淫羊藿苷納米微粒對大鼠成骨細胞成熟與礦化的影響

葸慧榮 高玉海 陳克明 馬慧萍

1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050； 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

骨質(zhì)疏松是目前危害老年人身體健康的一種全身性骨骼疾病，其特點是骨量減少、骨密度降低、骨脆性增加，容易導(dǎo)致骨折[1]。因此，抗骨質(zhì)疏松藥物的研發(fā)已成為當(dāng)今社會的主要課題，特別是從天然中草藥中提取有效成分已成為抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)的熱點。淫羊藿苷為中藥淫羊藿的主要有效成分，是目前抗骨質(zhì)疏松癥常用的天然藥物有效成分之一[2]。淫羊藿苷屬于異黃酮類化合物，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，具有口服吸收差，生物利用度低等特點[3]。因此，我們對淫羊藿苷進行劑型改造，制備成了新型納米混懸制劑，從而提高淫羊藿苷的水溶性和生物利用度。

本實驗以自制的淫羊藿苷納米微粒處理成骨細胞。通過檢測成骨細胞中堿性磷酸酶活性，鈣化結(jié)節(jié)染色面積和顏色以及相關(guān)成骨性蛋白的表達量變化，觀察淫羊藿苷納米微粒對成骨細胞礦化和成熟的影響，從而初步評價淫羊藿苷納米微粒的生物利用度是否得到有效提高。

1 材料和方法

1.1 材料

自制淫羊藿苷納米微粒；出生48 h以內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠[甘肅省蘭州市聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院動物實驗科，動物合格證號：SYXK(軍)2016-0029，動物級別為SPF級]。淫羊藿苷(陜西省寶雞市辰光生物科技有限公司)；DMSO、胰蛋白酶(Sigma公司)；β-actin、Ⅰ型膠原(COLⅠ)、Runx-2、OSX、BMP-2、OPG、RANKL一抗均購自Abcam公司；胎牛血清(蘭州民海生物工程公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Cell sig納米微粒Ling公司)；α-MEM培養(yǎng)基粉劑(美國Gibco公司)；Hochest 3342/PI(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白水平測定試劑盒[上海碧云天(Beyotime)生物技術(shù)有限公司]；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(武漢博士德公司)；淫羊藿苷納米微粒(實驗室自制)。

1.2 實驗儀器

倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀和酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)；H1650-W臺式微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司，中國)；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司，美國)；超凈工作臺(北京半導(dǎo)體一廠，北京)。

1.3 實驗方法

1.3.1淫羊藿苷納米微粒的制備方法

稱取處方量淫羊藿苷原料藥溶于1 mL二甲基亞砜溶液中作為油相；取適量的穩(wěn)定劑分散于20 mL蒸餾水中作為水相；使用超聲細胞破碎儀超聲并高速剪切水相，超聲過程中將油相緩慢勻速注入水相中，同時用冰水浴冷卻，即得淫羊藿苷納米微粒。

1.3.2大鼠顱骨原代成骨細胞的培養(yǎng)

取出生48 h內(nèi)的Wistar大鼠脫頸處死，經(jīng)酒精浸泡消毒處理后，于滅菌過的超凈工作臺中解剖乳鼠取出整個顱骨，剔除周圍軟骨組織，用PBS漂洗3～5次，將其全部搗碎裝于EP管中；加入適量胰酶消化細胞，8～10 min后棄去上清液并重復(fù)上述過程3次；再次漂洗后加入0.1%Ⅱ型膠原酶，于37 ℃恒溫水浴條件下消化細胞4次，每次15 min，棄去第一次收集的上清液，收集后3次消化液合并，加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化；將收集的細胞懸液經(jīng)細胞篩過濾兩次，濾液以1 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞團塊，并連續(xù)吹打至分散均勻，接種于中號培養(yǎng)皿中于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1.3.3淫羊藿苷納米混懸液對成骨細胞形態(tài)的影響

培養(yǎng)成骨細胞，待細胞狀態(tài)良好且鋪滿皿底時，將細胞分為3組，分別為對照組(1×10-6mol/L DMSO)，淫羊藿苷組(1×10-6mol/L 淫羊藿苷溶液)、淫羊藿苷納米微粒組(1×10-6mol/L 淫羊藿苷納米微粒溶液)，加上述藥物處理細胞12、24 h后，觀察不同時間點藥物對細胞形態(tài)的影響。

1.3.4Hoechst 3342/PI 雙染色檢測細胞毒性

細胞樣品的制備：培養(yǎng)成骨細胞至鋪滿皿底，分別加藥處理24 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，加入1 mL細胞染色緩沖液、5 μL Hoechst 染色液和5 μL PI 染色液冰浴或 4 ℃ 染色30 min。染色后經(jīng) PBS 洗滌一次，在熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.3.5堿性磷酸酶(ALP)活性測定

