偏甘油酯脂肪酶PrLip的重組表達及酶學(xué)性質(zhì)表征

劉曉慧， 藍東明， 王永華

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510641)

偏甘油酯脂肪酶催化甘油與脂肪酸反應(yīng)時，只合成甘油單酯(MAG)和甘油二酯(DAG)，無甘油三酯(TAG)產(chǎn)生。作為具有獨特底物特異性的脂肪酶，其催化生成產(chǎn)物單一，可實現(xiàn)目標化合物的高效合成，一直以來被生物催化領(lǐng)域青睞[1-2]。

近年來，偏甘油酯脂肪酶在功能性結(jié)構(gòu)酯制備、油脂改性及油脂精煉等領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。例如：在油脂脫酸中，偏甘油酯脂肪酶SMG1-F278N可以實現(xiàn)高達99.88%的脫酸效率；結(jié)合分子蒸餾，偏甘油酯脂肪酶可以高效合成甘油二酯，含量最高可達99.28%[3-6]；高純度PUFA甘油三酯制備中使用偏甘油酯脂肪酶SMG1去除甘油酯中非甘油三酯組分，獲得95%～100%的PUFA甘油三酯[7]。盡管偏甘油酯脂肪酶有非常誘人的應(yīng)用前景，但當(dāng)前只有5種偏甘油酯脂肪酶被報道[8-12]。Yamaguchi等[8]首次報道了偏甘油酯脂肪酶PCL的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)。Toida等[9]從米曲霉(Aspergillusoryzae)發(fā)酵液中分離純化得到脂肪酶AOL，并表征其偏好MAG和DAG的底物特異性，而對TAG不反應(yīng)。Xu等[10]在畢赤酵母X33中重組表達脂肪酶SMG1，解析其三維結(jié)構(gòu)并闡釋底物選擇及激活機制[11-12]。Tan等[13]從圓弧青霉PG37(Penicilliumcyclopium)中克隆了偏甘油酯脂肪酶PcMdl的基因，并在畢赤酵母GS115中異源表達。Xu等[14]在畢赤酵母X33中異源表達了來源于球形馬拉色菌(Malasseziaglobose)的低溫偏甘油酯脂肪酶MgMDL2。目前，已表征的偏甘油酯脂肪酶最適溫度在15～40 ℃，但中低溫的酶會限制其在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，因此，挖掘更多新型的偏甘油酯脂肪酶并深入研究其特性，無論是在豐富酶制劑的種類，還是在提升其工業(yè)應(yīng)用中的催化能力方面都具有重要的意義。

婁地青霉(Penicilliumroqueforti)是一種廣泛存在于自然界的真菌，可用于生產(chǎn)藍紋奶酪，為食品安全級的菌株，近年來已被全基因測序[15]。研究從其基因組篩選出一個脂肪酶基因，命名為prlip，對其進行重組表達、純化及酶學(xué)性質(zhì)表征，旨在豐富工業(yè)用脂肪酶的資源并提供脂肪酶研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤酵母(Pichiapastoris)X33及表達載體pGAPZαA，本實驗室保存；基因引物、質(zhì)粒提取試劑盒、Bradford蛋白檢測試劑盒、博來霉素、蛋白marker，生工生物工程(上海)股份有限公司。Q Sepharose層析填料，瑞典GE Healthcare公司(中國廣州)；三月桂酸甘油酯(質(zhì)量分數(shù)95%)、α,α’-二月桂精(質(zhì)量分數(shù)95%)、單月桂酸甘油酯(質(zhì)量分數(shù)90%)、亞麻酸(質(zhì)量分數(shù)約70%)，美國Sigma-Aldrich公司；甘油二酯油(質(zhì)量分數(shù)51.4% TAG、48.6% DAG)，實驗室自制。其他試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525型高效液相色譜儀，美國Waters公司；AKTA Purifier蛋白純化系統(tǒng)，瑞典GE Healthcare公司；Spectral Max M2e型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1重組畢赤酵母的構(gòu)建

