基于ISSR標記的29種石斛遺傳多樣性分析

胡利娟 賈元 田忠靜 馮群 劉杰 朱斌

摘要：遺傳多樣性分析可為野生植物的開發(fā)與保護提供科學依據(jù)。采集貴州地區(qū)的29份石斛資源，通過簡單重復序列間擴增（inter-simple sequence repeats，簡稱ISSR）標記對其進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從16條引物中篩選出13條多態(tài)性穩(wěn)定的ISSR引物進行擴增。結(jié)果表明，13條引物共擴增出214個條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為212個，多態(tài)性比例為99.07%，平均每個引物擴增的條帶數(shù)為16.46條。隨后利用非加權(quán)平均距離法（UPGMA）對其進行聚類分析，結(jié)果顯示，29份石斛材料的遺傳相似系數(shù)為0.678～0.804。在遺傳相似系數(shù)為0.715處，可以把29種石斛植物劃分為10個類群，從而證明所取石斛材料的遺傳多樣性十分豐富。

關(guān)鍵詞：石斛;ISSR分子標記;遺傳多樣性;親緣關(guān)系

中圖分類號： S567.23+9.01 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0076-05

石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）的大屬之一，屬附生蘭類多年生草本植物。全球約有 1 500 多種石斛屬植物，主要分布于亞洲、歐洲、大洋洲等地[1]，中國現(xiàn)共有76種石斛屬植物，主要產(chǎn)區(qū)分布于四川、云南、廣西和貴州等省份的原始森林以及安徽、浙江等省份[2]。大多數(shù)石斛具有藥用和觀賞價值，目前發(fā)現(xiàn)的藥用石斛有39種，具有潤肺生津、活血化瘀、治療心血管疾病等功效[3]。由于石斛種類繁多，歷代本草著作稱之為醫(yī)工難辨的種類[4]。隨著人們對藥用及觀賞石斛需求量的不斷擴大和森林砍伐等多方面的影響，野生石斛屬植物資源面臨枯竭，已經(jīng)成為瀕危植物[5]。近年來，由于人們對藥用石斛需求量的加大，石斛種植面積不斷增加，選育優(yōu)良石斛品種供生產(chǎn)使用尤為重要。

為了更好地利用藥用石斛種質(zhì)資源，更準確地了解石斛種質(zhì)資源的類型及親緣關(guān)系，對石斛資源進行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析顯得尤為重要[6]。目前應用于石斛屬植物種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系研究的分子生物學方法主要有隨機擴增多態(tài)性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）、簡單重復序列間擴增（inter-simple sequence repeats，簡稱ISSR）等[7-9]。ISSR技術(shù)是由加拿大蒙特利爾大學的Zietkewicz等發(fā)展起來的一種基于微衛(wèi)星（SSR）序列的分子標記技術(shù)，與SSR相比，用于ISSR的引物不需要預先的DNA測序，而是用半隨機引物進行擴增，可獲得豐富的多態(tài)性[10]。ISSR標記的特點是數(shù)量豐富、廣泛分布于整個基因組、具有較多的等位性變異與共顯性標記、可鑒別出雜合子和純合子、試驗的重復性較好等。本研究選用29種石斛材料，采用ISSR-PCR分子標記研究其遺傳多樣性，并創(chuàng)建親緣關(guān)系圖譜進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

本研究共選用29種石斛材料（表1），其中27種為石斛屬，1種為石豆蘭屬，1種為釵子股屬，目前統(tǒng)一種植于貴州師范大學生命科學學院四樓實驗室。

試驗試劑：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯酚、三氯甲烷、異戊醇、鹽酸、無水乙醇等，均購自貴州凱信生物科技有限公司;2×Taq Master Mix（Dye），含有0.1 U/μL Taq DNA聚合酶、3 mol/L氯化鎂和40 μmol/L dNTPs，購自北京康為世紀生物科技有限公司;ISSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

試驗儀器：ETC811PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）;DYY-8C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;DYCP-31E型電泳槽（北京六一生物科技有限公司）;K8360凝膠成像分析系統(tǒng)（北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司）;離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 基因組DNA的提取

從實驗室栽培的石斛植株上取幼嫩葉片，參考CTAB法[11]并加以調(diào)整，用于提取植物基因組DNA。調(diào)整后的方法如下：剪取0.1 kg石斛的幼嫩葉片（新鮮葉片也可）放置于研缽中，加入750 μL 2%（質(zhì)量分數(shù)）CTAB水溶液進行研磨，將葉片充分研磨后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，65 ℃水浴60 min（其間每 20 min 搖勻 1 次），取出離心管冷卻到室溫，在通風櫥內(nèi)通風狀態(tài)下加入750 μL苯酚+三氯甲烷+異戊醇（體積比為25 ∶ 24 ∶ 1）的混合液，上下顛倒搖勻，置于離心機中12 000 r/min離心 15 min，輕輕取出，取上清液500 μL于新的試管中，向上清液中加入1 000 μL冰的無水乙醇沉淀DNA（無水乙醇在提取DNA前先置于-20 ℃冰箱中凍存一段時間），在-20 ℃條件下放置20 min或更長時間（放置時間的長短可根據(jù)DNA的析出程度調(diào)節(jié)，若DNA析出較多，則不用在-20 ℃條件下長時間放置）。DNA析出后，置于離心機中8 000 r/min離心5 min去除上清液，沉淀用50%乙醇清洗3次，第3次清洗時乙醇不倒出，放置過夜，第2天離心后倒掉上清液乙醇，放置于室溫下晾干或置于通風櫥中風干，至DNA沉淀呈透明狀，再加入200 μL無菌去離子水溶解DNA，溶解后置于-20 ℃保存。

