125I粒子抑制裸鼠T24移形細(xì)胞癌效果

焦德超，許凱豪，韓新巍，張全會，李宗明，王艷麗

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院介入科，河南 鄭州 450052)

目前125I粒子鏈(將125I放射性粒子逐粒串成鏈狀結(jié)構(gòu))已用于近距離放射治療(簡稱放療)膽管癌、食管癌、門靜脈癌栓[1-2]。輸尿管為細(xì)管條狀結(jié)構(gòu)，體積較小腫瘤(直徑5～10 mm)即可引起梗阻癥狀，而在狹小的輸尿管內(nèi)125I粒子更易發(fā)揮近距離放療效果[3]。輸尿管和膀胱上皮均由移形上皮細(xì)胞組成。本研究觀察不同活度125I粒子對裸鼠T24移形細(xì)胞癌的抑制效果，以期為臨床應(yīng)用125I粒子鏈治療輸尿管移形細(xì)胞癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為BABL/c裸鼠40只，雄性，4～6周齡，體質(zhì)量18～24 g，購自九睿生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-2008號]。實驗瘤株為T24人膀胱移行細(xì)胞癌，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(SCSP-536)。125I粒子購自天津賽德生物制藥有限公司，規(guī)格0.8 mm×4.5 mm；125I吸附銀棒，其外壁為0.05 mm厚鈦殼。放射性粒子源能量27～35 MeV，半衰期59.6天。治療計劃系統(tǒng)(treatment plan system, TPS)為北京航空航天大學(xué)研制。

1.2 動物分組及處理 將對數(shù)生長期T24移行細(xì)胞懸液(濃度5×107/ml)接種于裸鼠靠近前肢皮下。10～15天后，待荷瘤裸鼠瘤徑達5～7 mm時，將裸鼠隨機分為高(0.9 mCi、33.3 MBq)、中(0.6 mCi、22.2 MBq)、低(0.3 mCi、11.1 MBq)活度組和對照組，每組10只。于無菌條件下以10%水合氯醛40 mg/kg體質(zhì)量腹腔麻醉荷瘤鼠后，以碘伏消毒移植瘤處3 cm范圍內(nèi)皮膚，于DSA(Sienmens Artis Zeego DSA機)引導(dǎo)下將18G穿刺針刺入腫瘤中心并植入1枚粒子(必要時使用Siemens虛擬導(dǎo)航)，對照組植入不含核素的空白粒子。見圖1。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 90%腫瘤體積吸收劑量(D90) 采用Siemens 3.0T verio高場強MR掃描儀和裸鼠專用線圈，于粒子植入即刻及植入后10、20天分別進行軸位和冠狀位 T1W及T2W序列掃描。T1W掃描參數(shù)：TR 604.0 ms, TE 13.0 ms, 層厚1 mm，空間分辨力0.4 mm×0.4 mm×1.0 mm；T2W掃描參數(shù)：TR 4 260.0 ms, TE 73.0 ms, 層厚1 mm, 空間分辨力0.3 mm×0.3 mm×1.0 mm；視野100 mm×100 mm，翻轉(zhuǎn)角15°，矩陣256×256。將MR圖像輸入TPS，分別計算高、中、低活度組D90。見圖2。

1.3.2 抑瘤率(inhibitory rate, IR) 計算高、中、低活度組植入粒子后10、20天的IR。IR=(對照組腫瘤體積—實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。于MRI上測量腫瘤橫斷面最大徑a及垂直徑b，計算腫瘤體積，腫瘤體積=(a×b2)/2(mm3)。

1.3.3 病理檢查 粒子植入后10、20天，完成MR掃描后每組處死5只動物，取距粒子3～10 mm范圍內(nèi)腫瘤組織，部分以甲醛固定進行HE染色，部分保存于液氮內(nèi)待檢凋亡和免疫指標(biāo)，并妥善處理粒子。

