分子印跡電化學(xué)傳感器在氨基酸對(duì)映體識(shí)別中的應(yīng)用研究

袁 璇，張慢樂(lè)，郭佩弦，豐賽飛，胡慧穎，吳 玲，曹 忠*

（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410114）

（2.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，重慶401123）

0 前言

氨基酸是維持生命的基本要素，是蛋白質(zhì)合成、ATP生成，核苷酸合成和體內(nèi)氧化還原平衡的前體[1]，并與多種疾病相關(guān)，如L-絲氨酸可以作為精神分裂癥的生物標(biāo)志物，L-天冬氨酸與阿爾茨海默氏癥和癲癇癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[2]，L-天冬氨酸與慢性疲勞綜合癥和抑郁癥有關(guān)[3]。除甘氨酸外，其余氨基酸都是手性化合物（D/L-對(duì)映異構(gòu)體），L型氨基酸主要是肽和蛋白質(zhì)的組成部分，D型氨基酸與細(xì)菌和哺乳動(dòng)物等各種生物的生理作用相關(guān)[4]。在哺乳動(dòng)物和人類組織中D-氨基酸和L-氨基酸不互斥，通常以非外消旋混合物的形式共存，如以游離形式、蛋白質(zhì)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形式出現(xiàn)[5]。如D-精氨酸存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是一種神經(jīng)保護(hù)型氨基酸[6]。而L-精氨酸是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)、肌酸、NO、胍基丁胺、多胺和高精氨酸合成的前體[7-9]。L-半胱氨酸(L-Cys)在蛋白質(zhì)的生物活性中起關(guān)鍵作用，而D-Cys可能產(chǎn)生不可忽略的細(xì)胞毒性[10]。D-天冬氨酸與生長(zhǎng)激素和性激素等的釋放有關(guān)[2]，L-天冬氨酸具有生物活性，可用作神經(jīng)遞質(zhì)，且低周轉(zhuǎn)率蛋白質(zhì)中天冬氨酸對(duì)映體的D/L比率可以確定年齡[3]。手性分子的對(duì)映異構(gòu)體的性能在生化活性、效力、毒性、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和代謝途徑方面可能表現(xiàn)出顯著差異[11]。因此，在化學(xué)鑒別和生物技術(shù)及新藥研制等許多領(lǐng)域中研究開(kāi)發(fā)一種區(qū)分手性分子的對(duì)映異構(gòu)體的手段至關(guān)重要。

截止至目前，分離對(duì)映體的方法主要有氣相色譜[12]、高效液相色譜[13]、毛細(xì)管電泳[14]、聚合物膜分離[15]、生物通道[16]、人工納米通道[17]和電化學(xué)傳感器[18]。與電化學(xué)傳感器法相比，這些方法具有費(fèi)時(shí)、成本高、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因分子印跡聚合物（MIP）具有易于合成、成本低廉、良好的物理穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)可預(yù)測(cè)性和識(shí)別特異性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器中識(shí)別和定量檢測(cè)氨基酸對(duì)映體[19-20]。

該文詳細(xì)介紹了不同分子印跡的構(gòu)建方法，如本體印跡，“虛擬”模板印跡和電化學(xué)印跡等制備過(guò)程和優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)了近幾年不同分子印跡構(gòu)建方法制備的電化學(xué)傳感器對(duì)氨基酸對(duì)映體的識(shí)別性能，以及存在的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 分子印跡的構(gòu)建

