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    維生素K2促進(jìn)BM-MSCs成骨分化及其機(jī)制研究

    2020-10-27 01:54:54許志賢何武兵柯鐵張永發(fā)傅超鋒蔡加琴張桂楓
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:成骨成骨細(xì)胞分化

    許志賢 何武兵 柯鐵 張永發(fā) 傅超鋒 蔡加琴 張桂楓

    福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院/福建省立醫(yī)院,福建 福州 350001

    各種原因如創(chuàng)傷、感染等造成的骨缺損、骨不愈合一直是骨科治療的難題之一,骨組織工程、生長因子和基因修飾是研究較多的治療手段,以提高骨密度從而促進(jìn)骨的再生[1]。由于骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived-mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是一類來源于中胚層且具有強(qiáng)大增殖潛力和多向分化能力的一種前體干細(xì)胞,其來源不受限制,取材方便,分離后在體內(nèi)或特定的條件下,能夠向成骨細(xì)胞分化[2],是再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究中重要的種子細(xì)胞,在骨組織工程和細(xì)胞治療中具有廣闊的應(yīng)用前景,也為骨科疑難問題提供了新的解決途徑。維生素K2是一種脂溶性維生素,是參與血液凝固的關(guān)鍵因子[3]。流行病學(xué)研究[4]顯示缺乏維生素K2可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥和老年人的骨關(guān)節(jié)炎。此外,它在臨床上已被用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥,并且可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化發(fā)揮其保護(hù)作用[5]。本研究旨在觀察不同濃度維生素K2對BM-MSCs成骨分化過程的影響,探討維生素K2對BM-MSCs成骨信號軸中Smad1/5/8、Runx2、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix) 等表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,為維生素K2作為潛在的促成骨分化因子協(xié)同MSCs應(yīng)用于骨缺損等相關(guān)骨科疾病提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    DMEM低糖培養(yǎng)基 (Gibco公司,美國);胎牛血清 (FBS,賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);青霉素-鏈霉素混合液(Gibco公司,美國),0.25%胰酶 (Gibco公司,美國);CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒(碧云天公司,中國);維生素K2 (Sigma公司,美國);成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen公司,美國);PCR相關(guān)試劑isoPlus、PrimesScriptTMRT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ Kit(Takara,Japan);Runx2 兔抗鼠單克隆抗體(Abcam公司,英國);Smad1/5/8 兔抗鼠單克隆抗體(Novus公司,美國);Osterix兔抗鼠單克隆抗體(Abcam公司,英國);倒置相差顯微鏡(Olympus IX50,日本);熒光定量PCR儀器 (Eppendorf,德國);Western blot成像系統(tǒng)(Bio. Rad,美國);Western blot半干轉(zhuǎn)膜儀 (Bio. Rad,美國)。

    1.2 方法

    1.2.1BM- MSCs分離、培養(yǎng):按前期實驗方法[6]對骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。 選取1月齡SD大鼠,雌雄不限 [購自福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,實驗動物許可證號: SYXK(閩)2016-0004]。無菌環(huán)境下抽取脛骨骨髓,加入肝素抗凝?;烊隤ercoll分離液進(jìn)行離心,獲取鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。接種于培養(yǎng)瓶中,加入L-DMEM完全培養(yǎng)基,于5% CO2, 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后換液,待細(xì)胞融合80%后進(jìn)行傳代。

    1.2.2CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力:將生長良好的BM-MSCs以10 000/cm2的密度接種于96孔板,孵育24 h后,分為加藥組(維生素K2組)和對照組,加藥組加入含維生素K2濃度(10-9~10-4mol/L)的L-DMEM,對照組加入L-DMEM,每組4個樣本,分別于24、48和72 h檢測細(xì)胞增殖能力。每孔加入10 μL CCK-8溶液,未接種細(xì)胞孔調(diào)零,37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育 1 h,酶標(biāo)儀 450 nm 處測吸光度值。

    1.2.3Real-time PCR檢測成骨相關(guān)基因BMP-2表達(dá):將生長良好的BM-MSCs接種于六孔板,待細(xì)胞融合至70%,吸棄培養(yǎng)液。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果,將后續(xù)實驗分為兩組:加藥組和對照組。加藥組加入含不同濃度的維生素K2 (10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 μmol/L)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,對照組是成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,置于5% CO2, 37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第3天收集細(xì)胞,每孔細(xì)胞加入 1 mL的RNA裂解液,提取細(xì)胞總RNA并檢測濃度,反轉(zhuǎn)錄后實時熒光定量PCR檢測成骨相關(guān)基因BMP-2的表達(dá)。引物序列:GAPDH上游引物為 5’- TGT TCC TAC CCC CAA TGT GT-3’,下游引物 為5’-GGT CCT CAG TGT AGC CCA AG-3’,BMP-2 上游 引物為 5′-TGTGG ACTTCAG TGATGTG-3′,下游引物 為 5′-TGGAGTTCAGG TGGT CAG-3′。