1.3 引物的篩選

ISSR引物是根據(jù)楊立昌等公布的引物序列[11-12]合成的，從生工生物工程（上海）股份有限公司合成的16個引物中篩選出13個擴增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物用于29份石斛材料種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析。

1.4 ISSR-PCR擴增

ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。參考ISSR反應體系[13]并加以改進，改進后的22 μL反應體系如下：4 μL DNA，1 μL引物，8 μL Mix（含有氯化鎂、dNTP、Taq酶、反應緩沖液），9 μL超純水。

PCR擴增程序：94 ℃預變性7 min;94 ℃變性 1 min，退火45 s[退火溫度依據(jù)不同引物而定（表2）]，72 ℃延伸2 min，共45個循環(huán);72 ℃復性 7 min，4 ℃保存PCR擴增產(chǎn)物。

1.5 電泳

用1×TAE緩沖液配制1.5%瓊脂糖凝膠，將凝膠放置于含有1×TAE緩沖液的電泳槽中，使緩沖液沒過凝膠表面約2 mm。PCR產(chǎn)物上樣量為 18 μL，使用Super DNA marker標定擴散片段長度，在90 V電壓下電泳90 min，再置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察，檢測ISSR-PCR電泳譜帶。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

按照電泳圖譜中同一位置上DNA條帶的有無進行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，構(gòu)成0/1矩形圖，用NTSYS 2.10軟件SHAN程序中的非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）對樣品進行聚類分析，構(gòu)建29種石斛材料的親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的選擇

本研究用16個引物對29種石斛材料的基因組DNA進行預試驗擴增，并對16個引物進行篩選，獲得13個多態(tài)性較好的引物，然后用篩選出的13個引物對29種石斛材料進行擴增。從表3看出，擴增條帶數(shù)最多的是引物ISSR-1，擴增出21個條帶，擴增條帶最少的是引物T3B，只擴增出11個條帶。

2.2 ISSR-PCR擴增結(jié)果

根據(jù)對凝膠成像系統(tǒng)拍照結(jié)果的分析得到0/1矩陣圖（本文未列出）。由圖1和圖2可以看出，電泳共檢測出214個擴增條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為212個，多態(tài)性比例為99.07%，平均每條引物擴增的條帶數(shù)為16.46條，說明供試樣品具有較高的多態(tài)性。

2.3 遺傳相似性及親緣關(guān)系

由圖3可以看出，13條引物能將29種石斛材料分開，遺傳相似系數(shù)（GS）變化范圍為0.678～0.804，表明供試樣品有較近的親緣關(guān)系。在遺傳相似系數(shù)0.715處，可以將石斛材料分為10個大組，每個大組又分為不同的小組：第1組，包含7種石斛，分別是鐵皮石斛、報春石斛、銅皮石斛、串珠石斛、黃貝殼石斛、釵子股、石豆蘭，說明該大組內(nèi)7種石斛的親緣關(guān)系比較近，其中鐵皮石斛與報春石斛的遺傳相似系數(shù)達到0.790，在29種石斛植物中，這2種石斛的遺傳相似系數(shù)排第3;第2組，包含4種石斛，分別是尖刀唇石斛、鼓槌石斛與大龜背石斛、黑毛石斛，其中鼓槌石斛、大龜背石斛的遺傳相似系數(shù)為0.800，是29種石斛材料中親緣關(guān)系最近的2種;第3組，包含3種石斛，分別是扭瓣石斛、蜂腰石斛、赤水金釵石斛，其中扭瓣石斛與蜂腰石斛的遺傳相似系數(shù)為0.795，在29種石斛材料中，是除了鼓槌石斛與大龜背石斛之外遺傳相似系數(shù)最高、親緣關(guān)系最近的2種石斛;第4組，包含3種石斛，分別是腫節(jié)石斛、杯鞘石斛、翅梗石斛;第5組，包含2種石斛，分別是密花石斛、喉紅石斛;第6組，包含4種石斛，分別是反瓣石斛、球花石斛、杓唇石斛、燈籠石斛，其中反瓣石斛與球花石斛的遺傳相似系數(shù)為0.790，親緣關(guān)系也非常近;第7組，包含3種石斛，分別是蜻蜓石斛、劍葉石斛、線葉石斛;第8組，包含虎牙石斛;第9組，包含紅牙刷石斛;第10組，包含天宮石斛。從聚類分析結(jié)果可以看出，虎牙石斛、紅牙刷石斛、天宮石斛這3種石斛與其他26種石斛的親緣關(guān)系較遠。