將培養(yǎng)的第一代細胞接種于三個中號培養(yǎng)皿中，每3 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞鋪滿皿底且狀態(tài)良好時加入成骨細胞誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d和6 d后，分別用堿性磷酸酶檢測試劑盒(按說明書操作)檢測細胞內(nèi)ALP的水平。

1.3.6茜蘇紅鈣化結(jié)節(jié)染色

取P1代培養(yǎng)的成骨細胞分別進行加藥處理，同時加入適量的成骨性誘導(dǎo)液進行誘導(dǎo)，每隔3 d換一次培養(yǎng)基，第12 d后棄掉培養(yǎng)基，用PBS漂洗兩遍，加入2 mL 4%多聚甲醛固定10 min，棄去多聚甲醛再用PBS漂洗兩次。向培養(yǎng)皿中加入適量0.1%的茜素紅染色液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置30～45 min，待培養(yǎng)皿中逐漸出現(xiàn)深紅色斑點時，棄去茜蘇紅染液，去離子水漂洗2次，于顯微鏡下拍照取圖，觀察染色后鈣化結(jié)節(jié)區(qū)域的面積。

1.3.7成骨特異性蛋白表達量的檢測

棄掉加藥處理過的成骨細胞培養(yǎng)液， PBS緩沖液漂洗兩次，加入300 μL的細胞裂解液RIPA，待細胞充分裂解后收集裂解液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將上述收集的細胞裂解液于離心機中以12 000 r/min離心30 min，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量。取適量蛋白經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上用封閉液封閉。分別加入 1∶1 000 稀釋的一抗4 ℃過夜，次日分別加入1∶5 000 稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 h，TBST 漂洗后，ECL 顯色，結(jié)果用圖像分析軟件Image Proplus 6.0分析灰度值，比較各組細胞中不同蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 加藥處理后細胞形態(tài)變化

加藥處理12 h時，將細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察，各組細胞貼壁生長，呈三角形、紡錘形或多角形等形態(tài)正常，但細胞數(shù)目稀少(如圖1)；加藥處理24 h后，各組細胞數(shù)目明顯增多，而形態(tài)無明顯變化。初步表明淫羊藿苷納米微粒對成骨細胞形態(tài)無顯著影響。

圖1 藥物處理對成骨細胞形態(tài)的影響(上排：加藥12 h；下排：加藥24 h) (20×)Fig.1 Effect of drug treatment on the morphology of osteoblasts (upper row: 12 hour; lower row: 24 hour; 20×)

2.2 Hoechst 3342/PI 雙染色檢測細胞毒性

圖2所示，對照組細胞呈正常狀態(tài)，淫羊藿苷組和淫羊藿苷納米微粒組成骨細胞調(diào)亡或壞死的數(shù)量增多，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 Hoechst 3342/PI 雙染色檢測細胞毒性結(jié)果 (20×)Fig.2 Cytotoxicity results of Hoechst 3342/PI double staining (20×)

圖3 不同時間點成骨細胞中ALP活性測定結(jié)果(n=3)注： 與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與ICA組相比，#P<0.05。Fig.3 ALP activity assay results of osteoblasts at different time points (n=3)

2.3 堿性磷酸酶活性測定結(jié)果

由圖3所示，加藥處理第3 d時，與對照組比較，淫羊藿苷組和淫羊藿苷納米微粒組的ALP 活性均升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；加藥第6 d時， 淫羊藿苷組ALP 活性顯著高于對照組(P<0.05)，淫羊藿苷納米微粒組ALP活性極顯著高于對照組(P<0.01)，且顯著高于淫羊藿苷組(P<0.05)，表明將淫羊藿苷制備成納米微粒后，其促進成骨細胞分化的能力顯著增強。

2.4 茜蘇紅鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果

由圖4可知，對照組鈣化結(jié)節(jié)呈淡紅色，數(shù)量最少、面積最??；淫羊藿苷組呈橘紅色，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加、面積增大；淫羊藿苷納米微粒組呈深橘紅色，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量最多、面積最大，表明將淫羊藿苷制備成納米微粒后，其促進成骨細胞礦化的能力顯著增強。

圖4 藥物處理后鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果 (20×)Fig.4 Calcified nodules stained by Alizarin red after 12 days of drug treatment (20×)

2.5 成骨特異性蛋白表達量的檢測結(jié)果

由于淫羊藿苷納米微粒能顯著增加成骨細胞ALP活性，促進成骨細胞的礦化成熟，表明淫羊藿苷納米微粒應(yīng)通過增加成骨細胞活性來促進生長期大鼠骨量的。于是我們檢測了成骨細胞中Runx-2、OSX、CoL1α2和BMP-2等成骨特異性蛋白表達量的變化，結(jié)果顯示這些蛋白的表達水平均顯著增加，且淫羊藿苷納米微粒組顯著高于淫羊藿苷組(圖5、6)。

