不同加力時間下靜止期牙周病大鼠牙槽骨骨微結構的變化

周芳 趙常紅 李子夏 曾輝 黃碩

1. 西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，陜西 西安 710075 2. 西北師范大學體育學院，甘肅 蘭州 730030

流行病學調查[1]顯示牙周病是我國成年人喪失牙齒的首要原因，因為牙槽骨炎性吸收破壞，牙齒支持能力下降而無法行使正常的咀嚼功能。不僅影響日常生活，更重要的是，由于缺乏力的刺激從而造成牙槽骨廢用性骨損傷，加速了骨量丟失，進入惡性循環(huán)。正畸治療是目前牙周病綜合治療的重要方法之一[2]，有學者[3]認為正畸治療可以從根本上解除牙周病的致病因素，牙周病患者正畸治療后牙槽骨密度一致[4]。但臨床上不是所有的牙周病患者接受正畸治療都可以獲得很好的治療效果，有學者[5-6]發(fā)現(xiàn)部分牙周病患者在正畸治療過程中會出現(xiàn)牙齒松動、牙槽骨形態(tài)異常，這可能是由于患者處于靜止狀態(tài)的牙周炎癥被激活，出現(xiàn)了類似于骨質疏松患者骨骼加速吸收的情況。因此，如何使牙周病患者獲得更加理想的治療效果成為臨床研究的難題。本研究模擬對牙周病患者進行牙周-正畸聯(lián)合治療的真實微環(huán)境，建立靜止期牙周病動物模型并對其牙齒加力，觀察不同加力時間下動物模型牙槽骨骨微結構的變化，以期為牙周病患者的正畸治療提供更多理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：篩選28周齡SD雄性大鼠156只(SPF級)，平均體重(330±25.4)g，購自空軍軍醫(yī)大學動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(陜)2014-002，實驗動物使用許可證：SCXK(陜)2014-001。

1.1.2器械與設備：眼科剪、線剪、平鑷、持針器、自制牙周刮治器、彈力橡皮鏈、結扎絲、Bruker Skyscan Micro-CT系統(tǒng)(型號：1176)。

1.2 方法

1.2.1建立動物模型：大鼠在清潔安靜的環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組和實驗組，對照組50只，實驗組106只。將實驗組大鼠麻醉后仰臥固定，絲線結扎上頜右側第一磨牙牙頸部，壓入齦下，隔天檢查。與此同時，對照組不作任何處理，置于同樣飼養(yǎng)環(huán)境下自由食水。6周后檢查實驗組大鼠牙周袋探診深度和牙周探診出血情況以評價牙周狀況，隨機處死3只大鼠制作牙周組織切片，HE染色觀察以確定牙周病動物模型建立成功。再次麻醉實驗組大鼠，去除結扎絲，行牙周改良切口，翻瓣，刮除炎性組織，修整袋內壁，生理鹽水沖洗，下肢肌肉注射抗生素3 d。術后4周檢查大鼠牙周袋探診深度和牙周探診出血情況以評價牙周狀況，隨機處死3只大鼠制作牙周組織切片，HE染色觀察以確定靜止期牙周病動物模型建立成功[7]。

1.2.2動物模型牙齒加力：隨機將實驗組分為牙周治療組和牙周+正畸治療組，用直徑0.2 mm的不銹鋼結扎絲環(huán)繞牙周+正畸治療組動物模型上頜右側切牙及第一磨牙牙頸部，結扎絲置于牙齦上，釉質粘接劑粘結固定以防止結扎絲脫落。結扎絲之間通過彈力橡皮鏈加力，力值為50 g,見圖1。隔天檢查，如加力裝置脫落或固位不佳，則重新安裝。牙周治療組不做處理，置于同樣飼養(yǎng)環(huán)境下自由食水。

圖1 動物模型牙齒加力示意圖Fig.1 Force diagram in teeth of animal model

1.2.3取材：各組分別于加力后0、7、14、21、28 d各處死 10只大鼠，取其右側上頜骨，剔除軟組織，無菌生理鹽水沖洗，多聚甲醛固定7 d。

1.2.4Micro-CT掃描：采用Bruker Skyscan Micro-CT系統(tǒng)掃描，電壓80 kV，電流310 μA，分辨率18 μm，掃描結束后采用DataViewer軟件對掃描所獲影像進行三維重建。

