左、右歸丸通過調節(jié)AMPK/mTOR通路抑制大鼠股骨成脂化的實驗研究

胡美思 張文達 任艷玲

遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是以女性絕經后雌激素分泌減少、骨轉換加速和易發(fā)骨折為特點的一類骨質疏松，臨床伴有骨量快速降低與骨髓脂肪異常積累[1-3]。成骨、脂肪細胞以競爭的方式由骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化形成，且兩者分化呈“此消彼長”的趨勢[4-5]。BMSCs骨向與脂向分化不均與PMOP病理相關。大量研究表明[6-7]，抑制BMSCs脂向分化，促進骨向分化，調節(jié)骨-脂分化平衡能夠改善骨丟失。左、右歸丸是“陰陽互濟”代表方，既往研究[8]表明，左、右歸丸均能抑制去卵巢大鼠脂向分化，促進骨形成，但改善機制尚不明確。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是機體能量感受器，通過感應機體能量狀態(tài)而被激活，以參與調節(jié)脂質、蛋白質合成，自噬等生命過程[9]。本研究將通過AMPK/mTOR通路初步探討左、右歸丸對PMOP模型大鼠股骨脂向分化的調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：60只SD雌性未生育大鼠[許可證號：SCXK(京)2014-0010]，SPF級，2月齡，體重200～220 g，購于遼寧長生生物技術有限公司，并于遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.1.2試劑與儀器:SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒(WLA013)、AMPKα抗體(WL02254)、mTOR抗體(WL02477)、p-mTOR抗體(WL03694)、PPARγ抗體(WL01800)、C/EBPα抗體(WL02959)、C/EBPβ抗體(WL0 056 A)、內參β-actin(WL01845)均由wanleibio提供；p-AMPKα抗體(ab133448，abcam)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time,RR036 A，Takara)；SYBR Premix Ex TaqTMII(RR820，Tli RNaseH Plus)；酶標儀(BIOTEK)； Trizol(135306，Ambion),熒光定量PCR儀(CG-05，Heal Force)；Micro 17R微量臺式離心機(美國Thermo公司)；電泳儀(DYY-7C)與轉移槽(DYCZ-40D)均由北京六一公司提供；數字化全身骨密度儀(STRATOS DR,法國，Diagnostic Medical System SA)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組：大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為空白組(KB)、假手術組(SHAM)、模型組(OVX)、左歸丸組(ZGW)、右歸丸組(YGW)、補佳樂組(Estradiol Valerate,BJL)，共6組。除KB組外，其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行麻醉，SHAM組大鼠摘除雙側卵巢周圍等量脂肪，剩余大鼠從背部摘除雙側卵巢，建立PMOP模型大鼠，除造模、灌胃等原因導致大鼠死亡12只，取材時納入大鼠48只，每組8只。

1.2.2藥物制備與給藥劑量：戊酸雌二醇片(商品名：補佳樂，批號：國藥準字J20130009，DELPHARM Lille S.A.S.)用蒸餾水制備為0.1 mg/L的藥液。左歸丸：熟地黃24 g，炒山藥12 g，鹿角膠12 g(烊化)，菟絲子12 g(包煎)，山萸肉12 g，枸杞子12 g，牛膝9 g，龜板膠12 g(烊化)。右歸丸：熟地黃24 g，炒山藥12 g，菟絲子12 g(包煎)，附子6 g(先煎)，山茱肉12 g，肉桂6 g，枸杞子12 g，杜仲9 g，當歸9 g，鹿角膠12 g(烊化)。左、右歸丸生藥購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，經中藥飲片質量管理小組進行質量鑒定，自制成水煎液(生藥量：1 g/mL)。造模3 d后，大鼠灌胃給藥，KB、SHAM、OVX、ZGW、YGW、BJL組灌胃劑量分別為：蒸餾水1.0 g/kg、蒸餾水1.0 g/kg、蒸餾水1.0 g/kg、左歸丸9.69 g/kg、右歸丸10.52 g/kg、補佳樂藥液9×10-5g/kg，每周連續(xù)灌胃6 d，休息1 d，每天灌胃1次，連續(xù)給藥12周。

