高效解鉀菌的分離篩選鑒定及其對山區(qū)黃瓜的促生效果

宋聰 宋水山 賈振華

摘要：我國耕地土壤鉀元素嚴(yán)重匱乏，亟須解決我國北方山區(qū)土壤缺鉀的現(xiàn)狀，尋求鉀肥替代技術(shù)。從各地土壤中篩選得到1株高效解鉀菌32-2，在含鉀礦石的復(fù)篩培養(yǎng)基中發(fā)酵15 d，發(fā)酵液中可溶性鉀含量達(dá)到37.77 mg/L，是對照的16.22倍，經(jīng)鑒定為草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。通過盆栽試驗結(jié)果表明，與對照相比，32-2對黃瓜種子、幼苗有顯著的促生效果，其中發(fā)芽率提高13.33百分點，發(fā)芽勢提高8.08百分點，株高、地下鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、壯苗指數(shù)、干重根冠比、根系活力分別提高15.83%、13.95%、7.45%、5.19%、9.46%、38.52%;同時，可顯著提高黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)，黃瓜產(chǎn)量增加8.50%，可溶性固形物、可溶性糖、維生素C、可溶性蛋白含量分別提高6.82%、2.78%、43.21%、20.90%。今后32-2可用于微生物肥料的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：土壤解鉀菌;篩選;鑒定;草木樨中華根瘤菌;黃瓜;促生效果

中圖分類號： S182;S642.206 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0266-04

鉀是植物生長所必需的三大營養(yǎng)元素之一，直接影響著植物的生長發(fā)育和抗逆性[1]。我國北方山區(qū)農(nóng)作物生長緩慢，品質(zhì)和產(chǎn)量均低于平原地區(qū)，這跟土壤有機質(zhì)含量低、微生物數(shù)量與種類少、植物生長的營養(yǎng)元素缺乏等有關(guān)，其中有效鉀含量低是造成植物生長緩慢的主要因素之一。實際上北方山區(qū)土壤并不缺鉀，然而95%的土壤鉀以礦物鉀的形態(tài)存在，主要存在于鉀長石和云母中[2]，不能直接被農(nóng)作物吸收和利用。因此，如何轉(zhuǎn)化土壤中的礦物鉀為有效鉀，對緩解我國鉀素供給的壓力、提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。微生物是地球礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)化的原動力，采用解鉀微生物作為土壤中鉀素資源利用的轉(zhuǎn)化因子，是解決山區(qū)土壤缺少有效鉀的有效途徑。

吳洪生等研究表明，在一定條件下，鉀細(xì)菌制劑可分解土壤礦物中難溶性鉀，使土壤速效鉀含量比對照提高128.6%[3]。張紅娟等試驗結(jié)果表明，接種鉀細(xì)菌能促進(jìn)土壤中速效鉀、磷含量較對照分別提高13.2%、84.5%[4]。多項研究結(jié)果表明，解鉀菌對多種植物具有促進(jìn)生長、改善品質(zhì)的作用。其中，郭勛斌等發(fā)現(xiàn)解鉀菌對水稻的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用[5]。吳洪生等研究指出，解鉀菌還可改善花生品質(zhì)，使花生增產(chǎn)17.93%[6]。薛智勇等研究發(fā)現(xiàn)，甘薯接種解鉀菌可增產(chǎn)6.95%～10.27%[7]。那文志等田間試驗結(jié)果表明，解鉀菌對大豆有明顯的增產(chǎn)效果，較對照增產(chǎn)16.85%，還可提高大豆根瘤的結(jié)瘤數(shù)，并在一定程度上抑制病蟲害，起到防病、抗病、增產(chǎn)的效果[8]。雖然關(guān)于高解鉀率的細(xì)菌已有報道，但其絕對解鉀量還是很小的，所以分離篩選高效解鉀菌株仍是現(xiàn)在研究的重點之一。本試驗從全國不同山區(qū)采集的土樣中分離篩選高效解鉀菌株并進(jìn)行鑒定，檢測篩選到的解鉀菌株對鉀元素的利用效果，同時研究解鉀菌對黃瓜種子、幼苗的促生效果及產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，為微生物肥料的開發(fā)提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