根據(jù)Gene Bank數(shù)據(jù)庫中公開的婁地青霉(Penicilliumroqueforti)編碼的prlip基因(CDM30754.1)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因序列，并克隆到表達載體pGAPZαA中。重組質(zhì)粒pGAPZαA-prlip線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)，通過博來霉素抗性YPD(yeast extract peptone glucose)培養(yǎng)基(10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖)培養(yǎng)平板篩選轉(zhuǎn)化子，利用菌落PCR鑒定獲得陽性菌株。將陽性菌株接種到5 mL含100 μg/mL博來霉素的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)60 h后，進行SDS-PAGE電泳檢測及酶活鑒定，獲取重組pGAPZαA-prlip-X33酵母表達菌株。

1.3.2重組脂肪酶PrLip的表達及純化

從甘油管中吸取200 μL菌液接種于50 mL YPD種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)至生長對數(shù)期中期，按照體積比1∶10進行擴大培養(yǎng)，相同條件下培養(yǎng)60 h。

在4 ℃下，10 000 r/min離心20 min，收集發(fā)酵上清液，獲得粗酶液；用0.45 μm微孔濾膜過濾粗酶液，將過濾后的上清液置于冰上，用10 kDa的膜包濃縮，并用20 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)緩沖液等體積換鹽5次。使用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱對粗酶液進行純化，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)平衡，將換鹽后的粗酶液上樣，先用含80 mmol/L氯化鈉的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)洗脫，去除雜蛋白，再用含250 mmol/L氯化鈉的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)將目的蛋白質(zhì)洗脫。利用12% SDS-PAGE凝膠電泳分析重組PrLip的純化情況。

1.3.3脂肪酶PrLip酶活力測定

采用滴定甘油二酯乳化液的方法測定脂肪酶水解活力[16]。取5 mL 0.02 mol/L緩沖液及4 g甘油二酯乳化液(1 g的甘油二酯和3 g質(zhì)量分數(shù)4%聚乙烯醇，用均質(zhì)機均質(zhì)至體系均一)于50 mL錐形瓶中，45 ℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，加入適量酶液，恒溫反應(yīng)5 min后馬上加入15 mL 體積分數(shù)95%乙醇破乳，終止反應(yīng)。加入3滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液滴定游離脂肪酸，記錄消耗的氫氧化鈉體積?？瞻讓φ諡榉磻?yīng)體系預(yù)熱后不加酶液，同樣操作后加入15 mL 95%乙醇及等體積的滅活酶液。

脂肪酶酶活力定義為：在上述測定條件下，單位時間(1 min)水解甘油二酯產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需要的酶量，為一個酶活力單位，U。

1.3.4脂肪酶PrLip酶學(xué)性質(zhì)測定

1) 脂肪酶PrLip最適pH值及pH耐受性的測定。選擇pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0六個測試點(pH值4.0、5.0為檸檬酸鹽緩沖液，pH值6.0、7.0為磷酸鹽緩沖液，pH值8.0為Tris-HCl溶液，pH值9.0為甘氨酸-氫氧化鈉溶液)，30 ℃下測定酶活力，以相應(yīng)pH值下的最高酶活力為100%，其余以相對酶活力表示。將脂肪酶PrLip置于不同pH值(4.0～9.0)的緩沖液中，4 ℃孵育2 h后測定殘余酶活力，檢測脂肪酶PrLip的pH耐受性。以孵育前的酶活力為100%，其余以相對酶活力表示。

2) 脂肪酶PrLip最適溫度及熱穩(wěn)定性的測定。在最適pH值，不同溫度(20～60 ℃)條件下檢測脂肪酶PrLip的酶活力。以相應(yīng)溫度下的最高酶活力為100%，其余以相對酶活力表示。將適量的脂肪酶PrLip置于不同溫度(35、40、45 ℃)的油浴鍋，每隔一定的時間取樣測定殘余酶活力，檢測脂肪酶PrLip的熱穩(wěn)定性。以熱處理前的酶活力為100%，其余以相對酶活力表示。

3) 金屬離子、有機溶劑及表面活性劑對脂肪酶PrLip酶活力的影響。將脂肪酶PrLip分別孵育在終濃度為5 mmol/L金屬離子(NiCl、ZnSO4、CuSO4、MgCl2、CaCl2、MnCl2、CoCl2、FeCl3)溶液、體積分數(shù)30%有機溶劑(甲醇、乙醇、異丙醇)、體積分數(shù)1%表面活性劑(SDS、曲通X-100、吐溫20、吐溫80)中，4 ℃孵育2 h后測定殘余活力。以不添加其他離子或分子的酶活力為100%。

