鄰苯二甲酸酯的微生物降解研究進(jìn)展

樊雙虎 李叢勝 任思竹 付亞娟 喬潔 侯曉強(qiáng)

摘 要：鄰苯二甲酸酯（Phthalic Acid Esters，PAEs）的廣泛應(yīng)用引起了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，其環(huán)境雌激素效應(yīng)和“三致”毒性直接威脅生態(tài)環(huán)境安全及人體健康。該文總結(jié)了PAEs的污染及毒性以及PAEs高效降解菌、細(xì)菌對(duì)PAEs的降解途徑，探討了PAEs降解菌在環(huán)境修復(fù)中的問(wèn)題并提出了應(yīng)對(duì)措施，為PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)未來(lái)發(fā)展方向提供參考。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯;微生物降解;代謝途徑;生物修復(fù)

中圖分類號(hào) X131? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）18-0024-05

鄰苯二甲酸酯（Phthalic Acid Esters，PAEs）又名酞酸酯，是一類主要由人工合成的有機(jī)化合物，常見(jiàn)的PAEs及代謝產(chǎn)物如表1所示。PAEs被廣泛用作塑化劑及其他化工產(chǎn)品中的添加劑，在土壤、水體、空氣等環(huán)境中廣泛分布，成為普遍的環(huán)境污染物之一。PAEs在環(huán)境中自然降解極其緩慢，屬于典型的持久性有機(jī)污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs），且具有環(huán)境雌激素效應(yīng)、“三致效應(yīng)”（致突變、致畸、致癌），被稱為第2個(gè)“PCB”類的污染物。鑒于PAEs的嚴(yán)重污染和生物毒理效應(yīng)，目前PAEs污染及修復(fù)途徑受到全球關(guān)注。

1 PAEs的污染及危害

工業(yè)生產(chǎn)中，PAEs被用作工業(yè)溶劑、化工產(chǎn)品的添加劑、塑化劑，如農(nóng)藥、地膜、油漆中的添加劑或塑料制品中的塑化劑[1]。塑化劑是PAEs的主要用途，PAEs也是使用量最大的塑化劑。PAEs與聚烯烴類塑料基質(zhì)以氫鍵或范德華力等非共價(jià)鍵相互作用，在塑料的生產(chǎn)、使用及廢棄處理過(guò)程中，PAEs從塑料中滲漏到環(huán)境中[2]，對(duì)空氣、水體、土壤、食品等造成嚴(yán)重污染。環(huán)境中的PAEs污染主要是DBP和DEHP?？諝庵械腜AEs主要來(lái)源于塑料、油漆、家具等含有PAEs材料的物質(zhì)揮發(fā)，受人類生產(chǎn)、生活活動(dòng)的影響較大。通常情況下，城市中心空氣中的PAEs濃度高于郊區(qū)，室內(nèi)高于室外[3，4]?？諝庵械腜AEs濃度還受到環(huán)境溫度等因素的影響，在印度賴布爾，春季和冬季大氣中PAEs的濃度高于夏季，可能與夏季降雨和較強(qiáng)的光化學(xué)反應(yīng)有關(guān)[5]。河流及沉積物中的PAEs有多種來(lái)源，包含攜帶空氣中PAEs的雨水、PAEs污染的工業(yè)和生活污水、垃圾滲濾液等，目前全球的很多河流及沉積物中都存在PAEs，且DEHP濃度遠(yuǎn)高于環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)限定值（Environmental risk limits，ERLs）（0.19μg/L）。在很多國(guó)家和地區(qū)的飲用水中也檢測(cè)到了PAEs，長(zhǎng)期暴露于飲用水的PAEs將嚴(yán)重影響人體健康。土壤中的PAEs污染主要來(lái)源于水體中PAEs的聚集、大氣中PAEs的沉積、污水灌溉、污染的堆肥、農(nóng)藥和化肥的施用等。農(nóng)田土壤中的PAEs含量高于非耕作土壤，表明農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)是導(dǎo)致農(nóng)田PAEs污染的主要途徑，溫室大棚薄膜、農(nóng)田地膜、農(nóng)藥和化肥等含有PAEs的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料的使用是農(nóng)田PAEs污染的主要來(lái)源[6]。由此可見(jiàn)，PAEs在自然環(huán)境中廣泛分布、大量累積，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境安全及動(dòng)植物健康。

