5種藥用植物內(nèi)生真菌的分離純化及生物活性研究

郭 欽,楊中鐸,孫建慧

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730050)

內(nèi)生真菌 (endophvte)是存在于健康植物的莖葉中,形成不明顯侵染的一類(lèi)真菌[1]。它普遍存在于健康植物組織中,與植物互利共生,且能夠發(fā)揮與宿主植物本身相同或相似的藥理活性,而產(chǎn)生這些作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是內(nèi)生菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中所產(chǎn)生的多種多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物,它們大多數(shù)都具有如抑菌、抗蟲(chóng)等多種生物活性,這些在農(nóng)業(yè)和(或)醫(yī)藥業(yè)中具有極大的應(yīng)用潛力與發(fā)展前景[2]。由于植物內(nèi)生真菌比較容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化培養(yǎng),若搞清藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物與宿主的藥用活性成分具有相同或相似作用的機(jī)制,這對(duì)于藥用植物的新的生產(chǎn)途徑,工藝研究及藥用植物生長(zhǎng)環(huán)境的保護(hù),將具有十分重要的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益[3]。單胺氧化酶(MAO,monoamine oxidase)是一類(lèi)催化單胺類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行氧化脫氨反應(yīng)的酶。它存在于細(xì)胞的線粒體外膜上,在人體內(nèi)廣泛分布[4],尤其是在神經(jīng)組織中分布過(guò)多,會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的胺代謝產(chǎn)物,這些代謝產(chǎn)物被普遍認(rèn)為可能會(huì)引發(fā)各類(lèi)精神疾病。因此,近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者們致力于研究和開(kāi)發(fā)各種結(jié)構(gòu)的單胺氧化酶抑制劑,試圖尋找到可逆較好、選擇性較高的單胺氧化酶抑制劑,用于抑郁癥、帕金森癥的治療[5]。乙酰膽堿酯酶(AChEI,acetylcholesterase)抑制劑被廣泛用于阿爾茨海默病(AD,alzhei-me’s disease)、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、重癥肌無(wú)力等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[6]。實(shí)驗(yàn)研究旨在從藥用植物內(nèi)生菌這一微生物資源中尋找對(duì)MAO與AchE具有良好抑制效果的提取物,為進(jìn)一步跟蹤其中的活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材與材料

5種植物細(xì)葉小檗(Berberidispoiretii)、寶蓋草(Lamiumamplexicaule)、隴塞忍冬(Loniceratangutica)、甘青大戟(Euphorbiamicractina)、貫葉連翹(Hypericumperforatum)采自甘肅南部,均由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院楊林副教授鑒定。Wistar大鼠購(gòu)自蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院。

1.2 培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA,potato dextrose agar)固體培養(yǎng)基:200 g土豆、1 L水、20 g葡萄糖、20 g瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基:PDA液體培養(yǎng)基:200 g土豆、1 L水、20 g葡萄糖。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 待測(cè)樣品的制備

(1) 內(nèi)生真菌的分離和純化 取5種植物的根、莖、葉及果實(shí),用無(wú)菌水沖洗干凈。表面滅菌后,用解剖刀將藥材根莖果實(shí)切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊,藥材葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小片,接入含硫酸鏈霉素(200 U/mL)的PDA固體培養(yǎng)基上,倒置于恒溫培養(yǎng)箱中以28 ℃培養(yǎng)3～7 d。觀察切口與培養(yǎng)基接觸處,待有新菌長(zhǎng)出后挑取菌絲,經(jīng)劃線法純化后得到表觀形態(tài)不一的內(nèi)生真菌。

(2) 次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取 將菌株活化后接入PDA液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)10～14 d,抽濾得菌絲菌液,將菌液用等體積乙酸乙酯萃取2遍;菌絲用甲醇回流2 h,回流2次,分別得菌液與菌絲的提取物。