4) 脂肪酶PrLip對甘油酯的底物特異性測定。通過分別水解三月桂酸甘油酯、α,α’-二月桂精、單月桂酸甘油酯3種標準品來檢驗其底物特異性。取0.5 g甘油酯乳化液(1 g甘油二酯和3 g質(zhì)量分數(shù)4%聚乙烯醇，均質(zhì)至體系均一)于4 mL螺口瓶，加入450 μL緩沖液(20 mmol/L，pH值7.0)和100 U酶液。在40 ℃、500 r/min的油浴鍋中水解反應(yīng)24 h，脂肪酸產(chǎn)物通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測。此外，通過亞麻酸和甘油進行酯化反應(yīng)，進一步驗證其底物特異性。反應(yīng)總體系為2 g(甘油與亞麻酸摩爾比為4∶1)，200 U凍干PrLip酶粉，在40 ℃、500 r/min的油浴鍋中反應(yīng)，每隔一段時間取樣，進行HPLC分析。

1.3.5水解及酯化反應(yīng)產(chǎn)物的測定

水解及酯化反應(yīng)后的脂肪酸及甘油酯由配備Waters 2414型示差折光檢測器的高效液相色譜儀進行檢測，液相色譜柱購于美國Phenomenex Corporation公司，規(guī)格為250 mm×4.6 mm，5 μm。色譜條件為：流速1 mL/min，進樣體積10 μL，柱溫箱溫度30 ℃，流動相為正己烷- 異丙醇- 甲酸(體積比18∶1∶0.003)

1.3.6脂肪酶PrLip同源建模

采用Swiss-Model在線網(wǎng)站(https:∥swissmodel.expasy.org/)，以PCL(PDB ID：5CH8)為模板預(yù)測脂肪酶PrLip的三維結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)上分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)為3次平行實驗的平均值，所有數(shù)據(jù)由Origin Pro 8.0軟件處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶PrLip的序列分析

根據(jù)脂肪酶G-X-S-X-G保守五肽等序列特征，從婁地青霉基因組中發(fā)現(xiàn)了一個假定的脂肪酶序列命名prlip[17]。該序列包含一個完整的開放閱讀框，由849 bp核苷酸組成，編碼283個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為31 kDa。通過序列比對分析，PrLip與其他偏甘油酯脂肪酶PCL、PcMdl和AOL的相似度分別為80.65%、81%和60.85%，提示它可能具有類似偏甘油酯脂肪酶的催化功能；但其與偏甘油酯脂肪酶SMG1和MgMDL2的序列相似度較低，僅為19.86%和22.11%。PrLip與已報道的偏甘油酯脂肪酶的序列比對結(jié)果見圖1。PrLip與其他偏甘油酯脂肪酶有一致的保守五肽序列(GHSLG)，預(yù)測其催化三聯(lián)體為Ser145、Asp199、His259，其中活性位點Ser145位于保守五肽序列中。

2.2 脂肪酶PrLip表達與純化結(jié)果分析

利用基因工程使畢赤酵母(pGAPZαA-prlip)胞外高效表達重組脂肪酶PrLip，通過Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，利用不同濃度的氯化鈉洗脫液分離，獲得目的蛋白質(zhì)。PrLip蛋白質(zhì)表達與純化結(jié)果見圖2及表1。SDS-PAGE檢測顯示，重組脂肪酶PrLip分子質(zhì)量約為31 kDa，與預(yù)測的分子質(zhì)量一致，同時表明重組PrLip在細胞內(nèi)翻譯過程沒有發(fā)生明顯的糖基化修飾。1.5 L發(fā)酵液最終可純化得到蛋白質(zhì)49 mg，回收率為38.89%，純化倍數(shù)為4.37倍(表1)。純化的重組蛋白質(zhì)應(yīng)用于后續(xù)的生化性質(zhì)研究。