據(jù)資料顯示，我國的鉀肥生產(chǎn)只占世界的0.34%，而消耗量卻占14.7%，雖然每年進(jìn)口約600萬t鉀肥[9]，但仍不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對鉀肥的需要。在化學(xué)鉀肥供不應(yīng)求的情況下，開辟新的效果好、成本低、無污染的微生物肥料，挖掘山區(qū)土壤中的鉀素資源，具有重要的研究和應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤和菌株 試驗用于解鉀菌分離的土壤分別采集于河北、黑龍江、山西、云南等地的山區(qū)和丘陵地區(qū)，土壤樣品共75個;供試菌株主要為膠質(zhì)狀芽孢桿菌10013，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物菌種保藏管理中心;黃瓜品種為津研1號，由天津農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院天津蔬菜研究所選育。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基主要有阿須貝氏培養(yǎng)基（0.2 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.2 g NaCl、5 g CaCO3、10 g甘露醇、0.1 g CaSO4·2H2O、18 g瓊脂、1 000 mL水，pH值6.8～7.0）、解鉀菌選擇培養(yǎng)基（5 g蔗糖、2 g Na2HPO4、0.5 g MgSO4·7H2O、0.005 g FeCl3、0.1 g CaCO3、1 g鉀長石（400目）、18 g 瓊脂、1 000 mL水）、解鉀菌復(fù)篩培養(yǎng)基[10 g蔗糖、1 g Na2HPO4、0.5 g（NH4）2SO4、1 g MgSO4·7H2O、0.2 g酵母粉、0.1 g NaCl、0.1 g CaCO3、0.005 g FeCl3、5 g鉀長石、1 000 mL水]。

1.1.3 主要儀器與試劑 Taq聚合酶、DNA marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;引物合成和DNA測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。電泳儀PCR儀購自Bio-RAD公司，紫外可見分光光度計均購自島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.1.4 供試土壤 盆栽土壤取自邢臺市信都區(qū)漿水鎮(zhèn)前南峪村山區(qū)土壤，其理化性質(zhì)：有機質(zhì)含量為24.13 g/kg，全氮含量為1.43 g/kg，全磷含量為0.91 g/kg，全鉀含量為20.03 g/kg，速效氮含量為89.15 mg/kg，速效磷含量為47.15 mg/kg，速效鉀含量為 119 mg/kg，pH值為7.3。

1.2 試驗方法

1.2.1 解鉀菌的分離篩選 從邢臺等地采集共75份土樣，取10 g土樣加入到含90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)30 min，將土壤懸液稀釋103、104、105倍，取 100 μL 土壤懸液涂布在阿須貝培養(yǎng)基和解鉀菌選擇性培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取圓形、透明、表面濕潤黏稠的大菌落，劃線純化3次，將純培養(yǎng)菌株于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 解鉀菌解鉀能力的測定 采用解鉀菌復(fù)篩培養(yǎng)基，按5%的接種量接種D600 nm值為1.5的各菌株發(fā)酵液，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)15 d，于培養(yǎng)3、6、9、12、15 d 采用原子吸收法測定發(fā)酵液中的可溶性鉀含量。

