二乙烯亞胺對水貂腸炎細小病毒滅活效果的研究

羅國良，王振軍，馮二凱，易立，郭利，葉明，張淼，程悅寧※

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所，長春 130112；2.吉林特研生物技術有限責任公司，長春 130122）

水貂病毒性腸炎又稱水貂細小病毒性腸炎，是由水貂腸炎細小病毒（Mink enteritis virus，MEV）引起的以劇烈腹瀉為主要臨床特征的急性、烈性和高度接觸性傳染病。在自然條件下，不同品種和不同年齡的水貂均有感染性，但幼貂的感染性極強。水貂病毒性腸炎沒有特異性的治療藥物，疫苗接種是控制該病流行的有效手段。

目前，用于水貂腸炎細小病毒免疫預防的常規(guī)疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗。滅活疫苗常用的傳統(tǒng)滅活劑為甲醛，甲醛滅活工藝雖能取得較好的滅活效果，但甲醛易破壞病毒的免疫原性，且其殘留易引起機體應激反應。二乙烯亞胺是烷化劑的一種，作為另一類良好的病毒滅活劑，僅破壞病毒的核酸，而不影響蛋白成分結構，能最大程度保持病毒的抗原性[1]，近年來已應用于豬細小病毒[2]、貓杯狀病毒[3]、偽狂犬病毒[4]、口蹄疫病毒[5]等多種病毒的滅活，并取得良好的免疫效果。本試驗通過使用不同終濃度的二乙烯亞胺（Binary ethylenimine，BEI）對 MEV 進行不同時間的滅活，確定BEI滅活參數，并對BEI滅活和甲醛滅活的水貂腸炎細小病毒滅活疫苗進行了免疫效果對比。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 水貂腸炎細小病毒MEVB株（中國農業(yè)科學院特產研究所保存）；F81細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫提供）。

1.1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning公司），2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）（Sigma-Aldrich公司），甲醛（國藥集團），其它試劑為國產分析純。

1.1.3 實驗動物 水貂，購自農業(yè)部長白山野生生物資源重點野外科學觀測試驗站。

1.2 方法

1.2.1 BEI的配制 用0.2N NaOH溶液配制0.1mol/L的BEA溶液，在37℃下作用，其間每隔10min～15min振搖1次，作用60min即成0.1mol/L的BEI溶液，然后0.22μm濾器過濾除菌。

1.2.2 MEVB滅活試驗 隨機取MEVB病毒液5瓶，500mL/瓶，4瓶病毒液按終濃度為 0.003mol/L、0.002mol/L、0.001mol/L、0.000 5mol/L分別加入BEI溶液，另1瓶病毒液按終濃度為0.15%加入甲醛溶液。以上5瓶病毒液與滅活劑充分混勻，于30℃滅活，分別于24h、48h、72h取樣進行滅活檢驗，用BEI滅活的病毒液于72h取完樣后加入 BEI使用量的10%的1mol/L硫代硫酸鈉中和BEI。

1.2.3 滅活檢驗 取滅活病毒液，用無血清 MEM 1∶5稀釋后分別同步接種F81細胞4瓶，每瓶0.5mL，置37℃下培養(yǎng)，24h后換維持液，繼續(xù)培養(yǎng)3日后再傳1代，觀察有無細胞病變，收獲培養(yǎng)液進行血凝試驗，檢測其對豬紅細胞的血凝價。

1.2.4 滅活疫苗的制備 取經滅活檢驗合格的病毒液（BEI滅活濃度為0.002mol/L、滅活時間24h），按病毒液∶氫氧化鋁膠＝9∶1的比例制成水貂腸炎細小病毒滅活疫苗，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行性狀和無菌檢驗。

1.2.5 滅活疫苗安全試驗 取制備的疫苗肌肉注射健康易感水貂〔水貂腸炎細小病毒血凝抑制抗體（HI）≤1∶4〕5只，每只水貂 5mL，分4點注射，觀察10d，觀測精神、食欲、體溫、糞便與接種部有無異常反應。

1.2.6 滅活疫苗效力試驗 用2月齡～10月齡健康易感水貂 5只（水貂腸炎細小病毒 HI抗體效價≤1∶4），分別肌肉接種BEI疫苗1mL；另設甲醛滅活疫苗組水貂5只，肌肉接種1mL/只，作為平行對照，21d后，連同陰性對照水貂5只，分別采血，測定HI抗體效價。

