TSWV 病毒粒子在系統(tǒng)寄主煙草K326 維管組織中的分布特征

溫志多 丁 勇 尚衛(wèi)娜 王田田 吳少政 蘇曉霞 張 潔 張仲凱 鄭寬瑜

( 1. 西南林業(yè)大學云南省高校林木生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南昆明 650205；3. 浙江大學生命科學研究院，浙江 杭州 310058)

番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）病毒屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），是該目中唯一可侵染植物的病毒屬，屬名由該屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第1個病毒—番茄斑萎病毒（TSWV）命名而成的[1-2]。TSWV 寄主范圍非常廣泛，能侵染番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、煙草（Nicotiana tabacum）、萵苣（Lactuca sativa）、洋蔥（Allium cepa）等多種作物，造成的經(jīng)濟損失非常嚴重[3]。到目前為止，該屬已報道了至少30個番茄斑萎病毒屬病毒種，不同種之間的寄主范圍有很大的差異[4]。該屬病毒為脂膜包被的球形病毒粒子，直徑80～120 nm，表面有一層膜包裹。與布尼亞病毒目的其他病毒成員都很類似，番茄斑萎病毒屬病毒基因組為三分體RNA，分別為L RNA、M RNA、S RNA 3 條RNA。番茄斑萎病毒代表種TSWV基因組總長約為16 600 Nt，其中L RNA 長8 897 Nt，M RNA 全長4 821 Nt，S RNA 全長2 316 Nt，核酸約占病毒粒子質(zhì)量的1%～2%。L RNA 為負義鏈，僅編碼1個開放閱讀框，互補鏈編碼大小為332 kDa 依賴于RNA 的RNA 復制酶（RdRp）。M RNA 為雙義鏈，病毒鏈編碼大小為33. 6 kDa移動蛋白NSm，互補鏈編碼2個糖蛋白Gn 和Gc（G1 和G2），糖蛋白G1 的分子質(zhì)量為78 kDa，G2的分子質(zhì)量為58 kDa。S RNA 為雙義鏈，病毒鏈編碼長度52.4 kDa 的與致病性相關(guān)的蛋白NSs，互補鏈編碼長度28.8 kDa 核殼體蛋白N，N 蛋白核苷酸序列是該屬病毒分類的重要依據(jù)[5]。

植物病毒利用寄主的維管系統(tǒng)進行長距離運動是引起寄主植物系統(tǒng)性感病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。之前的研究表明大多數(shù)的植物病毒可通過篩管進行長距離運動，實現(xiàn)系統(tǒng)侵染[6]。但少數(shù)病毒也發(fā)現(xiàn)能利用導管進行長距離運動[7-9]。病毒在導管和篩管中的存在形式可分為3 種：病毒粒體、vRNP 復合體以及囊泡相關(guān)復制酶復合體（VRC）。南方菜豆花葉病毒（SBMV）和蕪菁黃化病毒（TuYV）嚴格以病毒粒子的形式進行長距離運動[10-11]，雀麥花葉病毒（BMV）和形影病毒屬（Umbravirus）病毒是以RNP 復合體形式進行長距離運動[12-13]，而蕪菁花葉病毒（TuMV）在導管和篩管內(nèi)存在形式則為囊泡相關(guān)VRC，由病毒膜蛋白6K2介導形成囊泡，包裹病毒RNA 及病毒RdRp 進行長距離運動[14-15]。

目前番茄斑萎病毒屬在系統(tǒng)侵染寄主植物中的長距離運動機制仍不清楚。之前的研究利用互補實驗證實TSWV N 及NSm 對運動缺陷型TMV長距離運動是必需的[16-17]，并通過缺失突變發(fā)現(xiàn)NSm 分別由不同的結(jié)構(gòu)域介導病毒細胞間運動及長距離運動，提示NSm 介導的病毒細胞間運動及長距離運動機制并不相同[18]。但是TSWV 長距離運動的輸導組織和存在形式仍然未知。本研究利用透射電子顯微鏡觀察TSWV 在系統(tǒng)寄主普通煙草K326 維管組織各類細胞中的分布特征，為解析TSWV 長距離運動機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

系統(tǒng)寄主植物K326 普通煙草由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供，栽培于人工控制氣候的室中，培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度60%，光照時間16 h/d。TSWV 分離物14YV283 由云南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所作物病毒應用與創(chuàng)新團隊實驗室分離并保存于-80 ℃，經(jīng)機械摩擦接毒于本氏煙上。