1.2.3 解鉀菌32-2的鑒定 在解鉀菌選擇培養(yǎng)基進(jìn)行菌株培養(yǎng)，48 h觀察菌落形態(tài)。（1）菌株形態(tài)和生理生化鑒定。參照文獻(xiàn)[10]對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化試驗。（2）菌株16S rDNA鑒定。采用通用引物27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）和1492R：（5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′），用菌落PCR擴(kuò)增菌株的16S rDNA選用擴(kuò)增體系（25 μL）：10×Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，25 pmol/μL 引物各 0.5 μL，Taq 0.3 μL，ddH2O 17. 2μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，循環(huán)30次;72 ℃終末延伸 10 min，4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.0軟件，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 解鉀菌對黃瓜種子和幼苗的促生效果 挑選籽粒飽滿的黃瓜種子，用75%乙醇表面消毒 30 s，蒸餾水洗滌3～4遍，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中浸種24 h，然后置于鋪有滅菌濕紗布的培養(yǎng)皿上，室溫下催芽。待黃瓜種子整齊發(fā)芽后，播種于50孔塑料穴盤中，盤中裝有經(jīng)2次高壓蒸汽滅菌的山區(qū)菜園土，試驗分3個處理：處理1，菜園土中澆灌濃度為1×108 CFU/mL 32-2菌懸液;處理2，澆灌濃度為1×108 CFU/mL 10013菌懸液;處理3，清水對照（CK）。將解鉀菌接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。離心發(fā)酵液，去除上層液體，用無菌水稀釋菌體，混勻即為所需菌懸液。10 kg 菜園土加入菌懸液1 L，每盤播種50粒黃瓜種子，黃瓜幼苗置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度為28 ℃，相對濕度為65%，光周期為12 h/12 h。第4天計算發(fā)芽勢，第7天計算發(fā)芽率，待種子發(fā)芽結(jié)束后分別從各處理中選取12組發(fā)育基本一致的黃瓜幼苗，每組5株，培養(yǎng)3周，測量黃瓜莖粗、株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，并計算植株壯苗指數(shù)。

1.2.5 解鉀菌對黃瓜產(chǎn)量及品質(zhì)的影響 黃瓜幼苗移栽至口徑為50 cm、高為35 cm的花盆中，每盆定植1株，盆中裝有經(jīng)2次高壓蒸汽滅菌的山區(qū)菜園土，試驗于河北省石家莊鹿泉區(qū)河村溫室大棚中進(jìn)行。采用1×108 CFU/mL 32-2和10013菌懸液灌根處理，用量為1 L/株，黃瓜生長期內(nèi)每2周處理1次，共處理9次，對照為清水灌根。測定黃瓜的果實橫徑、縱徑、平均單果質(zhì)量和單株產(chǎn)量以及可溶性糖、可溶性蛋白、維生素C、可溶性固形物含量。其中，可溶性固形物含量采用手持折光儀測定;可溶性糖含量采用蒽酮比色測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定;維生素C含量采用2，6-二氯靛酚滴定法[11]測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行處理，用DPS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解鉀菌的分離篩選

在阿須貝氏培養(yǎng)基和解鉀選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行解鉀菌株的篩選，共篩選出7株解鉀菌株（圖1），分別命名為21-2、Z14-3、63-4、31-4、BM-1、32-2、64-6。對初篩的7株菌株進(jìn)行搖瓶解鉀試驗，分別測定培養(yǎng)3、6、9、12、15 d發(fā)酵液中的可溶性鉀含量，其中接種邢臺油麥菜地中分離到的菌株32-2，發(fā)酵15 d時發(fā)酵液中可溶性鉀含量為37.77 mg/L，是對照中可溶性鉀含量的16.22倍。

2.2 解鉀菌32-2的鑒定

在解鉀選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行32-2菌株培養(yǎng)，48 h 觀察菌落形態(tài)，該菌株菌落呈圓形、邊緣整齊、透明凸起、表面濕潤、菌落黏稠、菌落挑起時有彈性、可拉成絲。用顯微鏡觀察菌體發(fā)現(xiàn)，該菌呈革蘭氏陰性，菌體橢圓形，產(chǎn)生橢圓形芽孢和肥大的莢膜。由表1可以看出，對菌株32-2進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增得到1條1 500 bp左右的條帶，將其測序后的序列信息提交給NCBI，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）?？梢钥闯?，32-2與草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti） strain ORS1044（LMG 15285）聚于同一個支上，序列相似性達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特性，32-2初步鑒定為草木樨中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）菌株。

