生物活性多甲氧基黃酮羧酸和氨基酸衍生物的合成及其結(jié)構(gòu)表征

劉 偉， 李雪麗， 汪秋安， 單 楊1,,4,*

(1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 湖南 長沙 410125;2.湖南大學(xué) 研究生院 隆平分院， 湖南 長沙 410125;3.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 湖南 長沙 410082；4.果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點實驗室， 湖南 長沙 410125)

多甲氧基黃酮(polymethoxy flavonoids，PMFs)是存在于蕓香科柑橘屬植物中的天然產(chǎn)物。目前已從柑橘屬植物中分離鑒定出40余種多甲氧基類黃酮類化合物，以柑橘(CitrusreticulataBlanco)和甜橙[Citrussinensis(Linn.) Osbeck]中的含量較高。橘皮素(tangeretin)和川陳皮素(nobiletin)是多甲氧基類黃酮類的代表性化合物。

PMFs是具有平面結(jié)構(gòu)和低極性的一類脂溶性黃酮化合物，具有顯著的抗癌、抗炎、抗氧化和防動脈粥樣硬化等廣泛的生物活性[1-3]。它們對HL-60白血病細胞、乳腺腫瘤細胞、小鼠皮膚癌等多種癌細胞具有非同尋常的抗癌抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，川陳皮素在所比較的42種黃酮中顯示出最強的抗增殖活性，其影響范圍包括肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、雌激素陽性受體乳腺癌和雌激素陰性受體乳腺癌6種癌細胞[4]。橘皮素可以在人類結(jié)腸腫瘤細胞內(nèi)通過抑制周期蛋白依賴性激酶 CdK2 和CdK4活動與提升CdK抑制劑 P21和P27的數(shù)量雙重機制抵御癌細胞的影響。研究也表明，橘皮素在人類肺癌細胞中抑制誘導(dǎo)和結(jié)構(gòu)性地表達環(huán)氧酶2(COX-2)來發(fā)揮抗癌作用[5]。

柑橘類果皮提取物中的多甲氧基黃酮物對促炎介質(zhì)前列腺E2(PGE2)和一氧化氮含量的抑制作用顯著，被視為抗炎成分的主要來源[6]。川陳皮素可以調(diào)節(jié)環(huán)氧酶2(COX-2)的活動，從而調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-3和MMP-9)和PGE2的合成，其效果表現(xiàn)為緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的出現(xiàn)[7]。橘皮素和川陳皮素具有較強的抗亞油酸氧化作用。川陳皮素的抗過氧化和清除羥基自由基的能力最強。由于PMFs 的重要生理功能，美國Source One公司已商品化生產(chǎn)一種基于柑橘PMFs和棕櫚果萃取物的保健品，產(chǎn)品名為Sytrinol，該產(chǎn)品具強抗氧化性并兼有抗炎癥效果，該產(chǎn)品全球銷售額每年高達數(shù)億美元[8]。

柑橘多甲氧基黃酮類化合物在實際應(yīng)用中存在水溶性差，生物利用度低的缺點。若在黃酮引入羧基這種親水性集團, 可以增加其親水性，使其容易被人體吸收，更容易發(fā)揮藥效，生物活性提高，應(yīng)用范圍也得到拓寬。因此通過化學(xué)合成在黃酮結(jié)構(gòu)上引入羧基制備黃酮羧酸化合物具有重要應(yīng)用價值[9]。氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)最基本的物質(zhì)，親水性強，生物相容性好，在人體內(nèi)具有重要的生理性能，氨基酸可以對很多生物活性物質(zhì)進行修飾[10]。黃酮氨基酸類衍生物是通過在黃酮分子中引入氨基酸對其結(jié)構(gòu)進行合理的修飾和改造，使其水溶性和對腫瘤細胞的選擇性和抑制活性增強，更容易被腫瘤細胞攝取，同時藥物的毒性降低。Kim等[11]通過物理化學(xué)分析顯示，槲皮素谷氨酸衍生物顯著改善了槲皮素的溶解性、穩(wěn)定性和細胞攝取能力，并證明槲皮素-氨基酸綴合物是一種安全的多藥耐藥性(multiple drug resistance，MDR)調(diào)節(jié)劑。Song等[12]研究結(jié)果顯示，白楊素氨基酸類衍生物的抗人類肝癌和胃癌細胞的活性比母體白楊素都好。另有研究表明，麥黃酮的氨基酸類衍生物可大大提高其生物利用度[13]。