1.2 實驗方法

1.2.1 TSWV 機械摩擦接毒及負染色檢測

采取癥狀明顯的葉片組織放置于已滅菌的研缽，并加入接種Buffer 充分研磨至勻漿；將金剛砂均勻撒在K326 煙的葉片表面，用棉簽蘸取少量汁液在灑有金剛砂的葉片上輕輕摩擦2～3 次，5 min 之后用清水清洗葉面，并標記接種樣品和時間。3個重復，每次接種5 株K326 煙苗，7～14 d后電鏡負染色檢測。病毒粒子的負染色檢測參照方琦等[19]的方法，取少許K326 煙葉片置于載玻片上，滴加少許2.5%的戊二醛，用刀片盡量切碎（在切的過程中保持葉片濕潤，及時滴加2.5%的戊二醛），將銅網(wǎng)有膜的一面倒扣在葉片浸出液表面3 min，然后用濾紙將銅網(wǎng)表面的液體吸干，將銅網(wǎng)有膜的一面扣于染色劑（鉬酸銨或磷鎢酸）液體表面2 min，充分染色，將銅網(wǎng)表面的液體用吸水紙吸干，置于紅外燈下烘烤15 min，烘干后在透射電鏡（FEI TECNAI G2，USA）下觀察。

1.2.2 超薄切片制樣及電鏡觀察

將經(jīng)摩擦接毒TSWV 分離物14YV283 的K326 煙草以及健康對照K326 煙草樣品取莖部組織切成1 mm× 3 mm 的小塊，迅速放入具有2.5%戊二醛溶液的2 mL 離心管中固定；用0.1 mol/L 的PBS 漂洗3 次，15 min/次；經(jīng)1%鋨酸固定1.5～2 h，再用0.1 mol/L PBS 漂洗3 次，15 min/次；然后將樣品分別進行30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇脫水，每級脫水15 min，然后在100%乙醇再次脫水20 min 后用丙酮脫水20 min；脫水后的樣品于純包埋劑Epson-812 中過夜；先把純包埋劑移至0.5 mL 離心管或包埋模具中，再放樣品進去，然后放入聚合箱中聚合樣品，70 ℃、12 h 或者60 ℃、24 h 兩次；樣品聚合完成后要對樹脂包埋塊做修正定位，修整其形狀為梯形，每邊小于0.5 mm，高度不易超過0.2 mm；修塊完成后進行超薄切片，將包埋塊中的生物樣品切成尺寸為50～70 nm 薄片；切片完成后，用睫毛筆將切片撥開，用鑷子夾住銅網(wǎng)，對準液面上的切片輕輕一沾，使切片覆蓋于銅網(wǎng)上，去除銅網(wǎng)表面多余水分置于銅網(wǎng)盒；然后先用醋酸雙氧鈾染色5～10 min 后蒸餾水沖洗，再用檸檬酸鉛染色5 min 后沖洗，烘烤燈烘烤后上透射電鏡觀察。每個樣品做3個包埋塊，每個包埋塊切片后，在適當放大倍數(shù)下觀察20個有效視野，最后進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSWV 機械摩擦接毒及負染色觀察

摩擦接毒TSWV 7 d 時，接種葉片上出現(xiàn)黃色斑點，后期逐步變?yōu)閴乃腊?，直至接種葉片整片壞死；8～9 d 時，頂部的非接種葉片上開始顯示出壞死斑點，到第14 天，癥狀擴散到大部分的非接種葉片，頂芽壞死（圖1b）。實驗于第10 天取接毒后的頂部非接種葉片進行負染色電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有囊泡包裹的80～120 nm 直徑病毒粒子聚集體（圖1c）。表明TSWV 已系統(tǒng)侵染至整個K326 煙草植株。