    1.2.4茜素紅染色:將生長良好的BM-MSCs接種于六孔板,待細(xì)胞融合至70%,吸棄培養(yǎng)液。實驗分為兩組:加藥組和對照組,加藥組加入含不同濃度的維生素K2 (10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 μmol/L)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為對照組,置于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),于成骨誘導(dǎo)的第7天、14天和21天,行茜素紅染色。方法如下:PBS清洗細(xì)胞2遍后,每孔加4%多聚甲醛固定20 min,PBS清洗2次后,加入1.5 mL茜素紅染液,30 min后PBS清洗2遍,放入倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

    1.2.5Western blot檢測Smad1/5/8, Runx2及Osterix蛋白表達(dá)水平:將生長良好的BM-MSCs接種于六孔板,待細(xì)胞融合至70%,吸棄培養(yǎng)液。實驗分為兩組:加藥組和對照組,加藥組加入終濃度為1 μmol/L維生素K2的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為對照組,置于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),3 d后收集細(xì)胞,提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣品,經(jīng)8% SDS-PAGE分離,電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上后,封閉2 h,加入一抗(兔抗Smad1/5/8,Runx2, Osterix抗體或兔抗-β-actin 抗體) 4 ℃過夜,1 × TBST溶液洗滌5次,每次5 min,加二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG 抗體),室溫孵育2 h,ECL顯色,放入Bio-Rad成像儀中,打開軟件進(jìn)行掃描與分析。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 BM-MSCs的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

    原代培養(yǎng)BM-MSCs 48 h時,細(xì)胞形態(tài)多呈短梭形和多角形,隨著培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞呈三角形、多角形和梭形;一周左右可見細(xì)胞趨于融合。第3代細(xì)胞形態(tài)基本趨于梭形(圖1)。后續(xù)實驗所用的細(xì)胞是第三代。

    圖1 BM-MSC形態(tài)學(xué)觀察(×200)Fig.1 Aspect of BM-MSCs at confluence(×200)

    2.2 不同濃度維生素K2對BM-MSCs細(xì)胞活性的影響

    使用CCK法分析不同濃度的維生素K2處理BM-MSCs細(xì)胞不同時間后對細(xì)胞生長的影響。與對照組比較,隨著處理時間的延長,維生素K2在濃度小于1 nmol/L時不影響B(tài)M-MSCs的生長活性,維生素K2在濃度為10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L時明顯促進(jìn)BM-MSCs的生長(P<0.05),當(dāng)濃度高于1 μmol/L時對BM-MSCs的活力呈抑制趨勢,10 μmol/L時則明確抑制細(xì)胞的生長(P<0.05),見圖2??梢姴煌瑵舛鹊木S生素K2對BM-MSCs生長影響作用不同,中濃度(10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 μmol/L)維生素K2對BM-MSCs生長呈促進(jìn)作用。

    圖2 維生素K2對BM-MSC生長的影響注:與對照組比較,*P<0.05, #P<0.01。Fig.2 Effects of Vitamin K2 on the growth of

    2.3 不同濃度維生素K2對BM-MSCs成骨過程中BMP-2mRNA的影響

    不同濃度維生素K2干預(yù)72 h后,Q-PCR結(jié)果顯示,與對照組比較,不同濃度(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)的維生素K2對BM-MSCs成骨過程中BMP-2 mRNA表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用,在劑量范圍內(nèi),隨著濃度的增加,BMP-2 mRNA表達(dá)升高越明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且1 μmol/L維生素K2對BMP-2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用比10 nmol/L和100 nmol/L更明顯(P<0.05),見圖3。

    圖3 維生素K2對BM-MSCs成骨過程中BMP-2 mRNA的影響注:與對照組比較,*P<0.01;與10 nmol/L和100 nmol/L組比較,&P<0.05。Fig.3 Effects of Vitamin K2 on the expression of BMP-2 mRNA in BM-MSCs

    2.4 維生素K2對BM-MSCs成骨過程中鈣結(jié)節(jié)形成的影響

    鈣結(jié)節(jié)是BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志之一。與對照組比較,不同濃度(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)的維生素K2在BM-MSCs成骨分化的第7、14、21天均具有促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成的作用,并且該作用呈濃度依賴性(圖4),表明維生素K2在BM-MSCs在成骨分化整個過程均發(fā)揮促進(jìn)作用。