人體通過(guò)飲用水、空氣、食品等途徑直接暴露于PAEs，人體每天通過(guò)食物攝取的DEHP約有25?g[7]。PAEs還能通過(guò)水體、土壤被植物吸收，進(jìn)入食物鏈，最終遷移到人體內(nèi)。此外，個(gè)人護(hù)理用品、化妝品和玩具也是人體攝取PAEs的重要途徑。PAEs 是一類環(huán)境雌激素，能與細(xì)胞核受體、激素或異源物質(zhì)的受體等相互作用，進(jìn)而干擾生物體的生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育等生理過(guò)程，還具有致突變、致畸和致癌的毒理效應(yīng)。美國(guó)將DMP、DEP、DBP、DEHP、DOP、BBP列為優(yōu)先控制的有毒污染物，我國(guó)將DMP、DBP和DEHP確定為優(yōu)先控制污染物。目前關(guān)于DEHP毒理效應(yīng)的研究較多，尤其是生殖毒性、遺傳毒性、肝臟毒性及致癌的研究。DEHP能造成大鼠類固醇生成減少、胚胎睪丸中的生殖細(xì)胞缺失、性別分化異常、精子畸形率增加和精液體積減少[8]。大量研究表明，DEHP能導(dǎo)致大鼠和小鼠的肝臟癌變，但對(duì)于人的肝癌和DEHP暴露的關(guān)系還缺乏流行病學(xué)的證據(jù)[9]。DEHP還是男童生殖發(fā)育障礙及內(nèi)分泌異常的重要原因[10]。DEHP可干擾昆蟲(chóng)的熱休克基因表達(dá)，高濃度DEHP作為蛻皮激素受體（Ecdysone Receptor，EcR）表達(dá)的拮抗劑，影響昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育[11]。DEHP也影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程，如造成洋蔥根尖細(xì)胞后期染色體分離失敗、有絲分裂指數(shù)下降[12]，影響蠶豆微核發(fā)生率和DNA多態(tài)性，引起蠶豆幼苗急性氧化損傷和遺傳毒性效應(yīng)[13]。DEHP的代謝產(chǎn)物MEHP比DEHP的毒性更強(qiáng)，能影響炎癥系統(tǒng)[14]、誘導(dǎo)精子中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高和DNA損傷，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。相關(guān)研究表明，DEHP或其代謝產(chǎn)物的毒性都是通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號(hào)通路來(lái)介導(dǎo)的，改變基因表達(dá)，最終表現(xiàn)為生理毒性[16]。DEHP和MEHP能結(jié)合PPAR的3個(gè)亞型（PPARα、PPARβ和PPARγ）并調(diào)節(jié)其活性[17]。

2 PAEs的降解微生物

PAEs側(cè)鏈基團(tuán)決定了PAEs的種類，隨著側(cè)鏈基團(tuán)的增大，PAEs的辛醇—水分配系數(shù)的對(duì)數(shù)值（lgKow）也增大，表明側(cè)鏈越長(zhǎng)，PAEs的疏水性越強(qiáng)，越難被降解。除了PAEs的分子結(jié)構(gòu)，PAEs的降解速率還與溫度、光照、pH等環(huán)境因素有關(guān)。自然條件下PAEs能進(jìn)行非生物降解，如光化學(xué)降解和水解。然而，非生物降解速率極慢，DBP和DEHP的非生物降解的半衰期分別可達(dá)50～360d和390～1600d[18]。非生物降解通常不能將PAEs徹底礦化，可能生成毒性更高的中間產(chǎn)物，如MEHP或其他自由基。PAEs的生物降解由一系列酶促反應(yīng)來(lái)完成，降解速率快，能徹底礦化PAEs，不產(chǎn)生二次污染，是一種環(huán)境友好型的降解途徑。目前已報(bào)道一些細(xì)菌、真菌、藻類都可以降解PAEs，其中以細(xì)菌為主。Aspergillus parasiticus、Fusarium subglutinans和Penicillium funiculosum等真菌可以將血漿袋子的DEHP完全降解[19]，DEHP誘導(dǎo)Fusarium culmorum產(chǎn)生8種酯酶異構(gòu)體，這些酯酶可能參與DEHP降解的不同階段，將DEHP徹底礦化[20]。Aspergillus niger能將DMP降解為MMP、PA和PCA，并最終將DMP礦化[21]。微藻Chlorella pyrenoidosa降解DMP的效率受到無(wú)機(jī)碳的影響，無(wú)機(jī)碳初始濃度提高會(huì)顯著促進(jìn)DMP的降解[22]，另一種微藻Closterium lunula降解DMP的情況與此相似[23]。