觀察常規(guī)HE染色片時，采用放療反應(yīng)分級(radiation reaction grade, RRG)標(biāo)準(zhǔn)評價結(jié)果：3分，腫瘤細(xì)胞完全消退或僅剩少量癌灶；2分，腫瘤組織明顯纖維化，仍可見腫瘤細(xì)胞存在；1分，可見大量腫瘤細(xì)胞，少量或無纖維化。以TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況，熒光顯微鏡下隨機觀察5～10個視野，計數(shù)每個高倍(×400)視野中平均凋亡細(xì)胞數(shù)量，獲得凋亡細(xì)胞數(shù)百分比即凋亡指數(shù)。采用免疫印跡法檢測B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白表達，200倍視野下觀察染色強度和染色陽性細(xì)胞數(shù)量，以胞漿見黃色顆粒為陽性，根據(jù)染色強度及陽性細(xì)胞百分比計算表達量[4]。

圖1 裸鼠移植瘤內(nèi)125I粒子植入 A.麻醉狀態(tài)下的荷瘤裸鼠； B.DSA透視下穿刺入腫瘤中心； C.于腫瘤中心植入1枚125I粒子(箭)； D.植入粒子(箭)后MRI

圖2 高活度組粒子植入后10天劑量體積直方圖，D90為19.02 Gy，紅色為100%處方劑量覆蓋區(qū)域，藍色為60%處方劑量覆蓋區(qū)域

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用Mann-Whitney檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D90及IR125I粒子植入后10、20天，高、中、低活度組裸鼠D90及IR均逐漸降低(P均<0.05)，各組植入后20天均較植入后10天升高(P均<0.05)，見表1、圖3。植入后10天(r=0.96)、20天(r=0.93)腫瘤D90與IR均呈正相關(guān)(P均<0.05)。

表1 植入125I粒子后10、20天各組裸鼠D90及IR比較(±s)

表1 植入125I粒子后10、20天各組裸鼠D90及IR比較(±s)

組別D90(Gy)植入后10天植入后20天t值P值IR(%)植入后10天植入后20天t值P值高活度組21.37±2.0340.63±2.51-23.22<0.0130.72±1.0556.80±1.55-16.37<0.01中活度組14.19±1.4021.69±1.42-10.26<0.0124.38±1.4346.80±1.21-12.03<0.01低活度組6.32±1.5111.51±1.72-5.30<0.0119.92±1.1438.50±1.58-16.44<0.01F值365.141 230.30--781.063 492.60--P值<0.01<0.01--<0.01<0.01--

圖3 粒子植入后10、20天MRI測量瘤體大小及分離實體瘤所見 A1、A2.分別為對照組術(shù)后10天MRI及分離實體瘤； A3、A4.分別為高活度組術(shù)后10天MRI及分離實體瘤； B1、B2.分別為對照組術(shù)后20天MRI及分離實體瘤； B3、B4.分別為高活度組術(shù)后20天MRI及分離實體瘤

2.2 各組HE染色RRG、凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白表達 植入125I粒子后10、20天，高、中、低活度組粒子周圍5 mm以內(nèi)腫瘤組織均見明顯壞死，粒子活度越大、時間越長，壞死范圍越大。各組裸鼠125I粒子植入后10、20天RRG、凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。高、中、低活度組粒子植入后10、20天RRG分級及凋亡指數(shù)逐漸降低，且均高于對照組(P均<0.05)；植入后20天RRG、凋亡指數(shù)均高于植入后10天(P均<0.05)，見表2、圖4。高、中、低活度組Bcl-2蛋白表達逐漸增加，且均低于對照組(P均<0.05)；3組粒子植入后20天Bcl-2蛋白表達均低于植入后10天(P均<0.05)；見表2、圖5。

表2 各組HE染色RRG、凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白表達比較(±s)

表2 各組HE染色RRG、凋亡指數(shù)及Bcl-2蛋白表達比較(±s)

組別RRG 植入后10天植入后20天t值P值高活度組1.50±0.452.10±0.70-10.70<0.01中活度組1.00±0.711.40±0.55-3.050.02低活度組0.40±0.381.00±0.02-2.900.04對照組0.20±0.060.21±0.08-0.160.88F值12.2717.19--P值<0.01<0.01--組別凋亡指數(shù)(%)植入后10天植入后20天t值P值高活度組15.63±3.1136.71±3.33-46.19<0.01中活度組13.82±2.6326.43±3.04-6.500.02低活度組 9.50±2.2717.12±3.50-6.500.02對照組 3.55±1.08 4.03±1.220.210.32F值113.12472.94--P值<0.01<0.01--組別Bcl-2蛋白表達植入后10天植入后20天t值P值高活度組3.57±1.502.04±1.4021.93<0.01中活度組4.01±1.252.82±1.5319.33<0.01低活度組4.23±1.143.11±0.8820.15<0.01對照組6.67±1.196.28±1.342.840.13F值19.4568.44--P值<0.01<0.01--