為了提高多甲氧基黃酮類化合物的水溶性和藥用價值，本研究在查閱大量文獻并結(jié)合實驗室前期研究工作的基礎(chǔ)上，利用橘皮素和川陳皮素作為反應(yīng)原料，以較低的成本、相對簡單的方法及較高的產(chǎn)率合成2種水溶性的多甲氧基黃酮羧酸衍生物和4種水溶性的多甲氧基黃酮氨基酸衍生物，采用多種分析測試方法對目標(biāo)化合物進行了結(jié)構(gòu)表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XRC-1型顯微熔點儀，北京泰克有限公司；AV-400型核磁共振儀，德國Bruker公司；1100型液-質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；LCQ-Advantage型離子阱質(zhì)譜，賽默飛世爾科技有限公司；MAT95XP型高分辨質(zhì)譜，美國Finnigan公司；薄層色譜(TLC)和柱層析用硅膠，青島海洋化工廠。

實驗所用試劑均為分析純，無水溶劑經(jīng)去水和重蒸處理。

1.2 實驗方法

以橘皮素和川陳皮素為原料，經(jīng)過氧丙酮氧化反應(yīng)、Williamson反應(yīng)和羧酸與氨基酸的縮合反應(yīng)，合成目標(biāo)化合物，合成路線見圖1。

1.2.13-羥基橘皮素(7)和3-羥基川陳皮素(8)的合成

a為過硫酸氫鉀復(fù)合鹽, CH2Cl2/NaHCO3/Na2CO3, 室溫；b為ClCH2CO2C2H5, K2CO3, DMF, 加熱; c為NaOH水溶液, CH3OH,室溫；d為H2NCH2CO2CH3 或H2NCH(CHC6H5)CO2CH3, EDCI, CH2Cl2, 室溫；e為①NaOH水溶液, CH3OH, 室溫, ②1 mol/L HCl 水溶液, 室溫。圖1 多甲氧基黃酮羧酸和氨基酸衍生物的合成路線Fig.1 Synthesis route of polymethoxy flavonoids carboxylic acid and amino acid derivatives

在1 000 mL的三口燒瓶中，將橘皮素(500 mg,1.34 mmol)或川陳皮素 (500 mg, 1.2 mmol)溶于75 mLV(CH2Cl2)∶V(丙酮)=6∶5的混合溶劑中，加入100 mL弱堿性緩沖溶液 (Na2CO38.0 g，NaHCO33.80 g，水100 mL)，在0 ℃下劇烈攪拌，慢慢加入w=20%過硫酸氫鉀復(fù)合鹽的水溶液70 mL，2 h滴完，在0 ℃冰水浴中反應(yīng)15 h。然后再逐滴加入w=20%過硫酸氫鉀復(fù)合鹽的水溶液70 mL，2 h滴完，在0 ℃下繼續(xù)反應(yīng)15 h(整個反應(yīng)過程維持pH=8)。TLC追蹤至原料點完全消失，停止反應(yīng)，反應(yīng)液靜置分層。水相用CH2Cl220 mL萃取3次，將其與有機相合并，加入適量無水Na2SO4對有機相進行干燥。于濾液中添加5 mg對甲苯磺酸，在室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h，用紫外燈能觀察到反應(yīng)液的表面有一層綠色的熒光，減壓蒸除反應(yīng)溶劑，殘留物經(jīng)硅膠柱層析分離提純[洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1至8∶1]，分別得3-羥基橘皮素淡黃色固體370 mg(產(chǎn)率為71%)或3-羥基川陳皮素淡黃色固體385 mg(產(chǎn)率為74%)。

1.2.2橘皮素-3-O-乙酸乙酯(9)的合成

稱取精制的3-羥基橘皮素(500 mg，1.29 mmol)和無水碳酸鉀(200 mg，1.45 mmol)，置于100 mL圓底燒瓶中，加入6 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)，將反應(yīng)混合物加熱在40 ℃下攪拌反應(yīng)0.5 h，再緩慢滴加氯乙酸乙酯 (1.0 g，8.16 mmol)，將反應(yīng)混合物在40 ℃下繼續(xù)反應(yīng)4 h，TLC追蹤反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫，向反應(yīng)液中加入冷水，靜置沉淀，將分離的固體過濾，用水洗滌并干燥，得粗產(chǎn)品，用硅膠柱層析進行分離提純[洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1]，得到白色固體360 mg，產(chǎn)率為73%。

