低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯參與ABA信號轉導的基因表達分析

劉璐 劉蕓伯 佟佳欣 閆彤 徐洪偉 周曉馥

摘要：為了探究牛皮杜鵑在低溫脅迫下MAPK級聯途徑參與ABA信號轉導的分子機制，通過轉錄組測序的方法對4 ℃低溫處理組和25 ℃正常對照組牛皮杜鵑進行研究。結果表明，轉錄組測序共得到6.40 Gb clean data，低溫組篩選出12 261個差異表達基因，其中上調基因和下調基因的數量分別為6 811個和5 450個。對關鍵基因進行KEGG注釋發(fā)現，共有228個差異表達基因富集到MAPK信號通路-植物通路，其中ABA信號轉導通路中大部分差異表達基因發(fā)生上調，說明該信號通路在低溫脅迫下被激活。推測牛皮杜鵑在低溫脅迫下可激活MAPK級聯途徑中相關基因的表達來參與ABA信號轉導過程，進而應對低溫環(huán)境所帶來的不利影響。

關鍵詞：牛皮杜鵑;低溫脅迫;MAPK級聯途徑;ABA信號轉導;基因表達分析

中圖分類號：S685.210.1 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0059-06

牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthum Pall. ）別稱牛皮茶，杜鵑花科杜鵑屬，是世界上最珍貴的種質資源之一，由于具有重要的觀賞及藥用價值[1]，因此極具開發(fā)潛力。

低溫作為一種主要的逆境脅迫，嚴重影響植物的地理分布和品質[2]。脫落酸（ABA）既是一種植物激素也是一種信號傳導物質，在植物逆境研究方面具有重要意義[3]。有研究證實，低濃度的ABA處理冬小麥幼苗會促使其生長，而高濃度的ABA則會抑制幼苗的光合作用效率，引起生物量積累下降[4]。 MAPK（mitogen activated protein kinase）級聯途徑包括MAPKKK-MAPKK-MAPK 3個組分，這3個組分既可獨自發(fā)揮作用也可彼此協作發(fā)揮作用，使植物及時作出相應的反應以抵御逆境脅迫帶來的危害，該途徑也被認為是植物細胞將胞外刺激轉換成胞內反應的主要途徑之一[5-7]。大量研究表明，MAPK級聯途徑的3個組分均可直接或間接地參與ABA信號轉導過程，ABA信號也可調控MAPK級聯途徑中相關組分基因的表達[8]，但是對兩者相互作用的分子機制卻鮮有研究。

近年來，轉錄組測序技術應用廣泛，它可不依賴參考基因組，這為牛皮杜鵑等無內參的非模式生物的轉錄組研究提供了新方法[9]。本研究以牛皮杜鵑為試驗材料，應用轉錄組測序的方法研究在 4 ℃ 低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯途徑參與ABA 信號轉導過程的基因表達情況，旨在從分子水平上探究二者相互作用的分子機制，為植物抗逆境脅迫研究提供理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

牛皮杜鵑采自長白山，用1/4 MS培養(yǎng)基置于吉林師范大學吉林省植物資源科學與綠色生產重點實驗室模擬高山植物智能人工氣候室中正常培養(yǎng)[光—暗周期14 h—10 h;晝溫25 ℃，夜溫18 ℃;光子通量密度50 μmol/（m2·s）]，選取8個月大的牛皮杜鵑組培苗為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 2018年9月20日選擇8個月大長勢一致且良好的牛皮杜鵑隨機分成2組，每組12棵。隨機選擇其中1組置于智能人工培養(yǎng)箱[光—暗周期14 h—10 h;晝溫25 ℃，夜溫18 ℃;光子通量密度50 μmol/（m2·s ）]中，記為對照組;另外1組移至4 ℃ 低溫環(huán)境下，記為低溫組。24 h后取出2組牛皮杜鵑于液氮中速凍后置于低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，每組3次重復。

1.2.2 轉錄組測序數據分析 mRNA文庫構建委托華大基因完成。對得到的原始數據進行過濾，去除不符合要求的reads，以保證結果的可靠性。使用RPKM值衡量基因的表達量，用以差異基因表達量的確定和分析，并篩選差異表達基因及功能注釋。