3 討論

125I輻射可損傷DNA，造成DNA雙鍵斷裂或錯誤復(fù)制，破壞腫瘤細(xì)胞基因穩(wěn)定性[5]。既往研究[6-8]分別將放射性粒子植入多種腫瘤模型(胰腺癌、直腸癌及肝癌等)進行IR分析，發(fā)現(xiàn)125I局部累積劑量是IR的主要影響因素。本研究結(jié)果顯示，植入不同活度粒子后，移形細(xì)胞瘤裸鼠IR與累積劑量D90之間呈高度正相關(guān)，即伴隨局部累積劑量增高，腫瘤明顯消退，表明125I放射性粒子對于裸鼠人移行細(xì)胞癌抑制效果明確，且同期內(nèi)高活度組較低活度組抑制效率更高。杜明華等[9]以近距離125I照射T739近交系小鼠膀胱低分化移行細(xì)胞癌(采用盲穿法在腫瘤內(nèi)植入1枚125I粒子)，植入粒子后20天IR為13.24%；本研究中各組IR均遠高于此，差異產(chǎn)生的原因可能為所用細(xì)胞系及粒子活度不同，且腫瘤體積測量方法亦不同。

既往多于盲穿下完成粒子植入裸鼠移植瘤。本研究采用DSA引導(dǎo)下植入粒子，盡管透視增加了手術(shù)操作時間及X線照射劑量，但粒子分布于腫瘤中心可使劑量學(xué)分布更加科學(xué)。既往采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小，但皮下脂肪、皮膚會影響游標(biāo)卡尺測量準(zhǔn)確性，使用游標(biāo)卡尺測量時，皮膚與腫瘤的相對位置可能發(fā)生變化，導(dǎo)致測量誤差。本研究以MRI評價粒子植入后腫瘤體積變化，測量瘤徑相對精確，采用(a×b2)/2計算腫瘤體積接近于真實，但操作稍復(fù)雜，且費用較高。

本研究IR、HE染色劑及凋亡指數(shù)檢測結(jié)果均顯示0.9 mCi125I粒子抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長效果最佳，結(jié)合既往粒子鏈劑量學(xué)研究[10-11]結(jié)果，可以認(rèn)為高活度粒子能在狹小的阻塞輸尿管內(nèi)發(fā)揮更好的近距離放療作用，且伴隨腫瘤回縮，腫瘤與粒子貼合更緊密，局部粒子活度可能高于TPS模擬計算劑量，彌補單粒子鏈劑量相對較低的缺陷。王娟等[12]則認(rèn)為盡管高活度粒子能較低活度粒子獲得更高的IR，但其劑量落差相對較大，劑量分布不均勻可導(dǎo)致靶區(qū)內(nèi)平均劑量降低。

圖4 熒光顯微鏡下所示細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400) A.對照組粒子植入后10天； B、C.中活度組粒子植入后10天(B)、20天(C)

圖5 免疫印跡法所示Bcl-2蛋白表達(×200) A.對照組粒子植入后10天； B、C.中活度組粒子植入后10天(B)、20天(C)

Bcl-2蛋白位于線粒體內(nèi)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是與凋亡相關(guān)基因。本研究高、中、低活度組Bcl-2蛋白表達逐漸降低，植入粒子20天后Bcl-2蛋白表達均低于植入后10天，且均低于對照組，提示Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是125I粒子治療腫瘤的主要機制之一。

綜上所述，125I放射性粒子對裸鼠人移行細(xì)胞癌具有較強抑制作用，且具有劑量及時間正相關(guān)效應(yīng)；抑制凋亡蛋白Bcl-2表達、促進腫瘤細(xì)胞凋亡是其作用機制之一。