降血壓活性卡拉膠鉀的腸道菌群調節(jié)作用研究

陳 夢， 付曉丹， 朱常亮， 牟海津，*， 韓振蓮

(1.中國海洋大學 食品科學與工程學院, 山東 青島 266003;2.淮陰師范學院 生命科學學院, 江蘇 淮安 223300)

κ-卡拉膠及其寡糖的抗凝血作用已被證實[1]，而有報道指出改善高血壓病人的凝血功能有助于控制患者的病情[2]，這說明 κ-卡拉膠可能具有潛在降壓作用。當人體攝入的鉀離子增多，細胞膜上的“鈉鉀泵”會充分地將K+泵入細胞內以形成高鉀環(huán)境，同時使Na+外流，并隨尿液排出，減輕了胞內鈉離子過多導致機體大量飲水而出現(xiàn)的細胞外液、血容量增多以及心室充盈等現(xiàn)象，進而減輕血壓升高現(xiàn)象。κ-卡拉膠的重復二糖單元攜帶一個負電荷，可以與溶液中的陽離子結合；分子卡拉膠經酶解成短鏈糖結構，其空間結構得以舒展，硫酸根基團也得以更大程度地暴露進而與鉀離子更充分地接觸，提高鉀離子的結合率。

腸道菌群被視為人類的第二基因組，其對機體各方面的調控作用不容小覷?？ɡz一直都被證實有多種生理活性，并且有潛力成為功能性食品和藥物開發(fā)的益生元劑。然而，到目前為止仍舊沒有相關實驗揭示卡拉膠在動物實驗中對腸道菌群的影響。眾多研究表明，腸道菌群失調會導致機體出現(xiàn)多種慢性和急性病征，如高血壓[3]、糖尿病[4]、結腸炎[5]、過敏[6]等。有學者指出腸道菌群失衡往往發(fā)生在高血壓之前，而機體一旦患上高血壓又會反作用于腸道菌群[7]，腸道菌群失調與高血壓處于一種互相促進的狀態(tài)，因此腸道菌群的調整和改善可以作為防治高血壓的一個切入點。

研究利用制備的低分子質量的酶解卡拉膠鉀為實驗材料，分析其對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的降血壓功效和對腸道菌群的調節(jié)作用，重點關注腸道內環(huán)境的改善、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的變化以及菌群組成上的差異等，以期從腸道環(huán)境及菌群的角度對低分子質量卡拉膠鉀(LCP)降低SHR血壓的可能機理進行更深一步的闡釋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡托普利，深圳海王藥業(yè)有限公司；低分子質量卡拉膠鉀(分子質量3.5 kDa)，本實驗室制備； SCFAs標準品、異己酸純物質原液，西格瑪貿易有限公司；脂多糖試劑盒，上海酶聯(lián)免疫公司；體積分數(shù)4%多聚甲醛固定液，中山康乃欣生物醫(yī)療有限公司；地衣酚，上海一研試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)，美國默克密理博公司；XW-80A型旋渦混合器，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Olympus BX41型熒光顯微鏡，南京貝登醫(yī)療股份有限公司；1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司； KC-811型色譜柱，北京恩加壹科技有限公司。SPF級的雄性SHR 18只[9周齡，220～260 g，收縮壓大于165 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]，北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.3 實驗方法

1.3.1動物飼養(yǎng)與血壓測定

18只SHR于SPF級屏障環(huán)境動物房適應性喂養(yǎng)1周，溫度：22～26 ℃；濕度：50%～70%；飼養(yǎng)密度：3只/籠。SHR的頭、背、尾3個部位分別被染上苦味酸(黃色)作為區(qū)分標記；人為控制光照環(huán)境，保持生存環(huán)境12 h光照，12 h黑暗。根據體重和血壓平均分為3組，每組6只，保證組間初始血壓平均值盡可能接近。根據參考文獻[8]，實驗劑量如下：空白對照(B)組灌胃蒸餾水，實驗(LCP)組灌胃LCP[600 mg/(kg·d)]，陽性對照(P)組灌胃卡托普利[10 mg/(kg·d)]。實驗持續(xù)6周，每周定時定點測量收縮壓(SBP)1次，完全按儀器的測量方法進行操作，等大鼠在黑暗密閉環(huán)境完全安靜后儀器自動讀數(shù)，每只大鼠測量5次，若有相差較大的數(shù)值，當場剔除，保證5次測量結果相差不大。并稱重2次以便根據體重隨時微調實際灌胃體積。實驗結束后，乙醚迷暈大鼠，腹主動脈取血， 注意收集盲腸內容物。