2.2 單胺氧化酶活性測(cè)定

稱(chēng)取待測(cè)物1 mg,用50 μL無(wú)水乙醇溶解,用pH值7.6磷酸緩沖液配置成1 mg/mL的待測(cè)樣品備用。單胺氧化酶活性測(cè)定方法與文獻(xiàn)[7]中一致抑制率計(jì)算公式為

抑制率(%)=[(空白組-空白本底)-(樣品-樣品本底)]/(空白組-空白本底)×100%。

所有樣品平行測(cè)3次,取平均值。

2.3 乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定

采用改進(jìn)的Ellman方法[8]在96孔酶標(biāo)板上測(cè)定樣品的乙酰膽堿酯酶抑制活性,計(jì)算方法與單胺氧化酶抑制率計(jì)算方法一致。

2.4 內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定

研究對(duì)活性最好的菌株XYXB-1進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定,該菌株DNA的提取、ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序工作,均由上海生物工程股份有限公司完成。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同藥用植物組織中內(nèi)生真菌數(shù)量

從5種植物的組織中共分離到48株內(nèi)生真菌,其中分別從細(xì)葉小檗、寶蓋草、甘青大戟、貫葉連翹、隴塞忍冬的植物組織中分離得到8株、6株、8株、12株、14株內(nèi)生真菌,說(shuō)明藥用植物組織中存在豐富的內(nèi)生真菌資源。

3.2 內(nèi)生真菌提取物對(duì)單胺氧化酶的抑制作用

通過(guò)酶標(biāo)法來(lái)測(cè)定所有內(nèi)生真菌提取物的單胺氧化酶抑制活性,計(jì)算得到的結(jié)果為:終質(zhì)量濃度為167 μg/mL時(shí),抑制率超過(guò)60%的粗提物有25個(gè),其中抑制率超過(guò)80%的有6個(gè),抑制率最高的為XYXB-1-L(92.38%),對(duì)抑制率超過(guò)80%的提取物進(jìn)一步測(cè)定它們的IC50值,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物粗提物抗單胺氧化酶活性

3.3 內(nèi)生真菌提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用

通過(guò)Ellman法測(cè)定所有內(nèi)生真菌提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性,結(jié)果顯示對(duì)乙酰膽堿酯酶的活性抑制率都很低,當(dāng)提取物的終質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí),活性最高為GYLQ-3-L(貫葉連翹中分離的一株內(nèi)生菌的菌液提取物),抑制率僅為41.19%。

3.4 XYXB-1的分子生物學(xué)鑒定

菌株XYXB-1的ITS序列長(zhǎng)度為575 bp,與genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的KR822138.1 (Alternariasp.XN-3-1)進(jìn)行比對(duì),ITS序列的最大相似度為99 %;菌落為黑色,致密毯狀,基質(zhì)為灰色,全緣;將形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)分析結(jié)合,將內(nèi)生真菌XYXB-1鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌。

4 討論

實(shí)驗(yàn)所用的植物均為新鮮植物,從根、莖、葉及果實(shí)中依次分離得到3、22、15、8株內(nèi)生真菌,可以發(fā)現(xiàn)相對(duì)其他部位,植物的莖中含有的內(nèi)生真菌資源最豐富。對(duì)從植物中分離出的48 株真菌發(fā)酵得到的96個(gè)粗提物進(jìn)行生物活性研究,發(fā)現(xiàn)BGC-2-L和XYXB-1-L對(duì)單胺氧化酶活性較高,IC50值分別為72.08 μg/mL和63.55 μg/mL。從結(jié)果中可以看出,內(nèi)生真菌菌液的次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性普遍較菌絲體要高。

在以往的報(bào)道中,人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了鏈格孢屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗菌[9]、細(xì)胞毒性[10]、抗腫瘤和利尿[11]等生物活性,但是鏈格孢屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物關(guān)于單胺氧化酶和乙酰膽堿脂酶的活性研究鮮有報(bào)道,此為首次發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗乙酰膽堿脂酶活性的文獻(xiàn)報(bào)道。