分子印跡識(shí)別印跡分子的機(jī)制靈感來(lái)源于1930年Breinl和Haurowitz[21]提出的抗體和抗原之間的識(shí)別機(jī)制，1931年，Polyakov[22]最早將分子印跡用于化學(xué)即用具有異常吸附特性的二氧化硅顆粒識(shí)別苯。分子印跡是指模板分子和功能單體通過(guò)共價(jià)/非共價(jià)相互作用組裝在一起形成復(fù)合物，隨后將得到的主體-客體復(fù)合物與交聯(lián)劑和引發(fā)劑共聚，然后在光、熱或電等外部因素的刺激下使預(yù)組裝的復(fù)合物發(fā)生聚合反應(yīng)，得到剛性的不溶性聚合物再除去模板分子，除去模板分子后，獲得與模板分子具有互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)及特異性識(shí)別位點(diǎn)，再通過(guò)相同的共價(jià)/非共價(jià)相互作用重新組合[23-24]。分子印跡過(guò)程的示意圖如圖1所示[25]。

圖1 分子印跡過(guò)程的示意圖[25]Fig.1 Schematic representation of molecular imprinting process[25]

1.1 制備分子印跡的主要方法

制備分子印跡的主要方法有共價(jià)分子印跡和非共價(jià)分子印跡。其中共價(jià)分子印跡是指模板分子和功能單體通過(guò)共價(jià)作用結(jié)合形成復(fù)合物，共價(jià)印跡產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)均一，但是模板的洗脫及隨后的重新結(jié)合很難達(dá)到熱力學(xué)平衡[26]。而非共價(jià)印跡沒(méi)有這種限制，在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，模板分子和功能單體通過(guò)范德華力、氫鍵、π-π堆積、靜電相互作用或疏水相互作用自組裝結(jié)合形成預(yù)聚合物后再聚合，除去模板后，通過(guò)相同的非共價(jià)作用重新結(jié)合。非共價(jià)印跡具有操作簡(jiǎn)單和模板分子的洗脫和重新結(jié)合快速等優(yōu)點(diǎn)，已成為最流行和通用的合成策略[27]。然而，非共價(jià)印記對(duì)于將復(fù)合物結(jié)合在一起的相互作用的輕微破壞（例如，水的存在）也很敏感，因此它不是很穩(wěn)定[28]。共價(jià)分子印跡和非共價(jià)分子印跡識(shí)別模板分子示意圖如圖2所示[29]。為了結(jié)合共價(jià)印記的持久性和非共價(jià)印記的快速的目標(biāo)攝取，出現(xiàn)了一種稱為半共價(jià)印記的新方法。該方法提供了一種中間替代方案，其中模板分子與功能單體通過(guò)共價(jià)作用結(jié)合，而模板分子的重新結(jié)合是基于非共價(jià)相互作用[30]。為了得到理想的印跡聚合物，就必須優(yōu)化合成MIPs的試劑，如模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑以及致孔劑等。

圖2 共價(jià)分子印跡和非共價(jià)分子印跡示意圖[29]Fig.2 Schemes of covalent and noncovalent molecular imprinting[29]

1.2 模板分子

模板分子一般是分析物或者與分析物結(jié)構(gòu)相似的分子。理想的模板分子在聚合反應(yīng)過(guò)程應(yīng)具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性，含有非常合適與功能單體組裝的官能團(tuán)（如羥基、氨基和羧基等）以及不能含有參與或阻止聚合的基團(tuán)[30]。

1.3 功能單體

功能單體是提供能與模板分子通過(guò)共價(jià)鍵/非共價(jià)鍵相互作用形成復(fù)合物的官能團(tuán)，功能單體與模板分子之間的相互作用強(qiáng)度會(huì)影響MIPs的親和力，并決定識(shí)別位點(diǎn)的準(zhǔn)確性和選擇性[29]。常見(jiàn)的功能單體有甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酸（AA）、丙烯酰胺（AM）、甲醛丙烯酸甲酯（MMA）、吡咯（Py）、2-乙烯基吡啶（2-VP）、4-乙烯基吡啶（4-VP）和對(duì)苯二胺（OPD）（圖3）[31]。

圖3 分子印跡中常用的功能單體[31]Fig.3 Functional monomers commonly used in molecular imprinting[31]