1.3.2短鏈脂肪酸的測定

樣品前處理(水提法)：取保存于-80 ℃冰箱的LCP組的盲腸內容物置于冰盒上，冷凍狀態(tài)下用消毒的鑷子稱取0.3 g左右置于2 mL EP管中，用超純水定容至刻度線，混勻后冷凍離心。將上清液轉移至另外的離心管中，注入60 μL 2 mg/mL的磺基水楊酸以除去蛋白質，充分混勻后冷凍離心。取1 mL上清液，加入異己酸原液12.5 μL以保證和標準品中異己酸的濃度一致，混合均勻，冷藏待用。

色譜條件：色譜柱為離子排阻KC-811色譜柱(8.0 mm×300 mm)；流動相為體積分數(shù)0.01% H3PO4(pH值3.12)，柱溫50 ℃，流速0.8 mL/min，檢測器為紫外檢測器，波長210 nm，檢測時間35 min。

短鏈脂肪酸的測定采用內標法[9]，內標物為異己酸，計算見式(1)～式(3)。

(1)

式(1)中，Ar，標準品中異己酸的峰面積；As，待測樣品中異己酸的峰面積。

則待測樣品中相應SCFAs的質量濃度ρi為：

(2)

式(2)中，Ai，待測樣品中相應SCFAs的峰面積；Ari，標準品中相應SCFAs的峰面積；ρri，標準品中相應SCFAs的質量濃度，mg/L。

則盲腸內容物中SCFAs的含量(mg/g)為：

(3)

式(3)中，2，樣品體積，mL；m，稱取的盲腸內容物的質量，g。

1.3.3菌群多樣性分析

針對16S rRNA的V3～V4區(qū)進行Miseq擴增子測序。測序數(shù)據經拼接、質控、去接頭之后獲得優(yōu)化序列，基于優(yōu)化序列進行OTU聚類，獲得OTU豐度表，用于后續(xù)生信分析。對于Beta多樣性分析，基于Bray_Curtis weighted和unweighted unifrac距離計算距離矩陣，使用PCoA進行結果可視化展示；使用非參數(shù)的adonis分析(PerMANOVA)檢測組間差異是否顯著，以及分組因素對組間差異的解釋度。使用Welch’s t tests進行不同組間門和屬水平物種豐度變化的差異分析，使用Bonferroni進行多重檢驗校準。

1.4 數(shù)據處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據均表示為平均數(shù) ± 標準偏差，組間數(shù)據采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 LCP對SHR收縮壓的影響

SHR不同時間段的收縮壓見表1。由表1可知，空白組SHR的血壓值隨周齡增加而上升，第3周穩(wěn)定在210 mmHg左右。LCP組在灌胃第1周基本無降壓作用，從第2周開始便控制血壓不再上升，第3周開始與空白組有了顯著差異(P<0.05)，這種顯著的降壓效果持續(xù)到了第4周，第5周血壓略有回升，但在第6周與空白組血壓相比出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，降壓效果明顯，總體上與空白組相比，有18 mmHg左右的血壓差，說明LCP具有一定的降壓作用且能夠保持穩(wěn)定持續(xù)的降壓效果。陽性對照組控制血壓的效果較為明顯，灌胃1周后就出現(xiàn)了顯著的降壓效果并持續(xù)到實驗結束，但是對照組在第3周血壓出現(xiàn)波動。

表1 每組SHR不同時間段的收縮壓

2.2 各組間SCFAs的含量變化

SCFAs也稱揮發(fā)性脂肪酸，是碳鏈中碳原子數(shù)在1～6的有機脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸的總含量在95%以上[10]。90%的SCFAs是由腸腔內厭氧菌酵解食物中不消化的碳水化合物成分產生，余下與蛋白質代謝和飲食組成相關。SCFAs被腸上皮細胞吸收后可為線粒體提供能量，尤其是丁酸，其含量占腸道SCFAs總含量的80%以上，是腸上皮細胞的主要供能者。丁酸可調節(jié)腸道內部的酸堿性，降低pH值，減少有害菌的生長[11]；還可抑制炎癥因子的生成，降低免疫應答效應，控制結腸炎癥的發(fā)展等[12]。