1.2.3川陳皮素-3-O-乙酸乙酯(10)的合成

以3-羥基川陳皮素(500 mg，1.20 mmol)為反應(yīng)底物，與化合物9的合成方法相同，得到白色固體340 mg，收率為70%。

1.2.4橘皮素-3-O-乙酸(1)的合成

將化合物9(500 mg，1.05 mmol)置于100 mL圓底燒瓶中，用甲醇溶解，在室溫攪拌下向混合物中滴加5% NaOH水溶液1.5 mL。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2 h，TLC追蹤反應(yīng)進程，反應(yīng)結(jié)束后，旋出溶劑，得到白色液體。用6 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)液體pH至2～3，并用CH2Cl2萃取3次，合并有機相，用無水Na2SO4干燥，除去溶劑，得粗產(chǎn)品，用硅膠柱層析進行分離提純[洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1，洗脫劑中加入少量乙酸]，得到白色固體370 mg，產(chǎn)率為78%。

1.2.5川陳皮素-3-O-乙酸(2)的合成

以化合物10(500 mg，1.13 mmol)為反應(yīng)底物，與化合物1的合成方法相同，得到白色固體380 mg，產(chǎn)率為76%。

1.2.6橘皮素-3-O-乙酰甘氨酸甲酯(11)的合成

稱取化合物1(200 mg，0.44 mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(130 mg，0.66 mmol)、4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP，110 mg，0.88 mmol)和甘氨酸甲酯鹽酸鹽(70 mg，0.53 mmol)至100 mL圓底燒瓶中混合，加入20 mL二氯甲烷，在室溫條件下進行反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)進程。待反應(yīng)結(jié)束后，旋除溶劑，向圓底燒瓶中緩慢倒入50 mL HCl(1 mol/L)溶液中，并用CH2Cl220 mL萃取3次，合并有機相，并用無水Na2SO4干燥，過濾后旋除溶劑，得到粗品。經(jīng)硅膠柱層析分離純化[洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1]，得白色固體210 mg，產(chǎn)率93%。

1.2.7川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸甲酯(12)的合成

以化合物2(200 mg，0.42 mmol)為反應(yīng)底物，與化合物11的合成方法相同，得白色固體160 mg，產(chǎn)率92%。

1.2.8橘皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸甲酯(13)的合成

稱取化合物1(200 mg，0.44 mmol)、EDCI(130 mg，0.66 mmol)、4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP，110 mg，0.88 mmol)和苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(150 mg，0.53 mmol)至100 mL圓底燒瓶中混合，加入20 mL二氯甲烷，在室溫條件下進行反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)進程。待反應(yīng)結(jié)束后，旋除溶劑，向圓底燒瓶中緩慢倒入50 mL HCl(1 mol/L)溶液中，并用CH2Cl2萃取(3×20 mL)3次，合并有機相，并用無水Na2SO4干燥，過濾后旋除溶劑，得到粗品。經(jīng)硅膠柱層析分離純化[洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)= 2∶1]，得到白色固體230 mg，產(chǎn)率87%。

1.2.9川陳皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸甲酯(14)的合成

以化合物2(200 mg，0.42 mmol)為反應(yīng)底物，與化合物13的合成方法相同，得到白色固體220 mg，產(chǎn)率83%。

1.2.10橘皮素-3-O-乙酰甘氨酸(3)的合成

稱取化合物11(100 mg，0.19 mmol)在100 mL圓底燒瓶中溶于10 mL甲醇，滴加4 mL NaOH(1 mol/L)溶液，在室溫條件下進行反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液中溶劑旋除，加蒸餾水，然后用HCl(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至2～3，放入冰箱中靜置，抽濾，濾餅干燥后用無水C2H5OH進行重結(jié)晶提純，得到白色固體90 mg，產(chǎn)率93%。

