CXCL8及其受體在肺結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用

邢志偉，張 珣，王 紅，韓云霄，張建武*

(1.河北省胸科醫(yī)院輸血科，河北 石家莊 050041；2.河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050041)

結(jié)核病是最常見并可致命的一種傳染病，盡管目前全球在醫(yī)療技術(shù)方面取得了新進(jìn)展，但結(jié)核病仍然是公共衛(wèi)生方面的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)[1]。世界衛(wèi)生組織報(bào)告2016年新增結(jié)核病1 100萬例，死亡140萬例[2]。由于結(jié)核病診斷方法的局限性，所以缺乏最佳診斷方法，臨床醫(yī)生仍然面臨著早期診斷的困惑[3]。結(jié)核病早期檢測(cè)在控制疾病和防止感染蔓延方面具有重要作用，引入新的診斷生物標(biāo)志物有非常重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。CXC趨化因子配體8(cysteine X chemokine ligand 8，CXCL8)被認(rèn)為是一種典型的趨化因子，屬于CXC家族，負(fù)責(zé)免疫細(xì)胞在炎癥部位的募集和激活。CXCL8在生理狀態(tài)下表達(dá)較少，但可由促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等迅速誘導(dǎo)。CXCL8的功能主要依賴于其與特定細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體CXC趨化因子受體1(cysteine X chemokine receptor 1,CXCR1)和CXC趨化因子受體2(cysteine X chemokine receptor 2,CXCR2)的相互作用。趨化因子在結(jié)核分枝桿菌的正常免疫應(yīng)答中起著核心作用[5]，可以招募免疫細(xì)胞，是肉芽腫形成的絕對(duì)必要條件。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)測(cè)定活動(dòng)性肺結(jié)核患者、潛伏性結(jié)核感染者及健康對(duì)照者外周血中CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)水平，評(píng)價(jià)在肺結(jié)核診斷中的臨床意義。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年3—12月我院結(jié)核科住院的初治肺結(jié)核患者(肺結(jié)核組)125例，男性77例，女性48例，年齡21～63歲，平均(40.2±11.7)歲，肺結(jié)核診斷參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2017)，以病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查為主，結(jié)合胸部影像學(xué)、流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)及其他相關(guān)輔助檢查和鑒別診斷進(jìn)行綜合分析作出診斷。根據(jù)影像學(xué)診斷，分為肺部形成空洞組31例，無空洞組94例；所有肺結(jié)核患者給予標(biāo)準(zhǔn)化治療，包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇聯(lián)合強(qiáng)化治療2個(gè)月后，異煙肼、利福平鞏固治療4個(gè)月，即抗結(jié)核方案治療6個(gè)月。收集同期潛伏性結(jié)核感染109例，男性51例，女性58例，年齡22～65歲，平均(41.3±13.6)歲，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)即痰涂片及培養(yǎng)確定陰性，結(jié)核菌素試驗(yàn)陽性，有結(jié)核病接觸史，結(jié)合臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)無肺結(jié)核特征；同期體檢健康者(健康對(duì)照組)112例，男性65例，女性47例，年齡26～60歲，平均(38.9±10.5)歲。3組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象排除糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病等，無合并病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等傳染性疾病，均為漢族。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者及志愿者簽署書面知情同意書。

1.2主要試劑 總RNA提取試劑Trizol LS購自Invitrogen公司。RT-PCR反應(yīng)體系購自寶生物工程(大連)有限公司。RT-PCR上下游引物購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。RT-PCR擴(kuò)增儀(LightCycler 480Ⅱ，Roche公司)。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象空腹采集靜脈血4 mL，收集在乙二胺四乙酸抗凝管，3 000 r/min離心10 min，分離血漿置于-80 ℃冰箱保存。肺結(jié)核組于抗結(jié)核治療前、抗結(jié)核治療3個(gè)月及6個(gè)月收集標(biāo)本。

1.3.2總RNA提取 分離所得的血漿中加入Trizol LS試劑，體積比為1∶3，操作步驟按說明書進(jìn)行提取總RNA，最后室溫干燥RNA沉淀，加入無RNase的水溶解RNA，放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3RNA濃度測(cè)定 RNA樣品于瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析28 S和18 S兩條亮帶，如果260 nm和280 nm處光密度比值為1.8～2.0，即為合格RNA。

