中藥活性成分“合成生物學(xué)”創(chuàng)造與新藥發(fā)現(xiàn)——高偉教授

童宇茹 張逸風(fēng) 沈思雨 高 偉,*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

中藥活性成分不僅是中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的活性物質(zhì)，還是現(xiàn)代創(chuàng)新藥物開發(fā)的源泉，如抗瘧疾的青蒿素、止咳平喘的麻黃素和抗炎的黃連素等。目前，中藥活性成分基本依賴從藥用植物中直接提取分離，但由于其在植物中含量低、不易化學(xué)合成，隨著新藥開發(fā)及中藥產(chǎn)業(yè)化對中藥活性成分的需求增大，許多藥用植物資源將面臨大宗常用資源短缺、珍稀瀕危資源破壞等諸多問題。

從生物學(xué)角度，中藥活性成分多來源于藥用植物次生代謝過程中合成的天然產(chǎn)物，它們是植物長期演化過程中特有基因共同調(diào)控的產(chǎn)物，由系列關(guān)鍵酶通過系列催化反應(yīng)所合成，并存在特定生物合成途徑。通過發(fā)掘藥用植物基因資源，克隆鑒定活性成分關(guān)鍵酶基因，解析其生源途徑并在微生物中人工創(chuàng)建代謝途徑，進(jìn)而利用合成生物學(xué)策略生產(chǎn)或改造藥用活性成分，將是一種極具潛力的藥用活性成分獲取方法。

1 個(gè)人簡介

高偉教授(圖1)，男，中共黨員，1979年出生于江西鄱陽，首都醫(yī)科大學(xué)教授、博士生導(dǎo)師，藥學(xué)院院長。2008年博士畢業(yè)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，師從黃璐琦院士獲得全國百篇優(yōu)秀博士學(xué)位論文；2013年師從美國科學(xué)院院士、冷泉港實(shí)驗(yàn)室(CSHL)主席Bruce Stillman教授，在美國CSHL從事分子生物學(xué)研究。2014年獲得國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金和863計(jì)劃青年科學(xué)家項(xiàng)目資助；2015年入選國家第二批“萬人計(jì)劃”中組部青年拔尖人才和北京市首批“高創(chuàng)計(jì)劃”領(lǐng)軍人才；2016年入選教育部“長江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年項(xiàng)目；2018年入選科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才；2019年入選“萬人計(jì)劃”科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才。在中藥及天然藥物活性成分基因功能鑒定、生源途徑解析及合成生物學(xué)研究領(lǐng)域取得了創(chuàng)新性成果，以第一或通訊作者在JournaloftheAmericanChemicalSociety、NatureCommunications、NewPhytologist、MetabolicEngineering、OrganicLetters、PlantJournal、ActaPharmaceuticaSinicaB等國內(nèi)外知名期刊發(fā)表論文81篇；參編教材和專著12部；授權(quán)發(fā)明專利18項(xiàng)，PCT專利2項(xiàng)；獲中國藥學(xué)會賽諾菲青年生物藥物獎(jiǎng)、中國藥學(xué)會以嶺生物醫(yī)藥青年獎(jiǎng)、北京市科技獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)1項(xiàng)(第15)、中國藥學(xué)會科技獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)1項(xiàng)(第4)、中華醫(yī)學(xué)會科技獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)(第5)和中華中醫(yī)藥學(xué)會中青年創(chuàng)新人才等。兼任中華中醫(yī)藥學(xué)會青年委員會主任委員、中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會分子生藥學(xué)分會秘書長、中國植物學(xué)會藥用植物及植物藥專業(yè)委員會副秘書長等；并擔(dān)任ActaPharmaceuticaSinicaB、ChineseJournalofNaturalMedicines、《中國中藥雜志》《藥學(xué)學(xué)報(bào)》《世界中醫(yī)藥》《首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》等知名期刊編委或青年編委。

圖1 高偉教授

2 主要學(xué)術(shù)貢獻(xiàn)