1.2.11川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸(4)的合成

以化合物12(100 mg，0.18 mmol)為反應(yīng)底物，與化合物3的合成方法相同，得到白色固體89 mg，產(chǎn)率91%。

1.2.12橘皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸(5)的合成

稱取化合物13(100 mg，0.16 mmol)在100 mL圓底燒瓶中溶于10 mL甲醇，滴加4 mL NaOH(1 mol/L)溶液，在室溫條件下進行反應(yīng)，TLC追蹤反應(yīng)進程。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液中溶劑旋除，加蒸餾水，然后用HCl(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至2～3，放入冰箱中靜置，抽濾，濾餅干燥后用無水C2H5OH進行重結(jié)晶提純，得到黃色固體84 mg，產(chǎn)率86%。

1.2.13川陳皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸(6)的合成

以化合物14(100 mg，0.16 mmol)為反應(yīng)底物，與化合物5的合成方法相同，得黃色固體86 mg，產(chǎn)率88%。

1.3 結(jié)構(gòu)測定

對所合成化合物的結(jié)構(gòu)都通過核磁共振氫譜(1H NMR)、核磁共振碳譜(13C NMR)、質(zhì)譜進行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成方法的優(yōu)化

以橘皮素和川陳皮素為原料，首先進行過氧丙酮(DMDO)氧化反應(yīng)，分別得到3-羥基橘皮素(7)和3-羥基川陳皮素(8)，在該步氧化反應(yīng)中，應(yīng)保持反應(yīng)體系的pH=8，給反應(yīng)提供一個弱堿性環(huán)境，在此條件下，丙酮和過硫酸氫鉀復(fù)合鹽制備過氧丙酮。制備過氧丙酮的過程中，需在低溫下進行，最好是0～5 ℃，主要是因為在室溫下過氧丙酮不能穩(wěn)定存在，當(dāng)溫度高于40 ℃時會發(fā)生分解。滴加過硫酸氫鉀復(fù)合鹽時，其滴加速度也不宜過快，若滴加太快，會造成過氧丙酮的生成速率比環(huán)氧化速率大很多，使新生成的過氧丙酮與橘皮素或川陳皮素反應(yīng)不充分，因而浪費原料。本文參考了有關(guān)文獻并結(jié)合Han等[14]的方法，確定以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)做溶劑，先加入碳酸鉀混合加熱攪拌反應(yīng)0.5 h左右，以便形成酚氧負離子，然后再緩慢滴加氯乙酸乙酯進行Williamson反應(yīng)，制得的多甲氧基黃酮羧酸酯類衍生物在堿性條件下室溫攪拌水解即可得到多甲氧基黃酮羧酸類衍生物1和2。

氨基酸既含有氨基又含有羧基，兩基團相互影響使得其幾乎不溶于有機溶劑，對反應(yīng)條件要求較高，普通?；磻?yīng)在反應(yīng)活性及后期產(chǎn)物的提純等方面受到諸多限制。因此，采用氨基酸甲酯鹽酸鹽與多甲氧基黃酮羧酸衍生物進行縮合反應(yīng)，將氨基酸中的羧基變成酯基進行保護，最后水解去保護得到目標(biāo)化合物。對氨基酸中的羧基進行保護也避免了其自身的縮合反應(yīng)，減少副產(chǎn)物的生成，提高了中間產(chǎn)物多甲氧基黃酮氨基酸甲酯類化合物的產(chǎn)率。在選擇縮合劑時，通過查閱文獻[15]發(fā)現(xiàn)DCC雖然價格便宜，但作為縮合劑與氨基酸甲酯反應(yīng)時，很難除盡其副產(chǎn)物N,N-二環(huán)己基脲(DCU)；而用EDCI作縮合劑，其副產(chǎn)物1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)脲(EDU)為水溶性的，水洗即可除去。反應(yīng)產(chǎn)率較高[16]。因此，綜合各方面因素，本研究采用EDCI作縮合劑，4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為輔助試劑，二氯甲烷作溶劑來進行縮合反應(yīng)制備多甲氧基黃酮氨基酸甲酯類化合物11至化合物14。使用具有親核性的DMAP作為輔助試劑，可以轉(zhuǎn)移?；?，減少副反應(yīng)的發(fā)生，縮短反應(yīng)時間，提高反應(yīng)收率。