1.2.5骨微結構測量：選取的牙槽骨感興趣區(qū)域(ROI)為上頜右側第一磨牙根分叉處向根尖方向，邊長為650 μm的立方體骨區(qū)域,見圖2。使用CT-Analyser軟件進行測量，測量指標包括：骨密度(bone mineral density, BMD)為ROI內總礦物質密度，骨體積分數(shù)(BV/TV)為ROI內骨小梁體積除以樣本體積，骨小梁數(shù)量(Tb·N)為ROI內骨組織與非骨組織的交點數(shù)量，骨小梁分離距離(Tb·Sp)為ROI內骨小梁之間的髓腔平均寬度，骨小梁厚度(Tb·Th)為ROI內骨小梁的平均厚度。

圖2 感興趣區(qū)域示意圖Fig.2 Schematic diagram of the region of interest

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Graphpad prism8.0.2軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并制圖，多樣本間的比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物模型建立

建模6周，動物模型牙齦腫脹，呈暗紅色，牙齦緣出現(xiàn)組織壞死，探診出血。建模10周(即牙周治療后4周)，動物模型牙齦萎縮，探診不出血，探診深度較建模6周減小。HE染色觀察，建模6周，動物模型牙周纖維排列紊亂，牙槽骨可見破骨細胞及吸收陷窩。建模10周，動物模型牙周組織可見牙槽骨遺留吸收陷窩，少量炎癥細胞侵潤，膠原纖維修復。見圖3。

圖3 動物模型牙周組織反應(HE×40)注：A:建模6周；B：建模10周。黑色箭頭處顯示骨吸收陷窩。Fig.3 Periodontal tissue response of animal model (HE×40)

2.2 不同加力時間下各組大鼠牙槽骨骨微結構的差異

加力0、7、14、21、28 d，牙周治療組和牙周+正畸治療組大鼠右側上頜第一磨牙牙槽骨BMD、BV/TV、Tb·Th均較對照組降低，Tb·N、Tb·Sp均較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義。加力14 d，相較牙周治療組，牙周+正畸治療組大鼠右側上頜第一磨牙牙槽骨BMD、BV/TV、Tb·Th降低，Tb·N、Tb·Sp升高，差異有統(tǒng)計學意義。加力28 d，相較牙周治療組，牙周+正畸治療組大鼠右側上頜第一磨牙牙槽骨BV/TV升高, Tb·N、Tb·Sp降低，差異有統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 各組大鼠牙槽骨骨微結構的變化(*P<0.05)Fig.4 Changes of bone microstructures in alveolar bone in each group(*P<0.05)注：A:骨密度；B:骨體積分數(shù)；C:骨小梁數(shù)量；D:骨小梁分離距離；E:骨小梁厚度。

2.3 不同加力時間下牙周+正畸治療組大鼠牙槽骨骨微結構的變化

加力14 d時，牙周+正畸治療組大鼠右側上頜第一磨牙牙槽骨BMD、BV/TV、Tb·Th降至最低，Tb·N、Tb·Sp升至最高，但至28 d時各項指標已恢復至未加力時狀態(tài)。見圖5。

圖5 牙周+正畸治療組大鼠牙槽骨感興趣區(qū)域三維圖像Fig.5 Three-dimensional image of the interest region in alveolar bone of rats in the periodontal and orthodontic treatment group注：A: 加力0 d; B加力7 d; C：加力14 d; D：加力21 d; E：加力28 d。

3 討論

牙槽骨是人體最容易出現(xiàn)骨質疏松的部位之一，牙槽骨骨密度除了受代謝情況的影響外，還受牙周疾病、牙齒應力等局部因素的影響。牙周病患者的牙周膜面積減小，牙周支持組織喪失，牙槽骨密度低于牙周健康人群的骨密度[8]，加之肌肉力量的不平衡導致前牙唇向傾斜。傳統(tǒng)的牙周治療方法效果不佳，越來越多的牙周病患者選擇正畸治療，牙周-正畸聯(lián)合治療已成為近年來口腔臨床醫(yī)學研究的新熱點。