1.4 交聯(lián)劑

交聯(lián)劑的作用是將功能單體的官能團(tuán)固定在模板分子周圍，形成高度交聯(lián)的剛性聚合物。除去模板分子后，形成的印跡空腔與模板分子的尺寸、形狀和官能團(tuán)完全互補(bǔ)。當(dāng)交聯(lián)劑的含量過(guò)低時(shí)，MIP不能保持穩(wěn)定的空腔構(gòu)型。當(dāng)交聯(lián)劑過(guò)多時(shí)單位質(zhì)量的MIP的識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量減少[32]。常用的交聯(lián)劑包括乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、二乙烯基苯（DVB）、N，N’-亞甲基二丙烯酰胺（MDA）、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）和季戊四醇三丙烯酸酯（PETRA）等（圖4）[31]。

圖4 分子印跡中常用的交聯(lián)劑[31]Fig.4 Cross-linking monomers commonly used in molecular imprinting[31]

1.5 引發(fā)劑

引發(fā)劑指一類容易受熱分解成自由基（即初級(jí)自由基）的化合物。過(guò)氧化合物、偶氮化合物被廣泛用作引發(fā)劑，其中，偶氮二異丁腈(AIBN)在50~70℃的分解溫度下使用最為方便。為了確保聚合反應(yīng)，在擴(kuò)散前從聚合溶液中除去溶解的氧是非常重要的，可以通過(guò)鼓泡惰性氣體（如氮?dú)饣驓鍤猓﹣?lái)清除氧氣[32]。

1.6 致孔劑

致孔劑是在聚合過(guò)程中充當(dāng)分散介質(zhì)和成孔劑的液體。通常，用于MIP合成的溶劑有2-甲氧基乙醇、甲醇、四氫呋喃、乙腈、二氯乙烷、氯仿、N,N′二甲基甲酰胺和甲苯[33]。致孔劑的極性會(huì)影響模板分子與功能單體之間的相互作用，聚合物的吸附性能和形態(tài)，特別是在非共價(jià)相互作用系統(tǒng)中MIP的吸附特性[34]。

2 分子印跡電化學(xué)傳感器在氨基酸檢測(cè)中的應(yīng)用

目前，已確立了幾種技術(shù)如本體印跡、沉淀印跡、溶膠-凝膠印跡、表面印跡、“虛擬”模板印跡和電化學(xué)印跡用于制備識(shí)別氨基酸對(duì)映體的分子印跡電化學(xué)傳感器。因單種分子印跡制備方法存在一定的缺點(diǎn)，一般采用兩種或多種制備技術(shù)聯(lián)用以制備具有優(yōu)異傳感性能的分子印跡電化學(xué)傳感器。

2.1 本體印跡技術(shù)

本體印跡是指功能單體與模板分子在交聯(lián)劑和引發(fā)劑或者光、電、熱等的作用下進(jìn)行聚合以形成聚合物（即本體聚合），然后粉碎以形成小顆粒而制備MIP的方法，但也存在對(duì)模板分子氨基酸遷移率有限且特異性較低等缺點(diǎn)[35]。

Liu等[37]使用丙烯酰胺和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯作為功能單體和交聯(lián)劑合成非共價(jià)分子印跡聚合物，制備了一種石英微天平傳感器用于識(shí)別和檢測(cè)色氨酸對(duì)映體，對(duì)L-色氨酸的檢測(cè)限為8.8 μmol/L，對(duì)映體選擇性系數(shù)為6.4（對(duì)映體選擇性系數(shù)等于兩種對(duì)映異構(gòu)體的分布系數(shù)之比，即k=Kd(L-氨基酸)/Kd(D-氨基酸)[38]），但未得出傳感器對(duì)D/L-色氨酸的線性范圍，傳感器再生時(shí)每次洗滌時(shí)間至少需要持續(xù)30 min才能恢復(fù)至原始傳感器吸附能力的95%~105%。Prasa等[36]在碳顆粒存在的情況下將非導(dǎo)電MIP層變成導(dǎo)電，即采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)，通過(guò)電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的活化劑原位合成MIP-碳復(fù)合纖維來(lái)制作對(duì)色氨酸對(duì)映體具有高選擇性和靈敏度的電化學(xué)傳感器（圖5）。該MIP-碳復(fù)合纖維能夠產(chǎn)生均勻的結(jié)合位點(diǎn)，制備的電化學(xué)傳感器對(duì)L-色氨酸的檢出限低至1.2 nmol/L。