目前已從農(nóng)田土壤、工業(yè)污水、活性污泥等環(huán)境樣品中分離到許多能降解PAEs的細(xì)菌，這些細(xì)菌主要來(lái)自于Sphingomonas[24]、Gordonia[25，26]、Rhodococcus[27]、Arthrobacter[28]、Bacillus[29]等菌屬（表2）。細(xì)菌對(duì)PAEs的降解程度反映了其降解性能及環(huán)境修復(fù)應(yīng)用潛力，大多數(shù)細(xì)菌能完全礦化PAEs，但有些細(xì)菌只能將PAEs降解為鄰苯二甲酸單酯或PA。Acinetobacter sp. strain M673能依次水解DBP、DEP、DHP、DEHP、DOP等多種PAEs的2個(gè)酯鍵，生成相應(yīng)的單酯、PA，但是不能在含PAEs或PA的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，即不能以PAEs或PA作為唯一碳源和能源，可能是由于菌株M673缺少降解PA的功能基因[30]。Camelimonas sp.M11與菌株M673相似，能水解DBP、DEP、DPeP等PAEs，生成相應(yīng)的單酯，但不能在含PAEs單酯及PA的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明單酯是PAEs降解的終產(chǎn)物[31]。Rhodococcus jostii RHA1能水解DMP、DEP、DPrP、DBP、DHP和DEHP，依次生成對(duì)應(yīng)的單酯、PA，能在含MMP、MBP、MHP、MEHP及PA的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但是在含大多數(shù)PAEs的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。這表明PAEs可能會(huì)抑制PA的代謝過(guò)程，導(dǎo)致在PAEs存在時(shí)PA不能繼續(xù)降解，無(wú)法為菌株RHA1提供能量[32]。這些細(xì)菌能將PAEs轉(zhuǎn)化為毒性較小的PA，在環(huán)境修復(fù)中發(fā)揮重要作用，也可與其他菌株協(xié)同作用將PAEs徹底降解。Gordonia sp.JDC-2可以將DOP降解為PA，PA作為終產(chǎn)物進(jìn)行累積[33]。Arthrobacter sp.JDC-32不能降解DOP，但是可以將PA代謝。將這2種菌株共培養(yǎng)，菌株間通過(guò)協(xié)同作用可將DOP徹底降解。

細(xì)菌降解環(huán)境污染物的底物譜范圍、降解速率、環(huán)境適應(yīng)性等也反映了其環(huán)境修復(fù)的潛力。PAEs污染的環(huán)境通常較復(fù)雜，如存在多種PAEs、過(guò)酸或過(guò)堿，使得微生物修復(fù)PAEs污染更加困難。在實(shí)驗(yàn)室條件下，目前報(bào)道的PAEs降解菌大都能降解多種PAEs，在較寬的溫度或pH范圍內(nèi)可以高效降解PAEs。本實(shí)驗(yàn)室分離純化的Mycobacterium sp.YC-RL4能在20～50℃、pH6.0～10.0條件下高效降解多種PAEs（DEHP、DBP、DEP、DMP、DCHP）[39]。Rhodococcus ruber YC-YT1在pH4.0～10.0、10～50℃和1～120g/L NaCl條件下都能快速降解PAEs，其降解底物包括DMP、DEP、DPrP、DBP、DPeP、DHP、DHpP、DEHP、DOP、DNP、DDP、DCHP和BBP[40]。分離自活性污泥的Rhodococcus pyridinivorans XB能以DMP、DEP、DBP、DEHP、PA和原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）等作為唯一碳源，在48h內(nèi)降解98%的DEHP（200mg/L），在5d內(nèi)降解98%的DMP、DEP、DBP（800mg/L）[37]。從垃圾填埋場(chǎng)土壤分離的PAEs降解菌Agromyces sp. MT-O能利用DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP，在7d內(nèi)將1000mg/L的DEHP降解80%[41]。目前雖然在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了這些PAEs降解菌的優(yōu)越的降解能力和環(huán)境適應(yīng)能力，但自然環(huán)境的復(fù)雜性對(duì)菌株的環(huán)境修復(fù)應(yīng)用提出了較大的挑戰(zhàn)。