2.3 脂肪酶PrLip的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1pH值對PrLip酶活力的影響

pH值對PrLip酶活力的影響見圖3(a)。在pH值7.0時活性最高，而在pH值4.0和9.0的溶液中，酶活力受抑制。研究PrLip對不同pH值的耐受性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH值4.0和5.0孵育2 h后，其相對殘余酶活低于60%，在pH值8.0和9.0中殘留活性超過90%，這說明PrLip在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性要優(yōu)于酸性環(huán)境(圖3(b))。該結(jié)果與其他已報道的偏甘油酯脂肪酶性質(zhì)相似(表2)，已報道的偏甘油酯脂肪酶最適pH值均在6.0～7.5，且大部分在堿性環(huán)境中更穩(wěn)定。

圖1 脂肪酶PrLip與5種已報道脂肪酶的序列比對Fig.1 Multiple alignment of lipase PrLip and five reported lipase

泳道M: 蛋白質(zhì)marker；泳道1：PrLip的發(fā)酵上清液；泳道2：Q柱純化后PrLip。圖2 SDS-PAGE分析脂肪酶PrLip的表達及純化結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of lipase PrLip

2.3.2溫度對PrLip酶活力的影響

溫度對PrLip酶活力的影響如圖4。由圖4(a)可知，脂肪酶PrLip在20～50 ℃時均保持較好的催化活性，水解活力均在70%以上，45 ℃時催化活力最高。PrLip的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在35 ℃和40 ℃條件下，PrLip在6 h內(nèi)分別保留了其初始活性的57%和46%，但在45 ℃孵化30 min便失活(圖4(b))。目前已報道的偏甘油酯脂肪酶最適溫度范圍為15～40 ℃(表2)，而在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，酶的熱穩(wěn)定性能是重要應(yīng)用參數(shù)。因此，脂肪酶PrLip的發(fā)現(xiàn)拓寬了偏甘油酯脂肪酶的最適溫度范圍，為偏甘油酯脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用提供更多的選擇。

為進一步解釋脂肪酶PrLip良好的溫度耐受性，以序列相似度高達80%的偏甘油酯脂肪酶PCL為模板(PDB ID: 5CH8)，通過Swiss-Model進行同源建模。脂肪酶PrLip的三維結(jié)構(gòu)如圖5。從整體上看(圖5(a))，脂肪酶PrLip在蛋白質(zhì)外部loop轉(zhuǎn)折之處，有兩對二硫鍵，分別是Cys36-Cys41和Cys103-Cys106，固定了兩段長loop結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定了蛋白質(zhì)構(gòu)象。二硫鍵是共價作用形成的連接，因此被認為是穩(wěn)定蛋白質(zhì)最有利的因素，而目前已報道的偏甘油酯脂肪酶多數(shù)僅具有一對二硫鍵，如低溫酶SMG1及MgMDL2。從核心區(qū)域上分析((圖5(b))，發(fā)現(xiàn)脂肪酶PrLip蓋子區(qū)(黃色)的疏水性氨基酸大部分均朝向催化口袋內(nèi)側(cè)，與催化中心的疏水性氨基酸(藍色)形成疏水相互作用，對蛋白質(zhì)的折疊與構(gòu)象穩(wěn)定起重要作用。

表1 脂肪酶PrLip純化結(jié)果Tab.1 Purification of lipase PrLip

圖3 pH值對脂肪酶PrLip酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of pH on lipase activity and stability of PrLip

圖4 溫度對脂肪酶PrLip酶活力及耐熱性的影響Fig.4 Effects of temperature on lipase activity and stability of PrLip

表2 不同來源的偏甘油酯脂肪酶的酶學(xué)特性比較

圖5 脂肪酶PrLip的三維結(jié)構(gòu)Fig.5 Structure of lipase PrLip

2.3.3金屬離子、有機溶劑及表面活性劑對PrLip酶活力的影響

金屬離子對PrLip酶活力的影響情況如圖6(a)。Zn2+離子對PrLip的抑制作用較弱(相對殘余酶活力約為75%)；而Cu2+、Mg2+、Mn2+、Co2+對酶活性的抑制作用較強(殘余活性60%～70%)；Ca2+、Ni+、Fe3+抑制作用最強，相對殘余酶活力分別下降到46.97%、21.68%、3.12%。