1.2.3檢測大鼠右側股骨骨密度：大鼠取材前，采用乙醚麻醉，應用數字化全身骨密度儀(型號STRATOS DR,法國)檢測各組大鼠右側股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，采用DEX數字立體扇掃，結合雙能X射線吸收和二維扇束成像技術，通過自動病人屏幕觀察定位技術(Easy Scan)直接探測，檢測速度3 min/全身，分辨率400 μm，峰值電壓43-70KeV,激光指示器波長670 nm。儀器由遼寧中醫(yī)藥大學慢性病醫(yī)院康復中心提供,掃描時無介質。

1.2.4實時熒光定量PCR法檢測mRNA的表達：采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠右側股骨干骺端PPARγ、AMPK、mTORC1 mRNA的表達，每組3只。Trizol 法提取骨組織總RNA，反轉錄合成cDNA，引物序列由Takara公司合成：GAPDH上游引物5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’；PPARγ上游引物：5’TTGATTTCTCCAGCATTTC-3’，下游引物5’-TGATCGCACTTTGGTATT-3’；AMPK上游引物5’TTCGGGAAAGTGAAGGTGGG-3’，下游引物5’-TCTCTCTGCGGATTTTCCCG-3’；mTORC1上游引物5’-AGGACCAGAAGAAGGGTGTG-3’，下游引物5’-GAAAAGTTACATGCCGGGCT-3’。反轉錄條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。按照熒光定量PCR試劑盒配置反應體系，設置PCR熱循環(huán)參數:95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;60 ℃，30 s收集熒光(40個循環(huán))。結果用相對定量法:2-△△CT法計算目的mRNA相對表達量。

1.2.5Western blot法檢測蛋白的表達：采用Western blot法檢測大鼠右側股骨干骺端PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR蛋白的表達，每組3只。液氮研磨骨組織，稱取0.2 g，加入相應體積裂解液充分研磨。提取蛋白，取上清液，加入等量上樣緩沖液以蛋白變性。進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣等量蛋白，電壓80 V，恒壓電泳2.5 h。轉印、封閉，封閉條件：37 ℃水浴震蕩1 h。孵育一抗、二抗，一抗蛋白濃度分別為：1∶500、1∶500、1∶500、1∶500、1∶2 000、1∶500、1∶500;二抗孵育條件：37 ℃水浴震蕩45 min。洗膜、底物發(fā)光。用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 左、右歸丸對PMOP大鼠右側股骨BMD的影響

與KB組比較，OVX組大鼠BMD顯著降低(P<0.01)，成功制備PMOP模型大鼠；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠BMD明顯升高(P<0.01)；與ZGW組比較，YGW、BJL組大鼠BMD沒有差異(P>0.05)。見表1。

表1 左、右歸丸對PMOP大鼠右側股骨BMD的影響

2.2 左、右歸丸對PMOP大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白以及PPARγ mRNA與蛋白表達的影響

2.2.1左、右歸丸對PMOP大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達的影響：與KB組比較，OVX組大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達降低(P<0.01)；與ZGW組比較，YGW、BJL組大鼠股骨C/EBPα蛋白表達沒有差異(P>0.05)；與ZGW組比較，YGW組大鼠股骨C/EBPβ蛋白表達明顯升高(P<0.01)，BJL組大鼠股骨C/EBPβ蛋白表達沒有顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 左、右歸丸對PMOP大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表達的影響注：與KB組比較，▼▼P<0.01；與OVX組比較，◇◇P<0.01；與ZGW比較，△△P<0.01。Fig.1 Effect of Zuo/Yuo pills on C/EBPα and C/EBPβ proteins expression in PMOP rat femur