*、** 分別表示與空白組相比有顯著、極顯著差異，#、##分別表示與對照組相比有顯著、極顯著差異。圖1 各組盲腸內容物中乙酸、異丁酸及丁酸的含量比較Fig.1 Comparison of acetic acid, isobutyric acid and butyric acid contents in each group

盲腸內容物SCFAs含量變化見圖1。在乙酸含量上，LCP組與空白組相比出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，且與對照組相比呈現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，顯示出LCP在改善腸道內環(huán)境方面明顯優(yōu)于卡托普利的特性。前人研究發(fā)現(xiàn)，異丁酸最主要作用是利于纖維分解菌的生長，在日糧中添加異丁酸等，白色瘤胃球菌成為優(yōu)勢菌群[13]。本實驗中，比較于其他類型的SCFAs，異丁酸含量上的組間差異性最大；LCP組與空白組相比出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，與對照組相比出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；對照組與空白組相比，雖略微有所升高，但統(tǒng)計學分析結果顯示兩組間并無顯著差異。丁酸可增加腸上皮細胞之間緊密連接蛋白的表達量，使得腸上皮細胞間緊密連接作用加強，抑制腸道通透性增加，增強黏膜屏障功能[14]；丁酸亦可促進黏蛋白分泌，增加腸道潤滑度[15]。同時腸炎患者在口服丁酸腸溶片后，大部分患者腸炎病癥在臨床上得到緩解，內鏡及組織病理實驗顯示，典型促炎因子IL-1水平下降，在病理和生理上均未發(fā)現(xiàn)其他不良反應[16]。研究發(fā)現(xiàn)LCP組丁酸含量與空白組、對照組相比，均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，而對照組與空白組相比無顯著差異。

2.3 LCP對SHR腸道菌群的影響

研究首先在門水平上從厚壁菌門與擬桿菌門比值(F/B值)出發(fā)對腸道菌群進行評估(圖2)，發(fā)現(xiàn)相比較于空白組和對照組，LCP組厚壁菌門明顯減少，擬桿菌門明顯增多，F(xiàn)/B值下降，與宏觀表現(xiàn)出的血壓下降結果一致。LCP組相較于空白組，厚壁菌門數(shù)量減少8.3%，擬桿菌門數(shù)量增加8.4%，空白組的F/B值是LCP組的1.53倍(表2)。對于降壓藥物卡托普利來說，門水平上的菌群結果并未顯示出其在調節(jié)腸道菌群上的差異性。

圖2 各組腸道內門水平的菌群分布Fig.2 Intestinal flora distribution in level of Phylum

表2 門水平腸道菌群的F/B值

此外，本實驗從屬水平對各組菌群的豐度(圖3)進行評價，發(fā)現(xiàn)LCP組在腸道主要優(yōu)勢菌群的豐度上明顯高于空白組和對照組。圖3中藍色為其他菌屬，綠色為毛螺菌科中未經正式分類的未知屬，紅色為普雷沃克氏菌屬(Prevotella)。Dae-Wook等[17]在對比了神經典型兒童與伴隨高比例胃腸道疾病的自閉型兒童的腸道菌群后發(fā)現(xiàn)后者的特征在于Prevotella水平的顯著降低，這表明Prevotella作為腸道有益菌和優(yōu)勢菌對于腸道調節(jié)的重要性。根據圖3、圖4的差異菌分析可知，LCP組中的Prevotella菌屬相較于空白組明顯占據優(yōu)勢。紫色為毛螺菌屬，是屬于梭菌的一類產丁酸菌，這一菌屬可通過產丁酸來預防人類的結腸癌[18]。

LEfSe分析可顯示不同組之間具有統(tǒng)計學差異的生物標識，即找出兩組之間的差異菌株。分析水平選擇屬水平，在差異菌種的分析中發(fā)現(xiàn)，與空白組對比，LCP組的差異菌為普雷沃克氏菌屬(Prevotella)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(圖4)。正常成人腸道細菌種類以擬桿菌型(Bacteroides)、普氏菌型(Prevotella)和瘤胃球菌型(Ruminococcus)3個屬的細菌為腸內優(yōu)勢菌群[19]，可見LCP對調節(jié)腸內菌群回歸正常水平有一定作用。普雷沃克氏菌屬消化纖維素，主要產生乙酸、丁酸以及少量的異丁酸。由于異丁酸可有效地促進白色瘤胃球菌的生長[20]，故推測LCP組大鼠腸道菌群內的普雷沃克氏菌的增多，有效地提高了腸道內異丁酸的含量，進而促進瘤胃球菌屬的生長；而瘤胃球菌屬是典型的產丁酸菌[21]，所以腸道內丁酸的含量也獲得了顯著地提高。