正畸治療是依據(jù)牙槽骨受到力的刺激會發(fā)生改建這一經(jīng)典理論對牙齒進行移動，牙槽骨會根據(jù)壓力或張力的不同，產(chǎn)生相應的吸收和增生現(xiàn)象[9]，對牙周病患者進行正畸治療的前提是其牙槽骨吸收不超過1/2，且必須處于牙周病靜止期，牙周組織炎癥得到控制的前提下才能夠進行[10]。但是即便如此，在臨床治療中也經(jīng)常會出現(xiàn)靜止期牙周病患者在正畸治療過程中牙齒松動度增加，附著喪失加重，以及牙槽骨高度和密度降低等現(xiàn)象。有學者[11]認為正畸治療可能在一定程度上加速了牙周病的進展，而且下頜牙槽骨對正畸治療的反應更為敏感。本研究發(fā)現(xiàn)，在加力0、7、14、21、28 d時，靜止期牙周病動物模型右側上頜第一磨牙牙槽骨BMD、BV/TV、Tb·Th與對照組相比均降低，Tb·N、Tb·Sp與對照組相比升高，說明牙周病致使動物模型牙槽骨骨密度降低、骨微結構被破壞，出現(xiàn)了骨質疏松樣癥狀，而且即便經(jīng)過治療，牙周病處于靜止期，骨質疏松樣癥狀仍然存在。骨質疏松會加重牙周疾病的癥狀，牙周病患者又由于咬合不利使得牙槽骨機械應力刺激減少，骨量逐漸流失，二者相互作用，惡性循環(huán)，成為影響口腔健康的重要因素。因此，對此類患者如何治療是一個非常值得研究的課題。

與牙周病大鼠牙槽骨改建的最活躍時期為加力后第7天[12]不同的是，靜止期牙周病動物模型右側上頜第一磨牙在受力14 d時牙槽骨BMD、BV/TV、Tb·Th降至最低，Tb·N、Tb·Sp升至最高，說明此時骨吸收最活躍，這可能是由于牙周組織的狀態(tài)不同，對正畸力的敏感性有差別導致的。牙周組織中相關骨改建細胞對力學刺激的反應有個“閾值”，超過“閾值”下限，細胞才會應答[13]，由此可見，靜止期牙周病動物模型牙周組織中相關骨改建細胞對力學刺激反應的“閾值”升高了，致使其對力學刺激的反應較炎癥狀態(tài)時變得緩慢。

本研究發(fā)現(xiàn)牙周+正畸治療組動物模型右側上頜第一磨牙牙槽骨在受力第14天時骨吸收最活躍，BMD、BV/TV、Tb·Th均較牙周治療組降低，Tb·N、Tb·Sp均較牙周治療組升高，但至28 d時牙槽骨各項骨微結構指標已恢復至未加力時狀態(tài)，分析原因可能是與本研究使用彈力橡皮鏈作為加力材料有關。橡皮鏈彈性好，加力效果明顯，且價格便宜，故在臨床使用廣泛，但存在力值衰減的問題，24 h內力值衰減明顯，加力2周后力值為初始力值的67%，加力4周后力值較加力2周減少約10%[15]。以往有研究[14]表明，力的刺激是骨改建和生長的重要因素，力學刺激的特性決定了骨或軟骨的形成，較小的張力能誘導成骨細胞的分化。本研究中橡皮鏈的初始力值為50 g，力量較輕，后期力量衰減后則更輕，不足以為牙齒移動提供持續(xù)力量，使得動物模型牙齒移動距離小，但也因此讓牙槽骨獲得了修復的機會。在加力28 d時，牙周+正畸治療組動物模型牙槽骨BV/TV較牙周治療組升高，Tb·N、Tb·Sp較牙周治療組降低，說明對于沒有炎癥的牙槽骨骨質疏松患者，較小的力值刺激有利于其牙槽骨的修復。

4 結論

靜止期牙周病動物模型牙槽骨骨質疏松，對力學刺激的反應變得緩慢。在突然受力后，牙槽骨以吸收為主，但隨著加力裝置力量的減小和力值的穩(wěn)定，牙槽骨開始修復，可逐漸恢復到加力前的狀況。相比只治療牙周炎癥的方法，配合較小的力值刺激有利于靜止期牙周病動物模型牙槽骨的修復。