3 PAEs的降解途徑

在有氧或厭氧條件下，細(xì)菌可通過(guò)一系列酶催化PAEs降解。細(xì)菌對(duì)PAEs的有氧降解速率高于厭氧降解速率，目前分離篩選的PAEs降解菌主要是有氧降解菌。PAEs的有氧降解受到微生物種類及溫度、pH等環(huán)境因素的影響，其他共代謝的碳源也可促進(jìn)PAEs降解，而高濃度PAEs或中間代謝產(chǎn)物可抑制PAEs降解[42-43]。PAEs的有氧或厭氧降解過(guò)程大致可分為2個(gè)階段：PAEs水解以及PA開(kāi)環(huán)、礦化。PAEs的疏水性強(qiáng)，側(cè)鏈越長(zhǎng)，疏水性越強(qiáng)，水解反應(yīng)越困難，酯鍵水解是其降解過(guò)程中最重要的步驟，也是降解的限速步驟。PAEs的2個(gè)酯鍵通常由2個(gè)不同的水解酶依次作用進(jìn)行水解[44]，但也有報(bào)道1個(gè)酯酶具有水解PAEs2個(gè)酯鍵的功能[45]。在水解酶的作用下，PAEs的2個(gè)酯鍵依次斷裂，生成單酯、PA。這是PAEs的有氧或厭氧降解的共同起始步驟，大多數(shù)細(xì)菌以此方式起始PAEs降解過(guò)程。目前也發(fā)現(xiàn)了PAEs的其他降解途徑，如有的細(xì)菌將DEP、DMP直接水解為PA，此過(guò)程中沒(méi)有單酯生成[46];還有一些PAEs如DOP，帶有較長(zhǎng)側(cè)鏈，在起始降解過(guò)程中，Gordonia sp.JDC-2先進(jìn)行β-氧化，將PAEs的側(cè)鏈逐次移除1個(gè)-CH2-基團(tuán)，生成的DEP通過(guò)轉(zhuǎn)酯、脫酯反應(yīng)降解為PA[33];在降解DEP過(guò)程中，Sphingobium yanoikuyae SHJ進(jìn)行轉(zhuǎn)酯或脫甲基反應(yīng)，將DEP轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸乙基甲基酯（ethyl methyl phthalate，EMP），EMP水解為MEP，MEP經(jīng)轉(zhuǎn)酯或脫甲基反應(yīng)生成MMP[47]，MMP再水解為PA。