2.2.2左、右歸丸對PMOP大鼠股骨PPARγ mRNA與蛋白表達的影響：與KB組比較，OVX組大鼠股骨PPARγ mRNA與蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠股骨PPARγ mRNA與蛋白表達明顯降低(P<0.01或P<0.05)；與ZGW組比較，YGW、BJL組大鼠股骨PPARγ mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與ZGW組比較，YGW組大鼠股骨PPARγ蛋白表達明顯升高(P<0.05)，BJL組大鼠股骨PPARγ蛋白表達沒有顯著差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 左、右歸丸對PMOP大鼠股骨PPARγ mRNA與蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Zuo/Yuo gui pills on PPARγ mRNA and protein expression in PMOP rat femur注：與KB組比較，▼▼P<0.01；與OVX組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01；與ZGW比較，△△P<0.01。

2.3 左、右歸丸對PMOP大鼠股骨AMPK/mTOR信號通路的影響

2.3.1左、右歸丸對PMOP大鼠股骨AMPK mRNA的表達與蛋白磷酸化水平的影響：與KB組比較，OVX組大鼠股骨AMPK mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠股骨AMPK mRNA表達明顯降低(P<0.01)；與ZGW組比較，YGW、BJL組大鼠股骨AMPK mRNA表達明顯升高(P<0.01)。與KB組比較，OVX組大鼠股骨AMPKα磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠股骨AMPKα磷酸化水平明顯降低(P<0.01)；與ZGW組比較，YGW、BJL組大鼠股骨AMPKα磷酸化水平沒有顯著差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 左、右歸丸對PMOP大鼠股骨AMPK mRNA的表達與蛋白磷酸化水平的影響注：與KB組比較，▼▼P<0.01；與OVX組比較，◇◇P<0.01；與ZGW比較，△△P<0.01。Fig.3 Effect of Zuo/Yuo gui pills on AMPK mRNA expression and protein phosphorylation in PMOP rat femur

2.3.2左、右歸丸對PMOP大鼠股骨mTOR mRNA的表達與蛋白磷酸化水平的影響：與KB組比較，OVX組大鼠股骨mTORC1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠股骨mTORC1 mRNA表達明顯升高(P<0.01)。與ZGW組比較，YGW、BJL組大鼠股骨mTORC1 mRNA表達明顯降低(P<0.01)。與KB組比較，OVX組大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.01)；與OVX組比較，ZGW、YGW、BJL組大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平明顯升高(P<0.01或P<0.05)。與ZGW組比較，YGW組大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，BJL組大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖4。

圖4 左、右歸丸對PMOP大鼠股骨mTORC1 mRNA的表達與蛋白磷酸化水平的影響注：與KB組比較，▼▼P<0.01；與OVX組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01；與ZGW比較，△P<0.05，△△P<0.01。Fig.4 Effect of Zuo/Yuo gui pills on mTORC1 mRNA expression and protein phosphorylation in PMOP rat femur

3 討論

中醫(yī)學認為，腎藏精化髓，決定身體的生長發(fā)育機能，具體體現在骨骼“生、長、壯、老、已”的改變。腎精虧虛，則生長發(fā)育機能衰退，骨組織出現相應病理性改變。絕經女性由于腎精虧虛，導致骨、脂代謝紊亂，主要表現為骨量快速下降，BMSCs脂向分化過度，骨髓脂肪異常堆積。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activate receptor gamma,PPARγ)與CCAAT/增強子結合蛋白α、β(CCAAT/enhancer binding protein alpha and beta,C/EBPα、C/EBPβ)在形成脂肪方面發(fā)揮重要作用，CEBP/β能夠誘導PPARγ早期表達，PPARγ誘導并協同C/EBPα調節(jié)成熟脂肪的形成[10]。