高偉教授長期從事中藥資源與分子生藥學(xué)研究，聚焦雷公藤、丹參、甘草、穿心蓮等我國重要藥用植物基因資源，以雷公藤甲素、雷公藤紅素和丹參酮等應(yīng)用于臨床或者有顯著藥理作用的活性成分為切入點(diǎn)，突破中藥活性成分傳統(tǒng)獲取方式，從“功能基因挖掘-生物合成途徑解析-合成生物學(xué)生產(chǎn)-活性評價(jià)”等全鏈條實(shí)現(xiàn)中藥活性成分“合成生物學(xué)”創(chuàng)造和新藥發(fā)現(xiàn)。

2.1 構(gòu)建藥用植物基因鑒定系統(tǒng)，成功鑒定雷公藤等萜類活性成分生物合成關(guān)鍵酶基因，為發(fā)掘中藥基因資源提供關(guān)鍵技術(shù)

構(gòu)建了中藥萜類活性成分生物合成相關(guān)基因高通量挖掘及功能鑒定系統(tǒng)，包括：① 發(fā)展了顏色及功能互補(bǔ)鑒定體系，適用于無底物的上游萜類基因功能鑒定；② 建立了體外酶促鑒定體系，適用于既有底物又有產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的萜類基因功能鑒定；③ 建立了代謝工程鑒定體系，適用于僅有產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的萜類基因功能鑒定；④ 建立了合成生物學(xué)策略鑒定體系，適用于無產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的萜類基因功能鑒定；⑤ 基于基因槍介導(dǎo)的藥用植物體內(nèi)基因功能鑒定。基因功能鑒定系統(tǒng)突破了非典型性模式藥用植物代謝途徑催化酶基因功能鑒定的瓶頸，并成功運(yùn)用于雷公藤等植物萜類系列功能基因的克隆鑒定，首次克隆鑒定了48個(gè)雷公藤萜類生物合成功能基因[1-8]，為高效發(fā)現(xiàn)和確證目標(biāo)中藥活性成分合成通路關(guān)鍵酶基因奠定了理論依據(jù)和關(guān)鍵技術(shù)。

2.2 提出基于表型差異的多組學(xué)研究策略，解析雷公藤甲素等中藥活性成分新穎合成途徑

提出了基于表型差異的多組學(xué)解析中藥活性成分未知功能基因及新穎途徑的整體研究策略。通過環(huán)境脅迫或外源誘導(dǎo)，使藥用植物次生代謝物積累產(chǎn)生表型差異，進(jìn)而通過基因組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)檢測，構(gòu)建“基因-代謝物”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，篩選中藥活性成分合成途徑的候選基因及相關(guān)代謝物，發(fā)掘中藥活性成分未知功能基因和新穎途徑(圖2)：① 發(fā)現(xiàn)雷公藤新穎二萜合酶基因(TwTPS)[9]和細(xì)胞色素氧化酶基因(TwCYP728B70)[10]，解析了雷公藤甲素關(guān)鍵環(huán)化途徑和后修飾過程；② 發(fā)現(xiàn)雷公藤新穎的三萜氧化鯊烯環(huán)化酶基因(TwOSC)，首次揭示雷公藤紅素木栓烷型母核結(jié)構(gòu)形成過程[11]；③首次在穿心蓮中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新穎二萜類化合物糖基轉(zhuǎn)移酶基因(ApUGT)，成功解析了新穿心蓮內(nèi)酯下游生物合成途徑[12]。④ 表征了甘草中多種黃酮(異甘草素、甘草素及其糖苷異甘草苷)的完整生物合成途徑，并首次使用酵母內(nèi)源代謝物作為前體和輔因子實(shí)現(xiàn)了其在釀酒酵母中的從頭合成[13]。

