頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測和鑒定蜈蚣的揮發(fā)性成分

周柏松，楊娜，王亞茹，李雅萌，劉金平，李平亞

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021）

蜈蚣（Scolopendra）為蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L.Koch）的干燥體，又名百足蟲、千足蟲、金頭蜈蚣、百腳，是名貴的傳統(tǒng)中藥材，在我國有著歷史悠久的臨床應(yīng)用，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，距今已有2000多年歷史，性味辛、溫，有毒，歸肝經(jīng)，功能主治息風(fēng)鎮(zhèn)痙、功毒散結(jié)、通絡(luò)止痛。臨床用于小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)口歪、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、瘡瘍、瘰疬、毒蛇咬傷等[1]。蜈蚣具有多種加工炮制方法，主要分為加輔料和不加輔料兩大類，不加輔料的方法有生用、炒炙、烘焙、煨等，加輔料方法包括酒炙、油炙、醋炙、姜炙、蔥汁炙、薄荷葉煨等。研究表明，加輔料的炮制方法有助于去除蜈蚣的腥臭味，減少對胃腸道的刺激，而且有殺菌解毒的作用，具體選擇哪種炮制方法應(yīng)視病癥而定[2～4]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，蜈蚣中主要的化學(xué)物質(zhì)是蛋白質(zhì)和組織胺類，還含有酶、糖類、脂肪酸、膽甾醇、蟻酸及組氨酸、精氨酸、亮氨酸等多種氨基酸[5～8]，此外還含F(xiàn)e、Zn、Mn、Ca、Mg 等多種微量元素[9]。蛋白多肽類物質(zhì)是蜈蚣的主要活性成分，這類蛋白多肽不僅來自于蜈蚣體內(nèi)，在蜈蚣毒素中也含有多種[10]。研究表明，蜈蚣具有抗血栓[11]、抗菌[12]、抗腫瘤[13]、鎮(zhèn)痛[14]、抗炎[15]、免疫功能調(diào)節(jié)[16]等生物活性。目前，對蜈蚣的研究主要集中在蜈蚣體內(nèi)及毒素中的蛋白多肽類、小分子環(huán)肽類以及多糖類物質(zhì)，未見對其揮發(fā)性成分的研究報道。本試驗首次采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)檢測蜈蚣的揮發(fā)性成分，為中藥蜈蚣的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

蜈蚣藥材由吉林金寶藥業(yè)股份有限公司提供，由吉林大學(xué)李平亞教授鑒定為動物少棘巨蜈蚣（S.subspinipes mutilans L.Koch）的干燥體。

1.2 儀器

固相微萃取裝置、PDMS/DVB萃取纖維頭（涂層厚度65m）（美國Supelco公司）；5975-6890N氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，美國Agilent公司）；FA1104N型電子分析平（上海菁華科技儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 揮發(fā)性成分的提取

取蜈蚣樣品1g，放入20mL頂空瓶中，密封。利用固相微萃取針萃取60min，萃取溫度60℃，解析溫度260℃，解析時間2min。

2.2 GC-MS分析條件

2.2.1 GC分析條件 色譜柱：氣相毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25m）；程序升溫：起始溫度60℃，保持3min，以10℃/min升溫到280℃；進(jìn)樣口溫度：260℃；載氣：He（純度 99.99%）；柱流量：1.0mL/min；不分流進(jìn)樣。

2.2.2 MS分析條件 電子電離源（EI）；電子轟擊能量70eV；離子源溫度230℃；采集模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 20～600；掃描速度150u/s。

3 結(jié)果

按照上述實驗方法和儀器分析條件進(jìn)行實驗，HPMSD化學(xué)工作站給出蜈蚣揮發(fā)性成分總離子流圖（圖1）；對總離子流圖中的各吸收峰進(jìn)行質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖，經(jīng)過質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索、核對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖以及結(jié)合Kovats指數(shù)法對所檢出化合物進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法確定各成分的相對含量，結(jié)果見表1。

圖1 蜈蚣揮發(fā)性成分總離子流Fig.1 Total Ion current chromatogram of volatile components of scolopendra

表1 蜈蚣揮發(fā)性成分的GC-MS分析Tab.1 Analysis of volatile components from scolopendra by GC-MS

續(xù)表1

續(xù)表1

通過HS-SPME-GC-MS分析方法對中藥蜈蚣的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，所得總離子流圖包含53個吸收峰，通過質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索、核對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖以及結(jié)合Kovats指數(shù)法對所檢出化合物進(jìn)行定性分析，共鑒定出50個化合物，通過峰面積歸一化法可知所鑒定化合物的含量占揮發(fā)性成分的95.03%，其中包括萜類化合物17種（33.52%）、有機(jī)酸類化合物5種（28.70%）、芳香族化合物5種（12.56%）、雜環(huán)衍生物6種（8.39%）、醛酮類化合物8種（8.25%）、脂肪烴4種（1.46%）、含硫化合物2種（1.50%）、其他類化合物2種（0.65%）。

研究結(jié)果顯示，萜類化合物是蜈蚣揮發(fā)性成分中主要的活性成分，從蜈蚣的揮發(fā)性成分中共鑒定出17種萜類化合物，占總揮發(fā)性成分含量的33.52%，是蜈蚣揮發(fā)性成分中含量最高的一類化合物，其中以-姜黃烯（11.70%）-蒎烯（8.83%）、-甜沒藥烯（1.73%）、1 ，6 ，7-Cadina-4，9-diene（1.72%）、-倍半水芹烯（1.54%）、（R）-樟腦（1.38%）相對含量較高，除（R）-樟腦以外，其余均為倍半萜烯類化合物。

4 討論

首次采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對中藥蜈蚣的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，該技術(shù)是一種快速、高效、綠色的分析方法，其中，頂空固相微萃取法與傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法相比具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、操作簡單等優(yōu)點，對樣品選擇性高、重現(xiàn)性好，適合與大型分析儀器聯(lián)用[17]。

蜈蚣的揮發(fā)性成分中含有萜類化合物、醛酮類化合物、芳香族化合物、雜環(huán)衍生物等多類具有特殊氣味的物質(zhì)，故蜈蚣藥材具有刺鼻腥臭氣味；揮發(fā)性成分中主要為萜類化合物，有研究表明，萜類化合物具有多種生物活性，如其中含量最高的-姜黃烯（11.70%）具有多種抗腫瘤活性[18～20]，-倍半水芹烯（1.54%）具有抗病毒、抗生育和抗?jié)兊壬锘钚訹21]，（R）-樟腦（1.38%）具有鎮(zhèn)痛作用[22]等，研究表明，萜烯類化合物還具有殺蟲[23]、抗菌[24]、抗病毒[25]、抗氧化[26]、抗炎[27]等生物活性。通過對蜈蚣揮發(fā)性成分的研究，為蜈蚣藥用價值的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù)。