AMPK與mTOR存在于所有真核生物中，參與調節(jié)脂質合成、代謝[11-12]。AMPK是細胞能量檢測與調控因子，當機體低能狀態(tài)時被激活，活化的AMPK促進產生ATP的途徑(脂肪分解)，并抑制消耗ATP的途徑(蛋白質、脂質合成、mTOR信號通路等)以平衡機體能量的產生與消耗[13]。mTOR位于AMPK下游，是磷酸肌醇3激酶(PI3K)樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種復合物mTORC1、mTORC2，其中，活化的mTORC1激活其下游效應分子核糖體S6K激酶1(P70S6k1)和真核翻譯轉錄起始因子(4EBP-1)，參與調節(jié)蛋白質、脂質等的合成，是脂肪組織的調節(jié)信號通路[14]。小型GTP酶Rheb是RAS家族GTP結合蛋白的成員，位于mTOR上游，正向調節(jié)mTORC1，并位于TSC1/2下游，激活的TSC1/2使Rheb從活化狀態(tài)(Rheb-GTP)轉換為失活狀態(tài)(Rheb-GDP)[15]。磷酸化是可逆的蛋白質翻譯后修飾方式之一，低能狀態(tài)下，激活的AMPK通過磷酸化T1227和S1 345位點激活TSC2，活化的TSC2抑制Rheb，進而抑制mTORC1及其下游P70S6k1和4EBP-1,以調節(jié)機體合成、代謝過程[16-17]。

左、右歸丸出自《景岳全書·新方八陣》，是明代張介賓治療腎精虧虛的名方。兩方組成均含有熟地黃、山萸肉、山藥、鹿角膠等，共有填精益髓之效，然兩方在組方功效方面又有區(qū)別，左歸丸在大量滋陰藥熟地黃、龜板膠等中配伍少量補陽之菟絲子、鹿角膠，旨在“陽中求陰”，功效偏于滋補腎陰；右歸丸則在溫陽藥附子、肉桂、鹿角膠等中配伍滋陰之熟地黃、山萸肉等，意在“陰中求陽”，功效偏于溫補腎陽。課題組前期研究表明[8,18]，左、右歸丸能夠降低PMOP大鼠成脂分化，并且偏于滋腎陰的左歸丸通過促進成骨分化同時降低成脂分化；而偏于溫腎陽的右歸丸，助陽以化氣，加速脂質代謝運轉，從而達到調節(jié)PMOP大鼠骨-脂分化平衡的作用。本次實驗基于前期實驗探究左、右歸丸通過AMPK/mTOR通路干預PMOP大鼠成脂分化的作用機理。

本研究結果顯示，OVX組大鼠股骨成脂分化相關基因與蛋白的表達明顯升高，大鼠股骨AMPK mRNA的表達與蛋白磷酸化水平明顯升高，mTORC1 mRNA的表達與蛋白磷酸化水平明顯降低；經左、右歸丸給藥后，PMOP大鼠股骨成脂分化相關基因與蛋白的表達明顯降低，AMPK mRNA的表達與蛋白磷酸化水平明顯降低，mTOR mRNA的表達與蛋白磷酸化水平明顯升高，提示左、右歸丸可能通過干預AMPK/mTOR通路調節(jié)PMOP大鼠股骨成脂分化。然而，兩方的調節(jié)作用亦有差異，其中，滋腎陰的左歸丸可能通過降低AMPK mRNA的表達與蛋白磷酸化水平，升高mTOR mRNA的表達與蛋白磷酸化水平，從而降低PMOP大鼠股骨成脂分化；與左歸丸相比，溫腎陽的右歸丸通過升高AMPK mRNA的表達，降低mTOR mRNA的表達與蛋白磷酸化水平，降低PMOP大鼠股骨成脂分化，并且左歸丸降低大鼠股骨成脂分化的作用優(yōu)于右歸丸，這可能與左、右歸丸調節(jié)AMPK/mTOR通路的差異有關。

本研究初步探討了左、右歸丸通過干預AMPK/mTOR通路調節(jié)PMOP模型大鼠股骨成脂分化，兩方具體作用機制有待進一步研究。