圖1 TSWV 癥狀及負染色觀察結(jié)果Fig. 1 Symptoms and negative staining of TSWV

2.2 導管細胞病理切片觀察結(jié)果

成熟導管是一種死亡細胞，只存在細胞壁。細胞壁分為初生細胞壁及加厚的次生細胞壁。而且上下兩個細胞是貫通的，位于維管束的木質(zhì)部。其功能是把從根部吸收的水和無機鹽輸送到植株身體各處。在透射電子顯微鏡下觀察接毒植株樣品超薄切片，并與健康K326 植株導管相比較，可觀察到在系統(tǒng)侵染TSWV 的K326 煙草導管內(nèi)有囊泡包裹的病毒粒體，大小約80 nm、球狀，并發(fā)現(xiàn)有病毒核殼體N 聚集體的類似物（圖2a，b）。未摩擦接病毒的健康對照K326 植株，其導管中基本未發(fā)現(xiàn)內(nèi)容物，其中也沒有發(fā)現(xiàn)病毒粒子及病毒核殼體聚集體（圖2c，d）。正常情況下，導管主要運輸水和無機物，但在TSWV 侵染條件下發(fā)現(xiàn)TSWV 病毒粒子存在于導管中，說明TSWV 病毒粒子有可能利用導管進行長距離運動，實現(xiàn)系統(tǒng)侵染。

圖2 導管細胞病理切片F(xiàn)ig. 2 Characteristics of vessel elements by TEM

2.3 篩管細胞病理切片觀察結(jié)果

成熟篩管顯著特征是沒有細胞核或液泡，具有篩管特異性P 質(zhì)體，2個篩管之間具有篩板。胞間連絲在結(jié)構(gòu)和功能上分別特化為篩板上的篩孔和伴細胞界面上有較大開口的孔-胞間連絲單元（PPU）。PPU 大小介于胞間連絲和篩孔之間。它與胞間連絲相似，具有中央膜質(zhì)通道，與篩孔通道具有相同的胼胝質(zhì)沉積模式和潛在的病毒粒子輸運能力。經(jīng)超薄切片后，經(jīng)透射電子顯微鏡下觀察，與健康K326 植株相比較，在TSWV侵染的K326 煙草篩管中，并未發(fā)現(xiàn)該病毒粒子，但是可觀察到囊泡狀小體，直徑80～200 nm（圖3a，b），而在健康對照的K326 植株中具有較少囊泡狀小體（圖3c，d）。在統(tǒng)計的60個有效視野中，TSWV 侵染的樣品中有篩管細胞53個，篩管內(nèi)直徑80～200 nm 的囊泡共計432個，平均1個篩管細胞內(nèi)囊泡數(shù)量為8.15個；對照樣品中有篩管細胞45個，篩管內(nèi)直徑80～200 nm 的囊泡數(shù)量189個，平均1個篩管細胞內(nèi)囊泡數(shù)量為4.2個。推測TSWV 侵染導致篩管內(nèi)囊泡增多，其囊泡可能為TSWV 囊泡相關(guān)VRC。

2.4 伴細胞病理切片觀察結(jié)果

伴細胞是一種特殊類型的薄壁組織細胞，它在起源、位置及功能上和篩管分子緊密聯(lián)系。它和篩管分子由同一個母細胞分裂而來，提供篩管必需的營養(yǎng)物質(zhì)。健康K326 煙草的伴細胞有較大的細胞核，有豐富的細胞器和膜系統(tǒng)，高爾基體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，細胞質(zhì)密度也較大，這些都表明伴細胞有很高的代謝活性（圖4e，f）。在透射電子顯微鏡下觀察TSWV 侵染的K326 煙草伴細胞，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)中有成熟的病毒粒子，而且細胞質(zhì)中還有大量囊泡狀小體，直徑在120 nm 左右（圖4a，b）。同時線粒體的基質(zhì)膨大，有的甚至整個線粒體崩解（圖4c，d）。在統(tǒng)計的60個有效視野內(nèi)，TSWV 侵染煙草樣品中共有伴細胞43個，其中35個伴細胞具有上述病理現(xiàn)象。說明TSWV 的侵染影響了伴細胞線粒體的合成代謝。而大量囊泡小體有可能為TSWV囊泡相關(guān)VRC，介導TSWV 由伴細胞通過PPU向篩管運輸。

圖3 篩管細胞病理切片F(xiàn)ig. 3 Characteristics of sieve elements by TEM

2.5 維管薄壁細胞病理切片分析

維管薄壁細胞的特征是具細胞核、細胞質(zhì)、液泡、線粒體、葉綠體、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種細胞器。感染TSWV 的K326 普通煙草經(jīng)超薄切片在透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在細胞質(zhì)中存在TSWV病毒粒子聚集體，病毒粒子直徑約80 nm，病毒粒子聚集體外有單層囊膜包裹，囊膜上具有黑色電子致密點狀物質(zhì)，推測為核糖體（圖5a，b）。未接毒的健康對照煙草維管薄壁細胞，未發(fā)現(xiàn)有TSWV 病毒粒子，細胞質(zhì)中可觀察到葉綠體、線粒體、高爾基體等細胞器（圖5c，d）。維管薄壁細胞雖然不具備長距離運輸病毒的潛在功能，但維管薄壁細胞和葉肉細胞相似，具有較完善的、多種類型的細胞器，因此可能是病毒長距離運動過程中提供病毒復制增殖及裝配的重要場所。