    圖4 不同濃度維生素K2對BM-MSCs成骨分化過程中鈣結(jié)節(jié)的影響Fig.4 Effects of Vitamin K2 with Different Concentrations on the Calcium Nodules during Osteogenic Differentiation of BM-MSCs

    2.5 維生素K2對BM-MSCs成骨過程中Smad1/5/8、Runx2 及 Osterix 蛋白表達(dá)的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,1 μmol/L的維生素K2處理BM-MSCs 3 d后,可明顯增強(qiáng)成骨信號軸Smad1/5/8、Runx2和Osterix蛋白表達(dá)水平 (圖5)。

    圖5 維生素K2對BM-MSCs中Smad1/5/8、Runx2 和Osterix表達(dá)的影響Fig.5 Effect of vitamin K2 on expression of Smad1/5/8, Runx2 and Osterix in BM-MSCs

    3 討論

    維生素K2是維生素K家族中唯一具有生物活性的脂溶性維生素, 是人體骨和鈣代謝的必需物質(zhì),在骨和鈣代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵及決定性的作用[7]。近年的研究[8]已經(jīng)證實維生素K2對成骨細(xì)胞具有保護(hù)作用,維生素K2可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和體外成骨細(xì)胞-骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變,包括細(xì)胞外基質(zhì)中的OCN積累、Runx2和堿性磷酸酶(ALP)的上調(diào)以及成骨基因的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化,因此在骨質(zhì)疏松的治療中可能發(fā)揮重要作用。BM-MSCs因具備強(qiáng)大的增殖能力及分化能力已經(jīng)成為骨組織工程重要的種子細(xì)胞,在骨折愈合及骨質(zhì)疏松等骨科疾病的治療都具有重要價值。如何使BM-MSCs定向成骨分化及探索內(nèi)在機(jī)制將成為研究的焦點。維生素K2對BM-MSCs生化和成骨分化作用卻未見報道,此次研究結(jié)果顯示BM-MSCs的生長受維生素K2的濃度變化影響較大,低濃度(小于1 nmol/L)不影響B(tài)M-MSCs的生長,中濃度維生素K2(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)明顯促進(jìn)BM-MSCs的生長,而高濃度維生素K2(高于1 μmol/L) 呈明顯地抑制作用。中濃度維生素K2在BM-MSCs成骨分化的第7、14、21天均具有明顯促進(jìn)礦化的作用。

    目前已知多種信號通路如Wnt/β-catenin、MAPK、成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)及ERK等參與BM-MSCs的成骨分化過程[9-12]。這些信號相互聯(lián)系相互影響,組成復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)節(jié)BM-MSCs的成骨分化。研究[13-14]表明BMP信號通路在骨組織形成、間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及骨再生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有報道[15]顯示維生素K2通過誘導(dǎo)自噬而促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成骨分化。本研究中維生素K2在中濃度范圍內(nèi)(10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L)可顯著促進(jìn)骨髓來源BM-MSCs的成骨分化,促進(jìn)成骨相關(guān)因子BMP-2mRNA的表達(dá),且與在該濃度范圍內(nèi)呈藥物劑量相關(guān)性。后續(xù)研究采用不影響B(tài)M-MSCs生長且保持促進(jìn)成骨作用的藥物濃度(1 μmol/L)。Smad信號通路是調(diào)控BMP發(fā)揮成骨作用的主要通路,Runx2和Osterix 都是BMP/Smad通路重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[16-17]。Runx2是參與成骨細(xì)胞分化與骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子之一,該基因發(fā)生突變后將會導(dǎo)致顱骨銷骨發(fā)育不全綜合征[18]。Osterix在成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用,研究[19]發(fā)現(xiàn)Osterix在小鼠胚胎發(fā)育期的骨形成細(xì)胞中高表達(dá),敲除后小鼠的骨組織發(fā)生發(fā)生嚴(yán)重障礙。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)維生素K2處理3天后,BM-MSCs的Smad1/5/8、Runx2以及Osterix蛋白水平均較對照組有顯著升高,表明維生素K2對BM-MSCs成骨分化早期的促進(jìn)作用可能是通過這一信號通路實現(xiàn)。

    綜上所述, 本次研究初步證實了維生素K2具有定向促進(jìn)BM-MSCs成骨分化的作用,并且成骨信號軸BMP-2/Smads/Runx2/Osterix與維生素K2的促成骨分化作用密切相關(guān),是維生素K2促進(jìn)成骨分化的分子機(jī)制之一,為維生素K2作為潛在的促成骨分化因子協(xié)同MSCs用于骨缺損等相關(guān)骨科疾病提供實驗基礎(chǔ)。

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