2.4 高血壓與腸道菌群的相關性分析

圖3 屬水平的腸道菌群豐度及普雷沃可氏菌比例Fig.3 Abundance of intestinal flora in level of genus and percentage of Prevotella

LDA分值為以10為底的對數(shù)值；LDA分值越大，代表物種豐度對差異效果影響越大。圖4 空白組和LCP組的差異菌分析Fig.4 Different bacteria of blank and LCP group

紅色表示正相關，藍色表示負相關。*0.01

以收縮壓(SBP)的數(shù)據表征高血壓，通過環(huán)境因子關聯(lián)分析，借助大數(shù)據分析將高血壓與腸道菌群進行關聯(lián)，結果如圖5。高血壓與Christensenellaceae_R_7_group、Lachnospiraceae_NK4B4_group、Marvinbryantia、Parabacteroides、unclassified_f_Lachnospiraceae5種細菌呈正相關，與Ruminiclostridium、Ruminococcus_1呈負相關。研究表明Christensenellaceae_R_7_group與心血管疾病風險呈正相關[22]，Marvinbryantia在神經元活動引起的腸道綜合征中豐度有所上升[23]，而Parabacteroides在高血壓個體的腸道中分布廣泛[24]，Lachnospiraceae_NK4B4_group和unclassified_f_Lachnospiraceae未查閱到與高血壓以及腸道生理功能相關的研究。Ruminococcus_1是瘤胃球菌的一種，主要產生丁酸，而瘤胃球菌與高血壓的負相關性也多有報道[21,25]。這一分析結果表明，本實驗中LCP組血壓的降低與產丁酸的瘤胃球菌有一定關系。

此外，表3是不同細菌在不同實驗組中的豐度百分比。在與血壓正相關菌群中，LCP組的豐度皆低于空白組；而在負相關菌群中，LCP組的豐度略高于空白組。其中，擬桿菌與收縮壓呈負相關，但是與乙酸的產生呈正相關，這一分析結果與前面LCP組中擬桿菌門的豐度高于空白組一致。此外，LCP組中乙酸的含量顯著高于空白組，由此可以推測，乙酸含量的提高與擬桿菌門豐度提高可能有關。

3 結 論

Holmes等[26]在以亞洲黃種人和歐洲白種人為調查對象的研究中發(fā)現(xiàn)，SCFAs的水平和血壓具有很顯著的相關性。SCFAs在一定范圍內可以激活孤兒型G蛋白偶聯(lián)受體(Gpr41)起到降壓作用。此外，SCFAs還可以通過直接地調節(jié)血管舒張程度進而降低血壓[27]。在對SHR的腸道中SCFAs含量和菌種豐度的研究中發(fā)現(xiàn)，與對照組WKY大鼠相比較，SHR結腸糞便中的丙酸和丁酸含量顯著減少[28]。體外實驗證明乙酸可抑制細菌LPS誘導的炎癥因子釋放[29]；在給無菌小鼠通過口服方式給予濃度為150 mmoL/L乙酸后，其腸道炎癥因子含量下降，對腸道進行組織活檢發(fā)現(xiàn)腸炎癥狀減輕，腸道內環(huán)境得到改善[30]。

表3 各組中不同細菌的比例 Tab.3 Percentage of different bacteria in each group %

而厚壁菌門與擬桿菌門的比值與高血壓息息相關，眾多研究表明在高血壓患者或動物模型中F/B值會增加。Yang等[28]在對高血壓大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，與血壓正常的WKY大鼠相比較，腸道菌群豐度、均勻度和多樣性等在SHR與Ang II誘導的高血壓大鼠模型中顯著降低，同時F/B值增加，是正常WKY大鼠的5倍，產乙酸和產丁酸的細菌數(shù)量顯著減少。

本文研究結果基本符合前人的正向研究結論，LCP通過增加普雷沃克氏菌屬和瘤胃球菌屬的豐度來提高腸道內SCFAs的含量，增加優(yōu)勢有益菌群的數(shù)量，降低腸道其他有害菌的占比，進而改善腸道內環(huán)境，即LCP能調節(jié)腸道內環(huán)境以及使腸道菌群趨于正?；?，因而具有潛在的改善高血壓癥狀的作用。