最后在水解制備目標(biāo)化合物的過程中，采用堿性條件進行水解，但是化合物11至化合物14既含有羧酸酯鍵又含有酰胺鍵，想要合成多甲氧基黃酮氨基酸衍生物就需要控制好實驗條件。研究中發(fā)現(xiàn)在室溫條件下，pH保持在10～11進行水解可以使酰胺鍵保留而酯鍵水解。因此，多甲氧基黃酮氨基酸甲酯類化合物水解的條件對目標(biāo)產(chǎn)物的合成及收率有直接影響，要嚴格進行規(guī)范的操作來合成多甲氧基黃酮氨基酸衍生物3至6。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)表征

對所合成化合物的結(jié)構(gòu)通過1H NMR、13C NMR、質(zhì)譜的方法進行了表征。以化合物川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸(4)為例，高分辨質(zhì)譜(EI-HRMS) 測得分子離子峰為533.152 8，查拜隆表可知分子式為C25H27O12N，與實際分子式符合。

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)譜圖解析：化學(xué)位移(δ)值為8.93處，積分面積為1，耦合常數(shù)為5.7 Hz的三重峰為酰胺鍵上的氫；化學(xué)位移為7.77處，積分面積為1，耦合常數(shù)為8.5和1.7 Hz的dd峰為黃酮B環(huán)6′位上的氫；化學(xué)位移為7.65處，積分面積為1耦合常數(shù)為1.6 Hz的雙重峰為B環(huán)2′位上的氫；化學(xué)位移為7.05處，積分面積為1，耦合常數(shù)為8.6 Hz的雙重峰為B環(huán)5′位上的氫；化學(xué)位移為4.38處，積分面積為2的單峰為與氧相連的亞甲基上的氫；化學(xué)位移為4.14和4.02處，兩個積分面積均為3的單峰為B環(huán)3′位和4′位上甲氧基的氫；化學(xué)位移為4.23處，積分面積為2，耦合常數(shù)為5.5 Hz的雙重峰為與羧基相連的亞甲基上的氫；化學(xué)位移為4.00, 3.99, 3.98，3.97處，積分面積均為3的4個單峰為黃酮A環(huán)5位、6位、7位及8位上甲氧基的氫。由以上的氫譜分析可知，譜圖中氫的積分面積及化學(xué)位移值與預(yù)測川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸的氫譜相一致。

13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) 譜圖分析?；瘜W(xué)位移(δ)值為172.66處是羧基碳的特征峰，化學(xué)位移值為171.41處是酰胺基碳的特征峰，化學(xué)位移值為169.53處是黃酮中羰基碳的特征峰，化學(xué)位移值為153.34, 151.55, 148.98, 147.83, 146.71, 143.91, 138.65, 137.91, 122.65, 122.05, 114.70, 112.17, 111.51處是芳香碳的信號峰，化學(xué)位移值為70.22處是與氧相連的亞甲基碳的信號峰，化學(xué)位移值為62.44, 62.28, 62.03, 61.90, 56.10,55.93處是6個甲氧基的信號峰，化學(xué)位移值為40.87處是與羧基相連的亞甲基碳的信號峰。由以上的碳譜分析可知，譜圖中碳的化學(xué)位移值與預(yù)測的川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸的碳譜相一致。

2.2.1橘皮素-3-O-乙酸(1)的表征

白色固體，產(chǎn)率為78%，熔點為120～122 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.03 (d,J=8.4 Hz, 2H, 2′-H 和 6′-H), 6.99 (d,J=8.4 Hz, 2H, 3′-H和5′-H), 4.27 (s, 2H, OCH2), 4.06(s, 3H, OCH3), 3.93(s, 3H, OCH3), 3.89(s, 3H, OCH3), 3.88(s, 3H, OCH3), 3.84(s, 3H, OCH3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ176.94, 175.48, 171.13, 162.39, 155.53, 152.46, 148.12, 144.52, 140.12, 137.81, 130.30, 121.60, 114.63, 113.54, 72.17, 62.45, 62.16, 61.85, 61.73, 55.55。MS(ESI) m/z 469.0[M+Na]+。核磁譜圖見圖2。

圖2 橘皮素-3-O-乙酸(1)核磁圖譜Fig.2 NMR spectra of tangerine-3-O-acetic acid (1)