1.3.4RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各指標(biāo)mRNA水平 RNA提取后首先反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書提供的步驟進(jìn)行操作。以反應(yīng)產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系包括1 μL cDNA模板，2 μL 10倍PCR緩沖液(含Mg2+)，0.3 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μL(10 mmol/L)。CXCL8上游引物5′-CTTTGTCCATTCCCACTT-CTGA-3′，下游引物，5′-TCCCTAACGGTTGCC-TTTGTAT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為306 bp；CXCR1上游引物5′-CAGATCCACAGATGTGGGAT-3′,下游引物5′-AGCAGCCAAGACAAACAAACTT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為468 bp；CXCR2上游引物，5′-CTTTTCTACTAGATGCCGC-3′，下游引物5′-AGATGCTGAGACATATGAATTT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為417 bp；GAPDH上游引物5′-GACCAC-TTTGTCAAGCTCATTTCC-3′，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為323 bp。PCR擴(kuò)增條件包括95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共38個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，受試者工作特征(receiver operator characteristic curve，ROC)曲線分析評(píng)價(jià)診斷效能，計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測(cè)各組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA比較 RT-PCR結(jié)果顯示，3組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。活動(dòng)性肺結(jié)核組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和潛伏感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)CXCL8、CXCR1和CXCR2基因表達(dá)比較Table 1 Relative values of gene expression in CXCL8,CXCR1 and CXCR2 by RT-PCR

2.2有無空洞肺結(jié)核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)比較 有空洞組肺結(jié)核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)顯著高于無空洞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 有無空洞肺結(jié)核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)比較Table 2 The expression levels of CXCL8, CXCR1 and CXCR2 in patients with pulmonary tuberculosis

2.3肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)比較 治療3個(gè)月時(shí)CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)水平均顯著低于治療前，治療6個(gè)月時(shí)CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)水平均顯著低于治療前和治療3個(gè)月時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨訪患者抗結(jié)核治療效果良好。見表3。

表3 肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療前后CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)水平比較Table 3 The expression levels of CXCL8, CXCR1 and CXCR2 in patients with pulmonary tuberculosis before and after anti-tuberculosis treatment

2.4ROC曲線 繪制肺結(jié)核組的ROC曲線(圖1)，CXCL8、CXCR1和CXCR2的AUC分別為0.888、0.819、0.756。CXCL8鑒別肺結(jié)核的敏感度和特異度分別為76.8%和90.5%，以1.0為臨界值;CXCR1的敏感度和特異度分別為72.8%和79.2%，以1.09為臨界值；CXCR2的敏感度和特異度分別為59.2%和78.8%，以1.08為臨界值。

圖1 CXCL8、CXCR1 和CXCR2在診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線A.CXCL8;B.CXCR1;C.CXCR2Figure 1 ROC curve of CXCL8, CXCR1 and CX-CR2 in the diagnosis of ac-tive tuberculosis

3 討 論

在先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中趨化因子及其同源受體通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重要作用。趨化因子是一種小的分泌蛋白，含有4個(gè)至關(guān)重要的半胱氨酸殘基保持其結(jié)構(gòu)完整性。根據(jù)這4個(gè)半胱氨酸殘基的排列將趨化因子分為CC、CXC、XC和CX3C，迄今為止，已鑒定出50種趨化因子和20種趨化因子受體[6]。

結(jié)核分枝桿菌主要通過呼吸道進(jìn)入肺泡，被中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等吞噬[7]，引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這些靶細(xì)胞分泌趨化因子CXCL8并啟動(dòng)趨化因子和細(xì)胞因子等級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]。CXCL8主要有2種生物學(xué)活性：趨化作用和白細(xì)胞活化，CXCL8可以通過影響包括結(jié)核分枝桿菌感染在內(nèi)的嚴(yán)重傳染病的發(fā)病機(jī)制而產(chǎn)生重要的臨床效應(yīng)。CXCL8的細(xì)胞外結(jié)合2個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響免疫細(xì)胞的增殖、存活及運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)多種細(xì)胞因子分泌，在炎癥、肺疾病、哮喘及腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用。CXCR1和CXCR2具有76%的序列同源性，以相似的親和力結(jié)合到CXCL8。CXCR1/2的C末端調(diào)節(jié)受體的磷酸化、內(nèi)化、G蛋白偶聯(lián)以及與其他細(xì)胞質(zhì)蛋白的結(jié)合，2個(gè)CXCL8高親和力受體的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是非常復(fù)雜的[9]。有證據(jù)表明，CXCR1是啟動(dòng)磷脂酶D活化的主要受體，CXCR2與細(xì)胞遷移相關(guān)[10]。CXCL8在肺部炎癥中起重要作用，有助于慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展，有文獻(xiàn)表明，慢性阻塞性肺疾病患者痰和支氣管肺泡灌洗液中CXCL8的濃度高于健康志愿者，并且與中性粒細(xì)胞的積累相關(guān)[11]。中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是第一組遷移到感染部位的細(xì)胞。在抵御微生物感染和啟動(dòng)組織修復(fù)中趨化因子通過及時(shí)、協(xié)調(diào)地招募中性粒細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。CXCL8-CXCR1/2軸在感染部位使中性粒細(xì)胞聚集，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞氧化和顆粒釋放，以消除炎癥刺激并增加細(xì)菌清除率。因此，該軸保護(hù)宿主免受進(jìn)一步感染和組織損傷，CXCL8- CXCR1/2軸的中斷可能嚴(yán)重影響宿主對(duì)感染的免疫機(jī)制[14]，甚至導(dǎo)致死亡。