3 討論

石斛屬植物分布在中國秦嶺淮河以南諸省，其中云南、廣西、臺灣、貴州為分布中心[14]。根據(jù)傳統(tǒng)的分類方法，石斛屬植物可以分成不同的組別，《中國植物志》將中國石斛的74個種劃分為12個組[15]，其中藥用石斛有39種，并且有的石斛種類僅從莖、葉等形態(tài)上無法加以區(qū)分[16]。因此，分子標記也被應用于石斛的分子鑒定中。DNA分子標記不受環(huán)境因素的影響，能直接反映基因組DNA之間存在的差異[17]。現(xiàn)代分子標記不僅可用于石斛植物的分子鑒定，還能全面揭示不同石斛種群的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。本研究選用29種石斛為樣本，采用13條引物分析不同石斛品種資源的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，微衛(wèi)星位點多態(tài)性比例達到99.07%，表明石斛的遺傳多樣性極其豐富。在所選擇的13條引物中，有的引物擴增條帶數(shù)較多，如引物ISSR-1的擴增條帶數(shù)為21條，引物UBC899的擴增條帶數(shù)為20條。但也有部分引物的擴增條帶數(shù)較少，如引物T3B、CTC4Rca、UBC811分別只擴增出了11、12、13條條帶，可見不同石斛有著復雜的遺傳背景。

本研究中石斛的ISSR分子標記聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)的分類結(jié)果基本相同，但也存在差異，可能與分析過程中取樣的多少、基因組DNA的提取方法、PCR擴增體系的異同等有關(guān)。自然環(huán)境因子的復雜多樣性也可能是造成這種差異的原因。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的分子生物學方法被應用于石斛屬植物種質(zhì)資源的鑒定和親緣關(guān)系的研究中，如RAPD、RFLP、AFLP等。在今后的研究中，應進一步采用多種分子生物學方法對同一石斛屬植物材料的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進行分析。

參考文獻：

[1]Dressler R L. Phylogeny and classification of the Orchid family[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1993.

[2]劉 靜，何 濤，淳 澤. 分子標記技術(shù)在石斛屬植物中的應用研究進展[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2008，14（6）：855-862.

[3]陳曉梅，郭順星. 石斛屬植物化學成分和藥理作用的研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2001，13（1）：70-75.

[4]包雪生，順慶生，陳立鉆. 中國藥用石斛[M]. 上海：復旦大學出版社，2001：1-40.

[5]孔 瓊，袁盛勇，薛春麗，等. 云南野生石斛ISSR-PCR分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，2015，28（3）：1242-1245.

[6]李永清，江金蘭，葉 煒，等. 37份藥用石斛種質(zhì)資源親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報，2015，30（2）：131-135.

[7]張 婷，徐珞珊，王崢濤，等. 藥用植物束花石斛、流蘇石斛及其形態(tài)相似中的PCR-RFLP鑒別研究[J]. 藥學學報，2005，40（8）：728-733.

[8]馮夏蓮，何承忠，張志毅，等. 植物遺傳多樣性研究方法概述[J]. 西南林學學報，2006，26（1）：69-74.

[9]王慧中，應奇才，施農(nóng)農(nóng)，等. 利用RAPD分析13種石斛屬植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系[J]. 中草藥，2006，37（4）：588-592.

[10]曾 民，郭鴻彥，胡學禮，等. 大麻研究中的分子標記應用[J]. 中國麻業(yè)科學，2007，29（4）：189-191.

[11]楊立昌，鄧 輝，乙 引，等. 藥用石斛ISSR分子標記研究[J]. 中藥材，2010，33（12）：1841-1844.

[12]杜明鳳，李明軍，陳慶富. 淫羊藿屬植物PCR-RFLP遺傳多樣性研究[J]. 中草藥，2012，43（3）：562-567.

[13]李盛清，張傳博，乙 引，等. 石斛ISSR-PCR體系的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2012，40（8）：37-39.

[14]李 琴，楊彥伶，彭 嬋，等. 藥用石斛研究進展[J]. 農(nóng)學學報，2018，8（10）：61-64.

[15]吉占和. 中國植物志（第十九卷）[M]. 北京：科學出版社，1999：67-146.

[16]張 智，霍立業(yè). 霍山石斛營養(yǎng)器官的解剖結(jié)構(gòu)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1995，22（3）：301-304.

[17]莫建梅，劉鶯燕，李慶國，等. “龍頭鳳尾”鐵皮石斛基因鑒別及復方膠囊降血糖研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（1）：182-185.