圖5 (a)MIP-碳復(fù)合材料的制備示意圖；(b)對(duì)映體選擇性的結(jié)合D-和L-Trp在各自的MIP的分子空腔（碳粒子被同化到MIP纖維作為黑色條帶）[36]Fig.5(a)Schematic representation of the preparation of MIP-carbon composite;(b)Enantioselective binding of D-and L-Trp in molecular cavities of their respective MIPs(carbon particles are assimilated to MIP fiber as a black strip)[36]

2.2 沉淀印跡

沉淀聚合法相對(duì)于本體聚合，使用的致孔劑更多（>95%，wt）。聚合物鏈在生長(zhǎng)過(guò)程中不會(huì)重疊或聚結(jié)，而是在反應(yīng)體系中捕獲新形成的低聚物和單體繼續(xù)生長(zhǎng)，然后從溶液中分離出具有微球形形態(tài)的聚合物。Prasad等[2]以N-丙烯酰基-吡咯烷-2,5-二酮為功能單體，D-和L-天冬氨酸為模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑和α,α’-偶氮異丁腈為引發(fā)劑，在羧基功能化MWCNTs的存在下滴涂于金納米（Au NPs）修飾的鉛筆石墨電極（PGE）上，經(jīng)沉淀聚合形成雙印跡電化學(xué)傳感器，對(duì)D-天冬氨酸和L-天冬氨酸的檢測(cè)靈敏度分別為8.72 nmol/L和8.79 nmol/L，只需通過(guò)水清洗電極即可以避免非特異性吸附（圖6）。

圖6 雙重印跡MIP-AuNPs@PGE的原理圖開(kāi)發(fā)[2]Fig.6 Schematic development of Dual imprinted MIP-AuNPs@PGE[2]

2.3 溶膠-凝膠印跡技術(shù)

溶膠-凝膠印跡是指將溶膠-凝膠工藝與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，溶膠-凝膠聚合物是通過(guò)TEOS的水解和縮合形成的[39]，聚合物型表面活性劑PEG的加入導(dǎo)致形成具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的聚合物硅氧烷網(wǎng)絡(luò)。溶膠-凝膠印跡聚合物具有高孔隙率、大表面積和剛性結(jié)構(gòu)。MIP中常用的基質(zhì)是聚合物，在苛刻的條件下去除模板分子時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)印跡空腔的坍塌。因此Zhang等[40]通過(guò)加入SiO2改性MIP的手性識(shí)別結(jié)構(gòu)的剛性，以防止印跡空腔的坍塌，具體合成方法是以金納米粒子（Au NPs）摻雜的接枝-NH2的SiO2為功能單體，L-Cys為模板分子，在交聯(lián)劑四乙氧基硅烷的存在下，通過(guò)煅燒法去除L-Cys，制備了一種新型的三明治結(jié)構(gòu)分子印跡SiO2/Au NPs/SiO2作為電化學(xué)手性界面，用于Cys對(duì)映異構(gòu)體的選擇性識(shí)別（圖7a）。Li等[41]在致孔劑環(huán)十二烷基乙二醇十六烷基醚的存在下，以氫鍵誘導(dǎo)模板L-Trp在氧化銦錫（ITO）電極表面上聚集，后采用溶膠-凝膠法在ITO電極表面獲得分子印跡SiO2薄膜；通過(guò)煅燒以除去L-Trp模板分子，獲得對(duì)Trp異構(gòu)體具有良好手性識(shí)別能力的分子印跡電化學(xué)傳感器，對(duì)映體選擇系數(shù)可達(dá)4.3，且具有高的穩(wěn)定性、剛性、無(wú)毒性（圖7b）。