由于CXCL8是炎癥介導(dǎo)過程的關(guān)鍵組成部分，CXCL8及其受體的異常調(diào)節(jié)與許多炎癥介導(dǎo)的疾病有關(guān)，CXCL8最有可能是將中性粒細(xì)胞帶到結(jié)核病患者感染部位的原因，CXCL8是宿主抗結(jié)核防御所必需的。CXCL8與受體CXCR1/2特異性結(jié)合后，可誘導(dǎo)大量炎癥細(xì)胞遷移至特定感染部位，產(chǎn)生局部炎癥免疫應(yīng)答，通過與之偶聯(lián)的G蛋白變構(gòu)激活下游的效應(yīng)分子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。結(jié)核分枝桿菌感染宿主后引起機(jī)體的局部炎癥反應(yīng)，趨化因子及受體同時(shí)參與炎癥應(yīng)答的激活。有研究表明，結(jié)核患者血漿趨化因子及其相應(yīng)受體的表達(dá)水平顯著高于非結(jié)核患者[16]，推測(cè)趨化因子可以遷移到結(jié)核感染部位，誘導(dǎo)有效的Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于清除結(jié)核分枝桿菌。

對(duì)于CXCL8、CXCR1和CXCR2臨床意義的探索中，發(fā)現(xiàn)趨化性細(xì)胞因子CXCL8和受體CXCR1及CXCR2在結(jié)核患者保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT-PCR法檢測(cè)初治肺結(jié)核患者、潛伏性感染者及健康對(duì)照組CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)水平，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核組外周血CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)水平均顯著高于潛伏感染組和正常對(duì)照組(P<0.05)，提示在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中CXCL8、CXCR1和CXCR2表達(dá)升高，但是潛伏性感染組和對(duì)照組的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CXCL8及受體表達(dá)的變化與疾病的進(jìn)展有關(guān)，并影響宿主對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答，根據(jù)不同臨床表型進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，肺部有空洞結(jié)核患者CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA水平均顯著高于無空洞患者?；顒?dòng)性肺結(jié)核患者接受標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療，且患者抗結(jié)核治療效果良好。隨訪6個(gè)月發(fā)現(xiàn)，治療3個(gè)月時(shí)CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA水平表達(dá)明顯低于治療前，且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，CXCL8、CXCR1和CXCR2的mRNA表達(dá)量逐漸降低。

進(jìn)一步應(yīng)用ROC曲線分析CXCL8、CXCR1和CXCR2的診斷效能以及鑒別肺結(jié)核患者的敏感度和特異度。結(jié)果顯示，CXCL8、CXCR1和CXCR2均具有較高的敏感度和特異度。提示CXCL8、CXCR1和CXCR2對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷有一定的優(yōu)勢(shì)，對(duì)病情的評(píng)估有指導(dǎo)作用，可能是區(qū)別活動(dòng)性和潛伏性結(jié)核感染的敏感指標(biāo)。

綜上所述，分析肺結(jié)核患者外周血趨化因子CXCL8和受體CXCR1、CXCR2的表達(dá)變化，在抗結(jié)核感染信號(hào)通路過程中的作用與聯(lián)系，可作為輔助診斷肺結(jié)核病的主要依據(jù)之一，有望成為診斷活動(dòng)性肺結(jié)核病的重要標(biāo)志物，更加深入地了解結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制，為今后結(jié)核病的早期治療及改善結(jié)核病結(jié)局，發(fā)揮重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。