PA是芳香族化合物共同的中心代謝產(chǎn)物，細(xì)菌在有氧或厭氧條件下都可降解PA，但代謝途徑有所差異。在有氧條件下，在pht基因簇的作用下，PA經(jīng)過(guò)加氧、脫氫、脫羧，轉(zhuǎn)化為PCA。PCA也是芳香族化合物共同的中心代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)鄰位裂解途徑（ortho-cleavage pathway）或間位裂解途徑（meta-cleavage pathway），代謝產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)，PCA被礦化。pht基因簇一般以操縱子結(jié)構(gòu)存在，革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的pht基因簇的基因種類、數(shù)目等有所差異。革蘭氏陽(yáng)性菌的pht基因簇由phtB、phtAa、phtAb、phtAc、phtAd、phtC、phtR組成，分別編碼3，4-二氫-3，4-二羥基鄰苯二甲酸脫氫酶、鄰苯二甲酸3，4-雙加氧酶大亞基、鄰苯二甲酸3，4-雙加氧酶小亞基、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶、3，4-二羥基鄰苯二甲酸脫羧酶、調(diào)控蛋白。phtAaAbAcAd編碼的雙加氧酶復(fù)合體起始PA的代謝過(guò)程，催化PA加氧，生成3，4-二氫-3，4-二羥基鄰苯二甲酸。phtB編碼的脫氫酶催化3，4-二氫-3，4-二羥基鄰苯二甲酸，生成3，4-二羥基鄰苯二甲酸，后者在phtC的作用下，脫羧生成PCA。首次報(bào)道的pht基因簇來(lái)自Arthrobacter keyseri 12B，其遺傳機(jī)制的研究較為透徹[48]。菌株12B的pht操縱子位于質(zhì)粒上，以phtBAaAbAcAdCR排列，Gordonia sp.YC-JH1[44]和Gordonia sp.HS-NH1[49]中的pht操縱子也以此方式排列，而Terrabacter sp.DBF63中的pht基因簇以phtAaAbBAcAdCR排列[50]。Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的pht基因簇缺少編碼3，4-二羥基鄰苯二甲酸脫羧酶的基因phtC[51]，不能催化3，4-二羥基鄰苯二甲酸生成PCA，整個(gè)基因簇以phtRAaAbBAcAd形式存在。革蘭氏陰性菌的PA代謝過(guò)程與革蘭氏陽(yáng)性菌相似，但是PA加氧酶為鄰苯二甲酸4，5-雙加氧酶。pht基因簇由pht1、pht2、pht3、pht4、pht5組成，分別編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鄰苯二甲酸4，5-雙加氧酶還原酶、鄰苯二甲酸4，5-雙加氧酶、4，5-二氫-4，5-二羥鄰基苯二甲酸脫氫酶、4，5-二羥基鄰苯二甲酸脫羧酶，在這些酶的作用下，PA轉(zhuǎn)化為PCA。Burkholderia cepacia DBO1中的pht基因簇由pht2、pht15和pht34轉(zhuǎn)錄單位組成[52]，Pseudomonas putida NMH102-2中的pht基因簇形成操縱子pht12345[53]。PAEs的厭氧降解研究較少，在厭氧條件下，PAEs酯鍵依次水解生成PA，PA脫羧轉(zhuǎn)化為苯甲酸（benzoic acid，BA），BA加氫、加氧后開(kāi)環(huán)，生成CO2、H2和乙酸，乙酸最后轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物甲烷[54]。

4 討論與展望

PAEs是應(yīng)用廣泛、使用量大的化工原料，也是污染嚴(yán)重、毒性較強(qiáng)、降解困難的環(huán)境污染物。目前有大量的PAEs降解菌從環(huán)境樣品中分離獲得，也克隆了PAEs降解基因，為PAEs污染環(huán)境的生物修復(fù)提供了寶貴的菌株資源和基因資源。然而，PAEs降解菌或降解基因在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用還很少，究其原因有以下幾個(gè)方面：（1）PAEs污染環(huán)境的環(huán)境因素較復(fù)雜，如多種有機(jī)污染物、重金屬、酸性或堿性較強(qiáng)，這些都會(huì)影響PAEs降解菌的生存和降解功能的發(fā)揮;（2）實(shí)際環(huán)境中的PAEs濃度較低，通常在mg/L的水平以下，比實(shí)驗(yàn)室條件下研究的菌株降解PAEs的濃度低很多，因此環(huán)境中低濃度的PAEs可能無(wú)法激活菌株中PAEs降解基因的表達(dá);（3）PAEs水解酶及其他降解酶的催化機(jī)制研究較少，缺少分子改造的理論基礎(chǔ)，從而也限制了環(huán)境修復(fù)的應(yīng)用。在今后的研究中，應(yīng)從PAEs降解菌株及降解酶的環(huán)境適應(yīng)性的角度去深入研究，并結(jié)合工程學(xué)的方法，將降解菌和降解酶應(yīng)用到PAEs污染環(huán)境的修復(fù)中。

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（責(zé)編：徐世紅）