2 結果

2.1 不同濃度BEI滅活效果

BEI滅活濃度＞0.002mol/L時，滅活24h以后的樣品均未出現(xiàn)CPE，傳代后未出現(xiàn)CPE，亦沒有檢測出血凝價。BEI滅活濃度為0.001mol/L時，滅活24h可檢出CPE，傳代后亦出現(xiàn)CPE，且均檢測出血凝價；滅活48h以上時，樣品均未出CPE，傳代后未出現(xiàn)CPE，亦沒有檢測出血凝價。BEI滅活濃度為0.000 5mol/L時，滅活時間為24h和48h時均可檢出CPE，傳代后亦出現(xiàn)CPE，且均檢測出血凝價。為了確保疫苗制備過程的滅活效果，同時提高制備效率，確定水貂腸炎細小病毒的滅活條件為BEI終濃度為0.002mol/L、滅活時間24h、滅活溫度30℃，滅活完畢加入BEI使用量10%的1mol/L硫代硫酸鈉中和BEI。結果見表1。

2.2 疫苗的制備結果

制備的疫苗呈粉紅色均勻混懸液，靜置后，上層為粉紅色澄清液體，下層為淡粉紅色沉淀，搖勻后呈均勻混懸液。經無菌檢驗，符合規(guī)定。

表1 BEI滅活MEVB試驗滅活檢驗結果Table 1 The inactivation effect of binary ethylenimine on mink enteritis virus

2.3 疫苗安全試驗結果

制備的疫苗接種水貂，觀察10d，水貂5/5均健活，未發(fā)現(xiàn)任何體溫、精神、食欲與糞便異常，亦未發(fā)現(xiàn)局部異常反應。

2.4 疫苗效力試驗結果

表2 BEI與甲醛滅活MEVB制備疫苗免疫效果對比Table 2 Comparison of immune efficacy of BEI-inactivated and formaldehyde-inactivated MEV vaccine

從疫苗效力試驗結果來看，BEI滅活疫苗和甲醛滅活疫苗均達到效苗保護抗體（HI=1∶32）水平之上，BEI滅活疫苗較甲醛滅活疫苗免疫后平均抗體水平高，但經統(tǒng)計比較，差異不顯著（P＞0.05)。

3 討論

甲醛作為疫苗滅活劑目前仍被廣泛應用，主要通過對病毒蛋白羧基端發(fā)生作用，從而使病毒失活，雖有滅活病毒快速、徹底等優(yōu)點，但它屬于致癌物，可能會給動物造成潛在的應激風險。甲醛的滅活過程會使部分病毒蛋白結構破壞，從而可能會降低疫苗的免疫原性。BEI屬氮丙啶（Aziridine）類化合物，是由2-溴乙胺氫溴酸鹽（2-Aminoethyl bromide hydrobromide，BEA）在堿性環(huán)境下環(huán)化而成。BEI作為核酸滅活劑，通過干擾核酸代謝，破壞病毒核酸達到滅活病毒的目的，而不影響其蛋白質成分。本試驗采用BEI對水貂腸炎細小病毒進行滅活試驗，旨在找到一種安全、有效的替代甲醛的滅活水貂腸炎細小病毒的滅活劑。試驗結果表明，BEI在一定濃度下，能有效滅活水貂腸炎細小病毒，隨著BEI的濃度升高，滅活能力越強，所需的滅活時間越短；BEI終濃度為0.002mol/L、滅活時間24h是水貂腸炎細小病毒適宜的滅活參數；使用該參數制備的疫苗進行了安全和免疫效力試驗，安全試驗結果表明，BEI滅活的疫苗對水貂安全；從效力試驗的結果可以看出，BEI滅活的疫苗較甲醛滅活疫苗HI抗體水平略高，這可能與BEI滅活時不影響蛋白成分，最大程度保留了病毒的免疫原性有關。本試驗的結果證明，BEI滅活制備的水貂腸炎細小病毒疫苗對水貂安全，免疫效果良好，其誘導產生抗體的能力優(yōu)于傳統(tǒng)的甲醛滅活疫苗。