2.2.2川陳皮素-3-O-乙酸(2)的表征

白色固體，產(chǎn)率為76%，熔點為150～152 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.74 (d,J=8.5 Hz, 1H, 6′-H), 7.62 (s, 1H, 2′-H), 6.97 (d,J=8.5 Hz, 1H, 5′-H), 4.30 (s, 2H, OCH2), 4.06(s, 3H, OCH3), 3.94(s, 3H, OCH3), 3.92(s, 3H, OCH3), 3.90 (s, 6H, 2OCH3), 3.89 (s, H, OCH3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ175.62, 170.42, 155.40, 152.60, 152.21, 149.25, 148.24, 146.85, 144.63, 140.42, 137.75, 122.65, 121.71, 113.48, 111.34, 110.75, 72.62, 62.49, 62.10, 61.87, 61.76, 56.13, 56.07。MS(ESI) m/z 499.0[M+Na]+。核磁譜圖見圖3。

圖3 川陳皮素-3-O-乙酸(2)核磁圖譜Fig.3 NMR spectra of nobiletin-3-O-acetic acid (2)

2.2.3橘皮素-3-O-乙酰甘氨酸(3)的表征

白色固體，產(chǎn)率93%，熔點為146～148 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ8.51 (t,J=5.7 Hz, 1H, CONH), 8.11 (d,J=8.4 Hz, 2H, 2′-H和6′-H), 7.15 (d,J=8.4 Hz, 2H, 3′-H和5′-H), 4.46 (s, 2H, OCH2), 4.03(s, 3H, OCH3), 3.95(s, 3H, OCH3), 3.88 (d,J=5.6 Hz, 2H, CH2COOH), 3.86(s, 3H, OCH3), 3.85(s, 3H, OCH3), 3.82 (s, 3H, OCH3)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ172.74, 171.44, 168.60, 161.75, 153.53, 151.50, 147.83, 146.72, 143.93, 138.77, 137.98, 130.41, 122.66, 114.84, 114.76, 70.49, 62.44, 62.32, 62.03, 61.90, 55.90, 40.90。MS (EI) m/z 503.2 [M]+。HRMS (EI) m/z [M+] calcd for C24H25O11N 503.142 8, found 503.140 8。核磁譜圖見圖4。

圖4 橘皮素-3-O-乙酰甘氨酸(3)核磁圖譜Fig.4 NMR spectra of tangerine-3-O-acetylglycine (3)

2.2.4川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸(4)的表征

白色固體，產(chǎn)率91%，熔點為150～152 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ8.93 (t,J=5.4 Hz, 1H，CONH), 7.77 (dd,J=8.5, 1.7 Hz, 1H，H-6′ ), 7.65 (d,J=1.6 Hz, 1H，2′-H), 7.05 (d,J=8.6 Hz, 1H, 5′-H), 4.38 (s, 2H, OCH2), 4.23 (d,J=5.5 Hz, 2H, NCH2), 4.14 (s, 3H, OCH3), 4.02 (s, 3H, OCH3), 4.00 (s, 3H, OCH3), 3.99 (s,3H, OCH3), 3.98 (s, 3H, OCH3), 3.97 (s, 3H, OCH3)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ172.66, 171.41, 168.53, 153.34, 151.55, 148.98, 147.83, 146.71, 143.91, 138.65, 137.91, 122.65, 122.05, 114.70, 112.17, 111.51, 70.22, 62.44, 62.28, 62.03, 61.90, 56.10, 55.93, 40.87。MS (EI) m/z 533.2 [M]+。HRMS (EI) m/z [M+] calcd for C25H27O12N 533.153 3, found 533.152 8。核磁譜圖見圖5。

圖5 川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸(4)核磁圖譜Fig.5 NMR spectra of nobiletin-3-O-acetylglycine (4)

2.2.5橘皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸(5)的表征

黃色固體，產(chǎn)率86%，熔點為170～172 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ12.68 (s, 1H, COOH), 8.50 (d,J=8.0 Hz, 1H, CONH), 8.07 (d,J=8.6 Hz, 2H, 2′-H 和6′-H), 7.31-7.19 (m, 5H, C6H5), 7.09 (d,J=8.6 Hz, 2H, 3′-H和5′-H), 4.61～4.56 (m, 1H, CH), 4.42 (s, 2H, OCH2), 4.04 (s, 3H, OCH3), 3.95 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 3H, OCH3), 3.86 (s, 3H, OCH3), 3.85 (s, 3H, OCH3), 3.17 (dd,J=

圖6 橘皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸(5)核磁圖譜Fig.6 NMR spectra of tangerine-3-O-acetylphenylalanine (5)