圖2 中藥(雷公藤、丹參、穿心蓮等)活性成分關(guān)鍵酶基因鑒定及新穎途徑解析

2.3 發(fā)展合成生物學(xué)關(guān)鍵技術(shù)，高效生產(chǎn)中藥活性成分

首次克隆鑒定了丹參酮生物合成關(guān)鍵基因SmCPS和SmKSL，發(fā)現(xiàn)了一條二萜生物合成新途徑。SmCPS是被子植物中首個(gè)被鑒定的-CPP合成酶基因，SmKSL編碼蛋白則催化-CPP形成新的二萜烯(次丹參酮二烯)；由此闡明了丹參酮生物合成過程中立體化學(xué)構(gòu)型，發(fā)現(xiàn)了一條丹參酮特有的二萜生物合成新途徑[14-15]。進(jìn)一步建立了合成生物學(xué)策略的模塊化途徑工程技術(shù)，對編碼SmCPS、SmKSL、ERG20、BTS1和HMG1 5個(gè)蛋白的基因進(jìn)行了操作，首次在酵母中合成出次丹參酮二烯，產(chǎn)量達(dá)到365 mg/L 的國際先進(jìn)水平[16]。進(jìn)一步利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得高產(chǎn)GGPP底盤菌，次丹參酮二烯產(chǎn)量提高到3 500 mg/L[17](圖3)；從而建立了以丹參酮為示范的中藥活性成分“功能基因挖掘-生物合成途徑解析-合成生物學(xué)生產(chǎn)” 的中藥基因資源發(fā)掘保護(hù)、中藥活性成分高效獲取的中藥資源可持續(xù)利用新模式。

2.4 聚焦臨床應(yīng)用，篩選具有顯著藥理活性的中藥活性成分

對中藥活性成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)衍生和藥理活性研究，研究[18]顯示，雷公藤紅素可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增生，對星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性并誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G2/M期，主要通過誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)JNK活化并阻斷Akt/mTOR信號通路而形成。而雷公藤甲素通過上調(diào)ROS/JNK和下調(diào)Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬和凋亡[19]。這些研究為雷公藤中有效成分的抗腫瘤活性新藥開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，也為解析雷公藤有效成分生物合成途徑以及開發(fā)合成生物學(xué)生產(chǎn)提供了現(xiàn)實(shí)的需求。

3 科學(xué)意義與展望

通過發(fā)掘藥用植物基因資源，克隆鑒定中藥活性成分次生代謝新穎關(guān)鍵基因，解析中藥活性成分生源途徑和調(diào)控機(jī)制；一方面，可以揭示活性成分形成和積累的分子機(jī)制，從分子水平認(rèn)識中藥材質(zhì)量形成規(guī)律，為中藥材規(guī)范化精準(zhǔn)育種與栽培提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)，進(jìn)一步模擬藥用植物體內(nèi)活性成分生物合成途徑，利用合成生物學(xué)方法在微生物體內(nèi)設(shè)計(jì)并整合藥用植物有效成分生物合成途徑，構(gòu)建和優(yōu)化“細(xì)胞工廠”最終實(shí)現(xiàn)中藥活性成分的異源高效合成，為中藥資源可持續(xù)利用提供新的研究策略和有效途徑。

中藥活性成分“合成生物學(xué)”創(chuàng)造對當(dāng)前解決中藥栽培環(huán)境出現(xiàn)的地域限制、有效成分含量低、提取困難等中藥資源短缺問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過各類化合物生物合成途徑中各級酶和中間體的分析，完整解析化合物的生物合成途徑，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)中藥活性成分的“細(xì)胞工廠”異源生產(chǎn)，將具有顯著藥理活性的活性成分如紫杉醇、青蒿素、雷公藤甲素、雷公藤紅素和丹參酮等應(yīng)用于臨床及制劑生產(chǎn)，更好地服務(wù)于醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。但當(dāng)前合成生物學(xué)面臨著生物合成下游途徑上關(guān)鍵基因的挖掘困難、合成結(jié)果的不可預(yù)測性、多數(shù)中藥活性成分途徑未完全解析、適配性底盤細(xì)胞需進(jìn)一步改造、發(fā)酵工藝亟待提高和活性成分結(jié)構(gòu)衍生及其活性評價(jià)、新藥發(fā)現(xiàn)等，這將是本領(lǐng)域重點(diǎn)研究方向和待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。