平如圖2中。三組大鼠治療12周后血清中Ca和P未見明顯改變(P>0.05)。與Con組大鼠相比，Old組大鼠血清中BLAP和OPG水平顯著降低；而TRACP-5b和β-CTX顯著升高(P<0.01)。然而，使用ALA治療顯著增加BLAP和OPG水平；而TRACP-5b和β-CTX顯著降低(P<0.01)。

圖2 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)水平注：與 Con組比較，*P<0.05、**P<0.01；與 Old組比較，#P<0.05。Fig.2 Serum bone metabolism index levels in each group of rats

2.3 治療對(duì)NF-κB、Caspase-3和PARP表達(dá)的影響

ALA治療對(duì)NF-κB、Caspase-3和PARP表達(dá)的影響如圖3所示；圖3顯示了Old組大鼠的NF-κB、Caspase-3和PARP水平較Con組顯著增加(P<0.01)。與Old組相比，ALA治療后的股骨組織中NF-κB、Caspase-3和PARP表達(dá)被抑制(P<0.01)。

圖3 NF-κB、Caspase-3和PARP蛋白表達(dá)情況注：與 Con組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與 Old組比較，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Expression of NF-κB, Caspase-3 and PARP proteins

3 討論

OP的主要特征是骨組織微觀結(jié)構(gòu)的退行性變化，骨量減少和骨脆性增加，從而顯著增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。OP在老年人中很普遍，年齡是OP的主要危險(xiǎn)因素。近年來，隨著中國(guó)進(jìn)入老齡化時(shí)期，OP的發(fā)病率逐年上升，其骨折等并發(fā)癥嚴(yán)重影響人們的生活。對(duì)OP的研究引起了中國(guó)和其他學(xué)者的廣泛關(guān)注。

硫辛酸是線粒體多酶復(fù)合物中天然存在的必需輔酶，其催化α-酮酸的氧化脫羧，例如丙酮酸、α-酮戊二酸和支鏈α-酮酸[9]；其已被證明是一種潛在的抗氧化劑。一些研究提供證據(jù)表明補(bǔ)充α-硫辛酸可以減少氧化應(yīng)激并恢復(fù)體內(nèi)其他抗氧化劑水平，也有證據(jù)表明其可能在體外發(fā)揮促氧化特性[9]，因?yàn)樗ダ蠈?dǎo)致線粒體膜結(jié)構(gòu)惡化[9]。抗氧化劑具有廣泛的生物學(xué)功能，其機(jī)制不同；在骨代謝方面，抗氧化劑可以抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，并通過多種信號(hào)通路促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化[10]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，抗氧化劑可以刺激骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖[11]。此外，它可以上調(diào)runt2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)的表達(dá)，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)的表達(dá)，從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抗氧化劑可顯著增加雄性小鼠的骨密度和骨小梁體積，但明顯減少破骨細(xì)胞的大小和數(shù)量[12]。本研究表明，硫辛酸的補(bǔ)充可顯著提高老年大鼠骨密度，提高骨密度，改善骨代謝。

由活性氧引起的骨毒性在OP的發(fā)生中起重要作用[13]。生物體中過多的骨吸收會(huì)增加活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致骨量減少。隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)自由基的含量逐漸增加，而吸煙、飲酒等不健康的生活方式可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，提高自由基水平，從而增加骨吸收[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，隨著抗氧化劑水平的降低，體內(nèi)抗氧化應(yīng)激水平降低，而體內(nèi)炎癥水平增加?？梢钥闯?，維持正常的抗氧劑水平可以減少自由基的損害[15]。NF-κB是通過促進(jìn)炎癥因子分泌而誘導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵信號(hào)[16]。NF-κB的活化可促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，從而導(dǎo)致骨破壞并破壞骨形成[17]。本研究的數(shù)據(jù)表明，ALA可以通過抑制NF-κB信號(hào)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)而減少骨量的流失。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)ALA通過抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)保護(hù)老年大鼠骨量。但是，本研究存在一些局限性。具體而言，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄?shù)量相對(duì)較少，因此導(dǎo)致測(cè)量數(shù)據(jù)有限。此外，除了股骨外，我們還沒有探討關(guān)節(jié)、脊柱、手腕或其他骨骼的骨質(zhì)疏松癥。最后也是最重要的限制是我們只依靠Micro-CT來研究骨量，但是沒有進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試來測(cè)量骨強(qiáng)度?？傊?，在本研究中，我們指出了ALA可預(yù)防老年大鼠的骨量丟失。