圖7 (a)三明治結(jié)構(gòu)分子印跡SiO2/AuNPs/SiO2電化學(xué)手性識(shí)別Cys異構(gòu)體[40]；(b)制備L-MISiO2/ITO電極的程序示意圖以及色氨酸異構(gòu)體的電化學(xué)手性識(shí)別[41]Fig.7(a)Sandwich structure molecular imprinting SiO2/AuNPs/SiO2 electrochemical chiral recognition of Cys isomers[40];(b)Schematic diagram of the preparation of L-MISiO2/ITO electrode and electrochemical chiral recognition of tryptophan isomers[41]

2.4 表面印跡

表面印跡是將模板分子印跡在表面或材料表面附近來(lái)控制識(shí)別位點(diǎn)的形成。該方法能夠有效去除模板分子，能夠加速模板分子的重新結(jié)合，且能快速達(dá)到吸附平衡[42]。如Singh等[43]以L-絲氨酸為模板分子，將硫代苯胺官能化的金納米粒子在硫代苯胺官能化的金電極上進(jìn)行電聚合來(lái)制備MIP涂層的電化學(xué)石英晶體微天平傳感器，對(duì)L-絲氨酸顯示出高靈敏度和對(duì)映選擇性，L-絲氨酸的檢測(cè)限為0.41 μmol/L，且僅需約1 h即從MIP中除去L-絲氨酸（圖8）。Prasad等[44]通過(guò)電子轉(zhuǎn)移再生的表面引發(fā)活化劑進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合，開(kāi)發(fā)了一種分子印跡聚合物基質(zhì)二氧化鈦納米顆粒/多壁碳納米管納米復(fù)合材料用于修飾鉛筆石墨電極，作為天冬氨酸異構(gòu)體的對(duì)映選擇性傳感探針，在實(shí)際樣品中無(wú)任何交叉反應(yīng)。對(duì)L-天冬氨酸的線性范圍和檢測(cè)限分別為0.075~4.00 μmol/L和13.4 nmol/L。

圖8 (A)L-絲氨酸壓電MIP傳感器的制備示意圖；(B)用于MIP傳感的印記通路的機(jī)理圖[43]Fig.8(A)Schematic representation for the preparation of piezoelectric MIP sensor for L-serine;(B)Mechanistic representation of imprinting pathway adopted for MIP sensing[43]

2.5 “虛擬”模板印跡

“虛擬”模板是指模板分子不是實(shí)際目標(biāo)分析物而是目標(biāo)分析物的結(jié)構(gòu)類似物，合適的“虛擬”模板可以有利于測(cè)定同源化合物且有助于提高對(duì)目標(biāo)分子的選擇性[45]。Huang等[46]以吡咯作為電解質(zhì)，D/L-樟腦磺酸作為虛擬模板分子，在參比電極Ag/AgCl，工作電極和對(duì)電極均為鉑電極的三電極之間施加0.3 mA的恒定電流30 min，得到MIP-PPy電極用于D/L-苯丙氨酸的手性識(shí)別（圖9A）。Chen等[47]通過(guò)將溶膠-凝膠工藝與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，成功制備了高孔隙率的分子印跡溶膠-凝膠膜的天冬氨酸（Asp）對(duì)映體電化學(xué)傳感器，該電化學(xué)傳感器是在四乙氧基硅烷下，以(L-Asp)Cu2+(NC-L-Asp)配體為模板分子，聚乙二醇為功能單體獲得的，能夠選擇性識(shí)別電化學(xué)惰性的Asp對(duì)映異構(gòu)體，且對(duì)L-Asp的檢測(cè)下限可達(dá)1.77 μmol/L（圖9B）。