2.2.6川陳皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸(6)的表征

圖7 川陳皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸(6)核磁圖譜Fig.7 NMR spectra of nobiletin-3-O-acetylphenylalanine (6)

2.2.73-羥基橘皮素(7)的表征

淡黃色固體，產(chǎn)率71%，熔點為130～132 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ8.25 (d,J=9.1 Hz, 2H, 2′-H和6′-H), 7.31 (s, 1H, 3-OH), 7.06 (d,J=9.1 Hz, 2H, 3′-H和5′-H), 4.13 (s, 3H), 4.04 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.90 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ170.83, 159.85, 150.53, 146.50, 145.85, 142.45, 142.23, 136.86, 136.22, 128.06, 122.56, 113.11, 110.70, 61.30, 61.00, 60.83, 60.67, 54.36。HRMS (EI) m/z [M+] calcd for C20H20O8388.115 8, found 388.114 6。數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，確證為3-羥基橘皮素。核磁譜圖見圖8。

圖8 3-羥基橘皮素(7)核磁圖譜Fig.8 NMR spectra of 3-hydroxytangerine (7)

2.2.83-羥基川陳皮素(8)的表征

淡黃色固體，產(chǎn)率74%，熔點為160～162 ℃。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ12.31(s, 1H, 3-OH), 7.77 (dd,J=8.6和1.8 Hz, 1H, 6′-H), 7.72 (d,J=1.6 Hz, 1H, 2′-H), 6.94 (d,J=8.6 Hz, 1H, 5′-H), 4.03 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.87 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ178.24, 154.79, 151.87, 150.55, 148.13, 147.82, 143.84, 137.72, 135.12, 131.77, 121.98, 121.33, 110.08, 110.00, 106.43, 61.02, 60.70, 60.13, 59.10, 55.00, 54.91。MS (m/z, EI) 418 (M+), 403 (100), 373, 357, 345, 317, 289, 273, 233, 211, 183, 165, 149, 137, 92, 77, 57。HRMS (EI) m/z [M+] calcd for C21H22O9418.126 4, found 418.125 4。數(shù)據(jù)與文獻[17-18]報道基本一致，確證為3-羥基川陳皮素。核磁譜圖見圖9。

圖9 3-羥基川陳皮素(8)核磁圖譜Fig.9 NMR spectra of 3-hydroxynobiletin (8)

2.2.9橘皮素-3-O-乙酸乙酯(9)的表征

白色固體，產(chǎn)率為73%，熔點為120～122 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.19 (d,J=8.4 Hz, 2H, 2′-H和6′-H), 6.96 (d,J=8.4 Hz, 2H, 3′-H和5′-H), 4.77 (s, 2H, OCH2), 4.10 (q,J=6.9 Hz, 2H, CH2), 4.02(s, 3H, OCH3), 3.93(s, 3H, OCH3), 3.89(s, 3H, OCH3), 3.87(s, 3H, OCH3), 3.82 (s, 3H, OCH3), 1.15 (t,J=7.0 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ172.34, 168.09, 160.49, 152.39, 150.30, 147.06, 145.64, 142.87, 137.59, 136.85, 129.42, 122.07, 113.86, 112.94, 67.10, 61.26, 61.02, 60.72, 59.89, 54.38, 13.10。核磁譜圖見圖10。

圖10 橘皮素-3-O-乙酸乙酯(9)核磁圖譜Fig.10 NMR spectra of tangerine-3-O-ethyl acetate (9)

2.2.10川陳皮素-3-O-乙酸乙酯(10)的表征

白色固體，收率為70%，熔點為116～118 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.88 (s, 1H, 2′-H), 7.85 (d,J=8.7 Hz, 1H, 6′-H), 6.93 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H), 4.75 (s, 2H, OCH2), 4.10 (q,J=6.8 Hz, 2H, CH2), 4.02(s, 3H, OCH3), 3.93(s, 3H, OCH3), 3.91(s, 3H, OCH3), 3.88 (s, 6H, 2OCH3), 3.86 (s, 3H, OCH3), 1.15 (t,J=6.9 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ172.31, 167.92, 152.12, 150.37, 150.14, 147.61, 147.07, 145.60, 142.89, 137.65, 136.78, 122.17, 121.19, 113.79, 110.54, 109.77, 67.08, 61.25, 60.95, 60.80, 60.64, 59.91, 54.93, 13.11。核磁譜圖見圖11。