1.2.3 統計分析 使用SPSS 16.0進行單向ANOVA，運用LSD檢驗差異性。采用Sigmaplot 12.5進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 RNA質量檢測

經華大基因檢測，對試驗組和對照組樣品總RNA進行質量評價，符合建庫標準。

2.2 數據組裝和質量分析

通過高通量測序獲得原始數據，統計原始數據測序量。使用BUSCO數據庫對組裝的轉錄本進行產量評估。結果顯示，Q30均在95% 以上，GC含量接近50%，N50值在1 k左右，說明測序數據可以用于組裝（表1）。

對過濾后符合要求的數據進行預處理，得到clean reads數。如表2所示，2組中的clean reads均占原始raw reads的85 % 以上，說明數據組裝和測序精確度較好。

2.3 差異表達基因的篩選與注釋

2.3.1 差異表達基因的篩選 為了研究低溫脅迫下ABA調控MAPK信號在牛皮杜鵑中的作用，對低溫處理組和對照組牛皮杜鵑進行轉錄組分析。將差異表達量大于2倍的基因視為差異表達基因。在此標準下，低溫組共篩選出12 261個差異表達基因，包括6 811個上調基因和5 450個下調基因。

2.3.2 差異表達基因的KEGG富集分析 根據KEGG數據庫，低溫組篩選出的差異表達基因中有7 031個基因被注釋在細胞過程、環(huán)境進化過程、遺傳進化過程、新陳代謝和有機系統這五大類代謝通路的19個小類中（圖1）。其中，在2組牛皮杜鵑的差異基因KEGG分類中，448個差異基因參與了信號轉導這一途徑。

在信號轉導途徑中，有228個差異表達基因富集到MAPK信號通路-植物通路，對這部分差異基因進一步富集分析，以Qvalue最小的前20個GO Term作圖（圖2）。分別為MAPK信號通路-植物、植物-病原互作、植物激素信號轉導、氨基糖和核苷酸糖代謝、蛋白酶體、色氨酸代謝、磷脂酰肌醇信號系統、乙醛酸和二羧酸代謝、過氧化物酶體等。

由圖3可見，牛皮杜鵑PYR/PYL-PP2C-SnRK2信號通路在響應低溫脅迫的過程中，差異基因的表達量發(fā)生顯著改變，且大部分的差異基因表達量發(fā)生上調（表3），由圖4可知，低溫脅迫下SnRK2促使下游AREB/ABF家族中的差異基因表達量發(fā)生顯著變化，推測在低溫脅迫下牛皮杜鵑激活了ABA信號轉導途徑中相關基因的表達，促進氣孔關閉、種子休眠。

2.4 低溫脅迫下MAPK級聯途徑參與ABA信號轉導的關鍵基因表達分析

2.4.1 低溫脅迫對牛皮杜鵑MAPK級聯信號途徑中關鍵基因的影響 結合圖2分析結果，最終確定從MAPK信號通路-植物、植物-病原互作、植物激素信號轉導、氨基糖和核苷酸糖代謝、蛋白酶體、色氨酸代謝、磷脂酰肌醇信號系統、乙醛酸和二羧酸代謝、過氧化物酶體這幾個代謝途徑尋找低溫脅迫下MAPK級聯途徑參與ABA信號轉導途徑中發(fā)生差異表達的關鍵基因。

MAPK信號通路-植物和植物激素信號轉導是低溫脅迫下牛皮杜鵑信號轉導途徑中2個最重要的途徑，參與多種植物代謝活動。對這富集在2條代謝通路的差異基因進行統計分析，結果顯示，在這2條代謝通路中，上調基因的數量都大于下調基因的數量，說明牛皮杜鵑這2條代謝途徑中的大部分關鍵基因的表達受低溫脅迫影響顯著。

結合表3與圖5結果，在MAPK級聯信號途徑中，低溫脅迫激活了MAPK17/18，然后以逐級磷酸化的方式激活MKK3、MPK1/2以及下游脅迫適應基因，其中MAPK17/18、MKK3和MPK1/2基因表達量發(fā)生上調，脅迫適應基因表達量發(fā)生下調。結果表明，牛皮杜鵑MAPK級聯信號途徑中的關鍵基因受到低溫脅迫的顯著影響。