圖4 伴細胞病理切片F(xiàn)ig. 4 Characteristics of companion cells by TEM

圖5 維管薄壁細胞病理切片F(xiàn)ig. 5 Characteristics of vascular parenchyma cells by TEM

3 結(jié)論與討論

植物的維管組織是植物重要的運輸系統(tǒng)及支持系統(tǒng)。維管束是維管組織在植物器官中的束狀結(jié)構(gòu)，分為木質(zhì)部和韌皮部。木質(zhì)部的導管其功能主要運輸水和無機物，韌皮部的篩管其功能主要是運輸有機物質(zhì)，即將葉片中形成的光合產(chǎn)物運輸?shù)街参矬w的各部分。近年的研究還發(fā)現(xiàn)篩管還能運輸抗逆相關(guān)信號分子、小RNA 等物質(zhì)[20]。植物病毒可利用植物維管組織這一高效的運輸系統(tǒng)，在植物中進行長距離運動以實現(xiàn)系統(tǒng)侵染。在植物病毒系統(tǒng)侵染的模型中，植物病毒由薄壁細胞進入導管/篩管，隨汁液流進行長距離運動，最終從導管/篩管卸載到鄰近的薄壁細胞，建立新的侵染點[6]。植物病毒系統(tǒng)侵染研究中的難點在于解釋病毒如何進入導管/篩管，又如何從導管/篩管卸載到近鄰薄壁細胞。目前普遍性的推測是：病毒由韌皮部伴胞進入篩管的途徑為PPU；病毒由木質(zhì)部薄壁細胞進入導管的途徑為紋孔膜[14-15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)TSWV 病毒粒子存在于導管，說明TSWV 有可能利用導管進行長距離運動。TSWV 為大顆粒病毒，病毒粒子直徑達80～120 nm，遠大于植物胞間連絲的直徑（煙草胞間連絲直徑20～50 nm），那么TSWV 病毒粒子由葉肉細胞進入導管的機制仍然未知。之前的研究發(fā)現(xiàn)有一部分病毒，如PVY 屬病毒TuMV以囊泡相關(guān)VRC 形式存在于導管和篩管內(nèi)，由病毒膜蛋白6K2介導形成囊泡，包裹病毒dsRNA 及病毒RdRp、CP 進行長距離運動[14-15]。6K2為膜蛋白，能誘導ER 膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，產(chǎn)生6K2相關(guān)囊泡，介導TuMV 的胞間運動[12]。番茄斑萎病毒屬病毒編碼的運動蛋白NSm 與6K2功能類似，也為膜蛋白，已證實能夠誘導ER 膜結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生病毒相關(guān)囊泡[21-22]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)伴細胞上有大量病理性的小囊泡，并且在與伴細胞相鄰的篩管中也發(fā)現(xiàn)有小囊泡增多的現(xiàn)象，這些病理性小囊泡是否為TSWV 囊泡相關(guān)VRC，TSWV 是否以VRC 的形式通過篩管進行長距離運動還需要進一步的實驗驗證。

本研究應用TEM 技術(shù)觀察了TSWV 在系統(tǒng)寄主普通煙草K326 維管組織中各類細胞中的分布特征，發(fā)現(xiàn)導管內(nèi)有囊泡包裹的病毒粒體及病毒NCA 類似物，維管薄壁細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中分布有病毒粒體、且囊泡在細胞質(zhì)中有增多現(xiàn)象，伴細胞中存在成熟的病毒粒體和大量的直徑120 nm 左右的囊泡小體、且伴隨有線粒體基質(zhì)膨大和線粒體崩解等現(xiàn)象。而在篩管中未發(fā)現(xiàn)有病毒粒體，但存在較多的直徑80～200 nm 的囊泡小體。暗示TSWV 病毒粒體可能通過導管進行長距離運動，TSWV 囊泡相關(guān)復合體（VRC）可能通過篩管進行長距離運動。