圖11 川陳皮素-3-O-乙酸乙酯(10)核磁圖譜Fig.11 NMR spectra of nobiletin-3-O-ethyl acetate (10)

2.2.11橘皮素-3-O-乙酰甘氨酸甲酯(11)的表征

白色固體，產(chǎn)率93%，熔點為110～112 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.81 (t,J=5.7 Hz, 1H, CONH), 7.96 (d,J=8.2 Hz, 2H, 2′-H和6′-H), 6.97 (d,J=8.2 Hz, 2H, 3′-H和5′-H), 4.26 (s, 2H, OCH2), 4.09 (d,J=5.6 Hz, 2H, CH2COOCH3), 4.03 (s, 3H, OCH3), 3.91 (s, 3H, OCH3), 3.88 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 3H, OCH3), 3.82 (s, 3H, OCH3), 3.69 (s, 3H, CH3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ173.98, 169.98, 169.53, 161.93, 154.43, 151.73, 148.20, 146.84, 144.10, 139.97, 137.91, 130.02, 122.25, 114.56, 114.52, 72.37, 62.32, 62.05, 61.83, 61.67, 55.48, 52.20, 40.93。核磁譜圖見圖12。

圖12 橘皮素-3-O-乙酰甘氨酸甲酯(11)核磁圖譜Fig.12 NMR spectra of tangerine-3-O-acetylglycine methyl ester (11)

2.2.12川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸甲酯(12)的表征

白色固體，產(chǎn)率92%，熔點為122～124 ℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.82 (t,J=5.7 Hz, 1H, CONH), 7.67 (d,J=8.5 Hz, 1H, 6′-H), 7.55 (s, 1H, 2′-H), 6.95 (d,J=8.6 Hz, 1H, 5′-H), 4.28 (s, 2H, OCH2), 4.09 (d,J=5.7 Hz, 2H, CH2COOCH3), 4.03 (s, 3H, OCH3), 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.90 (s, 3H, OCH3), 3.88 (s, 3H, OCH3), 3.69 (s, 3H, CH3)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ172.97, 168.96, 168.45, 153.22, 150.79, 150.63, 148.16, 147.23, 145.79, 143.12, 139.04, 136.82, 121.39, 121.21, 113.51, 110.29, 109.69, 71.39, 61.31, 60.98, 60.82, 60.68, 55.05, 55.02, 51.20, 39.90。核磁譜圖見圖13。

2.2.13橘皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸甲酯(13)的表征

圖13 川陳皮素-3-O-乙酰甘氨酸甲酯(12)核磁圖譜Fig.13 NMR spectra of nobiletin-3-O-acetylglycine methyl ester (12)

圖14 橘皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸甲酯(13)核磁圖譜Fig.14 NMR spectra of tangerine-3-O-acetylphenylalanine methyl ester(13)

2.2.14川陳皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸甲酯(14)的表征

3 結(jié) 論

圖15 川陳皮素-3-O-乙酰苯丙氨酸甲酯(14)核磁圖譜Fig.15 NMR spectra of nobiletin-3-O-acetylphenylalanine methyl ester(14)

以柑橘多甲氧基黃酮橘皮素和川陳皮素為原料，分別經(jīng)過氧丙酮氧化得到2種多甲氧基黃酮醇(化合物7和化合物8)，化合物7和化合物8分別與氯乙酸乙酯進行Williamson反應(yīng)，生成的多甲氧基黃酮羧酸酯類衍生物，然后在堿性條件下水解，合成了2種未見文獻報道的多甲氧基黃酮羧酸衍生物(化合物1和化合物2)。以這2種橘皮素和川陳皮素羧酸衍生物為原料，以二氯甲烷作溶劑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)為縮合劑、4-N,N-二甲氨基吡啶(DMAP)為輔助劑的條件下，分別與兩種不同的氨基酸甲酯鹽酸鹽發(fā)生縮合反應(yīng)，合成得到橘皮素和川陳皮素的氨基酸甲酯衍生物，再經(jīng)水解反應(yīng)，合成了4種水溶性的多甲氧基黃酮氨基酸衍生物(化合物3至化合物6)。并對所合成的化合物進行了結(jié)構(gòu)表征。該合成方法原料易得、工藝簡便、收率較高，具有較高的實用價值。