2.4.2 低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯途徑參與ABA信號轉導調控 ABA作為一種主要的逆境激素，在植物面臨低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫時，其含量在短時間內會明顯上升，通過激活多條途徑中相關基因的表達來維持自身生理狀態(tài)的穩(wěn)定。在本研究中，如圖3所示，在外界環(huán)境信號刺激下，通過啟動類胡蘿卜素生物合成過程來開啟ABA合成系統，通過去磷酸化作用使得PP2Cs抑制SnRK2s活性，但受低溫脅迫的影響導致ABA含量升高，解除了這種抑制作用，使得SnRK2得到釋放，最終SnRK2促使下游AREB/ABF轉錄因子磷酸化，誘導ABA響應基因的表達。

而在低溫脅迫下ABA的PYR/PYL-PP2C-SnRK2信號通路中的大部分基因的表達量都發(fā)生上調，推測牛皮杜鵑在低溫脅迫下可以通過激活脫落酸合成相關基因，合成大量的脫落酸，促進氣孔關閉，種子休眠，通過改變ABA信號轉導途徑中相關基因的表達量，增強牛皮杜鵑抵抗低溫的能力。

3 討論

3.1 低溫脅迫對牛皮杜鵑MAPK級聯途徑的影響

對擬南芥和其他植物的研究中發(fā)現，MAPK級聯是植物響應逆境脅迫的一條重要代謝途徑[10]。在研究非生物脅迫對玉米的抗氧化防御機制的影響時發(fā)現，在低溫處理下，MAPK級聯途徑受到抑制后，玉米中抗氧化酶活性均不同程度減弱，對低溫信號反應遲鈍[11]。在本研究中，MAPK級聯途徑各組分在響應低溫脅迫的過程中，先激活了MAPK17/18，然后以逐級磷酸化的方式依次激活MKK3、MPK1/2以及下游脅迫適應基因，其中MAPK17/18、MKK3和MPK1/2基因表達量發(fā)生上調，脅迫適應基因表達量發(fā)生下調。這些結果說明牛皮杜鵑MAPK級聯信號途徑中的關鍵基因受到低溫脅迫的顯著影響，并通過調節(jié)MAPK級聯途徑中相關基因的表達量來應對低溫環(huán)境對其造成的不良影響。

3.2 低溫脅迫對牛皮杜鵑MAPK級聯途徑參與ABA信號轉導的影響

大量研究表明，植物在面臨低溫等非生物逆境脅迫時，會引起植物自身ABA的累積效應[12-13]，而MAPK級聯作為參與ABA信號轉導的主要途徑之

一，更是控制著細胞的諸多生命活動[14]。PP2C在非脅迫條件下可通過去磷酸化使SnRK2失去活性，進而使得ABA信號傳遞終止[15]。而一旦接受外界或植物自身信號刺激并激活ABA合成相關基因誘導合成ABA之后，ABA與受體蛋白結合并在與PP2C互作時便可抑制PP2C活性以達到釋放SnRK2的目的，使得SnRK2恢復活性繼而磷酸化下游的AREB/ABF，將上游信號向下傳遞[16]。在本研究中，低溫脅迫下ABA的PYR/PYL-PP2C-SnRK2信號通路中的大部分基因的表達量都發(fā)生上調，推測低溫脅迫可以通過激活MAPK級聯途徑，進而影響ABA信號轉導途徑中相關基因的表達量的變化，使其在ABA信號轉導途徑中發(fā)揮作用。

4 結論

綜上所述，本研究通過轉錄組測序的方法對低溫脅迫下牛皮杜鵑MAPK級聯途徑參與ABA信號轉導過程中的關鍵基因進行分析，推測低溫脅迫可以激活MAPK級聯途徑中3個蛋白激酶家族中的關鍵基因，并調控了ABA信號轉導途徑中相關基因的表達，從而激活ABA調控MAPK信號過程來應對低溫脅迫環(huán)境。

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