圖9 (A)手性氨基酸識(shí)別過(guò)程的示意圖，其中樟腦磺酸分子既充當(dāng)摻雜劑又充當(dāng)虛擬模板[46]；(B)(L-Asp)Cu2+(NC-L-Asp)模板的MIP的提取和重新綁定[47]Fig.9(A)Schematic illustrate of the chiral amino acid recognition process,in which the camphorsulfonic acid molecule acted as both the dopant and a pseudo-template[46];(B)The extraction and rebinding of MIP for the templates of(L-Asp)Cu2+(NC-L-Asp)[47]

2.6 電化學(xué)印跡

電化學(xué)印跡是指模板分子和功能單體通過(guò)電化學(xué)聚合而形成分子印跡聚合物膜電極。Nihal等[48]以噻吩-3-羰基色氨酸為功能單體，L-苯丙氨酸為模板分子，在金電極表面電聚合獲得L-苯丙氨酸分子印跡傳感器，可以識(shí)別苯丙氨酸對(duì)映體，對(duì)映體選擇系數(shù)為8.38，且對(duì)L-苯丙氨酸的檢測(cè)限為1.0 nmol/L。Ou等[49]以吡咯為功能單體，D-/L-苯丙氨酸為模板分子在銀絲網(wǎng)印刷電極（Ag-SPE）表面使用計(jì)時(shí)電位法進(jìn)行電聚合制備聚吡咯-MIPs/Ag-SPCE，此傳感器可以選擇性識(shí)別D/L-苯丙氨酸。Zhang等[50]以D/L-色氨酸或者D/L-酪氨酸為模板，鄰苯二胺為功能單體在金電極（GE）表面進(jìn)行電聚合制備不同的MIP修飾柵極的有機(jī)薄膜晶體管傳感器，該傳感器對(duì)L-色氨酸的線性范圍為0.3~10 μmol/L，檢測(cè)限為2 nmol/L，對(duì)L-酪氨酸的線性范圍為0.3~10 μmol/L，檢測(cè)限為30 nmol/L（圖10A）。Gu等[51]以吡咯為功能單體，將金納米顆粒電沉積到玻碳電極上通過(guò)Au-S將模板分子L-半胱氨酸自組裝在電極表面，采用電聚合成功制備了L-Cys分子印跡手性電化學(xué)傳感器，實(shí)現(xiàn)了Cys對(duì)映體的手性電化學(xué)識(shí)別，對(duì)L-Cys具有高選擇性（圖10B）。

圖10 (a)用MIP膜改性的基于有機(jī)薄膜晶體管的L-色氨酸傳感器的示意圖[50];(b)制備L-Cys印跡的OPPy-AuNPs和手性識(shí)別Cys對(duì)映體的過(guò)程示意圖[51]Fig.10(a)Schematic diagram of L-tryptophan sensor based on organic thin film transistor modified with MIP film[50];(b)The procedures showing the preparation of L-Cys imprinted OPPy-AuNPs and the chiral recognition of Cys enantiomers[51]

3 總結(jié)

該文總結(jié)了以不同印跡技術(shù)制備分子印跡電化學(xué)傳感器用于氨基酸對(duì)映體的研究進(jìn)展，然而，通過(guò)MIP-手性傳感器獲得的對(duì)映選擇性通常對(duì)于常規(guī)分析還是不理想的。目前，所有用于氨基酸對(duì)映體的MIP手性傳感器均只能通過(guò)電流信號(hào)的大小區(qū)分L型和D型氨基酸，還無(wú)法通過(guò)電位方法完全區(qū)分L型和D型氨基酸；且MIP合成需要進(jìn)一步優(yōu)化，特別是在其尺寸分布和大規(guī)模生產(chǎn)方面。期望不久后，能夠研究開(kāi)發(fā)出可完全選擇性識(shí)別L型和D型氨基酸的MIP電化學(xué)傳感器。