2.3 解鉀菌32-2對黃瓜種子和幼苗的促生效果

發(fā)芽勢是指種子發(fā)芽達(dá)到高峰期的發(fā)芽率，是衡量種子發(fā)芽整齊程度的指標(biāo)。由表2可知，在濃度為1×108 CFU/mL的32-2和10013處理下黃瓜發(fā)芽率均顯著高于對照，而32-2處理的發(fā)芽率比10013處理的高出3.93%，發(fā)芽勢高出7.97%。

由表3知，32-2處理的黃瓜幼苗，其株高、地下鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、壯苗指數(shù)、干質(zhì)量根冠比、根系活力等指標(biāo)均顯著高于對照，且該處理的黃瓜幼苗株高、地下鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、干重根冠比、根系活力等指標(biāo)也顯著高于10013處理的黃瓜幼苗。

2.4 解鉀菌對黃瓜產(chǎn)量及品質(zhì)的影響

通過測量黃瓜果實橫徑、縱徑、單果質(zhì)量、產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，32-2處理后果實的橫徑、縱徑、單果質(zhì)量、產(chǎn)量均顯著高于對照，而10013處理后的果實橫徑、產(chǎn)量分別與對照無顯著差異。32-2產(chǎn)量比對照增產(chǎn)8.41%，而10013處理的黃瓜產(chǎn)量只比對照增產(chǎn)0.24%（表4）。通過測量黃瓜各項品質(zhì)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，32-2處理后黃瓜的可溶性固形物、可溶性糖、維生素C、可溶性蛋白含量均顯著高于對照，而10013處理后的黃瓜品質(zhì)各項指標(biāo)與對照無顯著性差異（表5）。

2.5 解鉀菌對土壤養(yǎng)分狀況的影響

施用菌株32-2和10013后種植黃瓜的土壤有機質(zhì)和速效鉀含量均有一定程度提高?？梢姡⑸锞鷦Ω纳仆寥鲤B(yǎng)分具有較好的效果（表6）。

3 結(jié)論與討論

本試驗發(fā)酵條件是在實驗室條件下應(yīng)用搖瓶試驗完成的，菌株如果應(yīng)用到實際生產(chǎn)，還應(yīng)綜合考慮各方面因素，在保證菌株效果的前提下，選用廉價原料和合適的培養(yǎng)條件，使菌劑的生產(chǎn)效益最大化。吳凡等在對桑樹根際解鉀菌進(jìn)行鑒定時，發(fā)現(xiàn)了2株具有較強解鉀能力的根瘤菌（FK11和FK8）[12]。有研究表明，接種根瘤菌對相思苗木的生長有顯著的促進(jìn)作用，并明顯提高土壤有效鉀的含量[13]。張亮等通過液體培養(yǎng)試驗研究了8株菜豆根瘤菌對土壤鉀的活化作用。由此可知，根瘤菌除具有固氮能力，某些菌株還可以活化土壤中的無效鉀，從而提高土壤鉀的生物有效性，達(dá)到對植物促生的效果[14]。本試驗獲得的高效解鉀菌株 32-2 可高效分解鉀礦石中的鉀元素，發(fā)酵15 d時發(fā)酵液中可溶性鉀含量為37.77 mg/L，是對照中可溶性鉀含量的16.22倍。同時，對黃瓜有顯著的促生作用，黃瓜幼苗濃度為1×108 CFU/mL的32-2處理下發(fā)芽率均顯著高于對照，且處理后的黃瓜幼苗株高。地下鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、壯苗指數(shù)、干質(zhì)量根冠比、根系活力等指標(biāo)均顯著高于對照，同時果實的產(chǎn)量和品質(zhì)各項指標(biāo)均顯著高于對照。但是，中華草木樨根瘤菌32-2的解鉀機制和促生機制還有待進(jìn)一步研究。

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