有機溶劑常被用作催化反應(yīng)的組分之一，提高底物溶解性和分散性，影響酶催化效率。因此，研究了有機溶劑對脂肪酶PrLip活性的影響。測定了PrLip在體積分數(shù)30%的有機溶劑中孵育2 h后的活性，結(jié)果如圖6(b)，甲醇和異丙醇對PrLip有明顯的抑制作用(相對活力降低90%)，而在乙醇中PrLip的失活65%。

圖6(b)呈現(xiàn)了體積分數(shù)1%表面活性劑(曲通X-100、吐溫20、吐溫80和SDS)對PrLip酶活力的影響。與對照組相比，SDS和吐溫20對PrLip活性抑制作用較小，相對殘余酶活力分別為對照組的70%和67%，曲通X-100對PrLip幾乎無影響，酶活力保持100%。但是，吐溫80可以將其相對酶活力提高為140%。有研究報道，曲通X-100通過調(diào)節(jié)酶- 底物復(fù)合體的活性位點，有利于酶與底物的自我調(diào)節(jié)，從而影響酶的活力和穩(wěn)定性。脂肪酶PrLip對表面活性劑的耐受性有望使其應(yīng)用于生物洗滌領(lǐng)域[20-21]。

2.3.4脂肪酶PrLip的底物選擇性分析

為確定脂肪酶PrLip的底物特異性，對天然油脂底物(單月桂酸甘油酯、α,α’-二月桂精和三月桂酸甘油酯)進行24 h水解反應(yīng)，并以甘油和亞麻酸為底物進行酯化反應(yīng)。脂肪酶PrLip只對DAG與MAG底物表現(xiàn)出水解活性，而不水解TAG底物，如圖7(a)。在酯化反應(yīng)中，反應(yīng)產(chǎn)物只有DAG和MAG被檢測到，且無TAG產(chǎn)生(圖7(b))。酶催化水解和酯化的實驗均證實PrLip為偏甘油酯脂肪酶。

圖6 金屬離子、有機溶劑、表面活性劑對脂肪酶PrLip酶活力的影響Fig.6 Effects of metal ions, organic solvents and detergents on lipase activity of PrLip

圖7 脂肪酶PrLip的底物選擇性Fig.7 Substrate specificity of lipase PrLip

表2歸納了當(dāng)前已表征的真菌來源偏甘油酯脂肪酶的酶學(xué)特性，從來源上看，脂肪酶SMG1及MgMDL2均來源于球形馬拉色菌(Malasseziaglobose)，為皮膚致病菌；而其余3種脂肪酶的來源菌株常見于食品中，卡門柏青霉(Penicilliumcamembertii)和婁地青霉(Penicilliumroqueforti)常用于奶酪發(fā)酵劑，米曲霉(Aspergillusoryzae)在制作清酒或醬油時可作曲，因此在油脂加工中應(yīng)用更為安全。這6種脂肪酶的最適pH值均在6.0～7.5，且大多數(shù)偏向于耐受堿性環(huán)境，除了脂肪酶SMG1在pH值4.0～9.0均保持70%以上的酶活力；MgMDL2、SMG1、AOL、PcMdl和PCL的最適溫度分別為15、25、30、35、40 ℃，PrLip為45 ℃，具有更好的溫度耐受性。

3 結(jié) 論

偏甘油酯脂肪酶因其獨特的底物選擇性，使其在生物催化領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。從自然界微生物中篩選鑒定，研究其酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用評價的工作意義重大。本研究從食品安全菌婁地青霉(Penicilliumroqueforti)基因組中發(fā)現(xiàn)一個假定的脂肪酶基因prlip，通過全基因合成該序列，并實現(xiàn)在畢赤酵母中高效重組表達。純化的PrLip的最適溫度為45 ℃，最適pH值為7.0，40 ℃的半衰期約為6 h，耐受大部分表面活性劑，水解及酯化反應(yīng)證實其為偏甘油酯脂肪酶。本研究一方面豐富了偏甘油酯脂肪酶種類，同時為其在工業(yè)中的應(yīng)用提供了一定研究基礎(chǔ)。未來的研究工作中，需要對其三維結(jié)構(gòu)進行解析，并結(jié)合基因工程手段及生物計算闡明其催化機制，通過酶工程技術(shù)手段對酶分子進行改造，強化酶的催化性能，滿足工業(yè)應(yīng)用需求。