3 討論

大量研究已經(jīng)表明，淫羊藿苷能夠促進體外成骨細胞的成熟與礦化，同時抑制破骨細胞的骨吸收并誘導(dǎo)其凋亡[4]。Hsieh等[5]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷劑量依賴性地提高成骨細胞的增殖與礦化成熟。馬小妮等[6]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以上調(diào)OPG/RANKL的比值，從而抑制破骨細胞發(fā)生及其骨吸收活性。以上研究結(jié)果表明，淫羊藿苷能夠促進體外成骨細胞的骨形成、抑制骨吸收，具有潛在的、良好的臨床應(yīng)用價值。

圖5 通過Western印跡檢測成骨特異性蛋白表達量結(jié)果注：與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.5 Protein expression of osteogenic proteins as assessed with Western blotting

圖6 成骨性特異性蛋白表達的量化結(jié)果(n=3)Fig.6 Quantitative results of relative expression of osteogenic proteins(n=3)

本研究以自制的淫羊藿苷納米微粒為評估對象，考察其對體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細胞成熟與礦化的影響，并與淫羊藿苷原料藥相比較，從細胞水平上評價該遞釋系統(tǒng)是否可提高淫羊藿苷的生物利用度。

實驗首先檢測了淫羊藿苷納米微粒對大鼠成骨細胞形態(tài)的影響，經(jīng)加藥處理細胞24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化情況。結(jié)果顯示，淫羊藿苷納米微粒組細胞狀態(tài)與對照組和淫羊藿苷組相比無明顯變化，初步表明淫羊藿苷納米微粒對成骨細胞無明顯不良反應(yīng)。實驗進一步用Hoechst 3342/PI雙染色法在熒光顯微鏡下觀察淫羊藿苷納米微粒對細胞凋亡和壞死的影響情況，由Hoechst 3342/PI染色原理可知，當(dāng)細胞凋亡或壞死時，細胞染色質(zhì)固縮，Hoechst 3342 染料穿透細胞膜，在熒光顯微鏡下觀察細胞呈亮藍色；同時由碘化丙啶 (PI)染色原理可知，弱紅色細胞為凋亡細胞，強紅色細胞為壞死細胞[7]。由上述染色結(jié)果顯示淫羊藿苷納米微粒組亮藍色、亮紅色或弱紅色細胞數(shù)量雖然較多，但與對照組和淫羊藿苷原料藥組比較無明顯差異，再次表明淫羊藿苷納米微粒溶液對成骨細胞均無明顯的不良反應(yīng)。

堿性磷酸酶活性是成骨性分化的早期指標(biāo)之一，其數(shù)量和活性在成骨細胞的骨形成過程中直接影響骨形成能力[8]。而成骨細胞分化的最終結(jié)果是礦化成熟，因此，檢測成骨細胞中鈣鹽沉積量可揭示細胞礦化的進度和程度。該實驗中堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定時間內(nèi)淫羊藿苷納米微粒可顯著提高成細胞中ALP活性，同時可增加鈣鹽沉積量，且效果顯著高于淫羊藿苷原料藥，表明淫羊藿苷納米微粒能顯著促進成骨細胞的分化和礦化。

為了進一步證明上述結(jié)果，實驗還檢測了與成骨性相關(guān)的部分蛋白水平變化情況。OSX是一種成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子，能促進前成骨細胞分化為成熟的細胞[9]；BMP-2為骨形態(tài)發(fā)生蛋白，是促進骨形成和誘導(dǎo)骨細胞分化最重要的細胞外信號分子之一[10]。Runx-2在成骨細胞分化、成熟中也發(fā)揮重要作用，參與骨形成的早期階段[11]。淫羊藿苷納米微粒處理細胞24 h后，OSX、Runx-2、BMP-2等蛋白表達量較淫羊藿苷組明顯提高。OPG/RANKL 的比值決定了破骨細胞的命運，比值降低則骨吸收增強，比值升高則骨吸收降低[12]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，淫羊藿苷納米微粒顯著提高了 OPG的表達量，而對 RANKL 表達無顯著影響，即淫羊藿苷納米微粒組 OPG/RANKL比值顯著高于對照組，表明淫羊藿苷納米微粒是通過促進骨形成和抑制骨吸收雙重作用來調(diào)節(jié)骨代謝的。

以上實驗表明，淫羊藿苷納米微粒可能是通過促進ALP活性，增大鈣化結(jié)節(jié)面積，增加OSX、Runx-2、COL1α2、BMP-2等的蛋白表達量來促進成骨細胞的骨形成活性，且淫羊藿苷納米微粒的上述作用均強于淫羊藿苷原料藥，表明將淫羊藿苷原料藥制備為納米混懸液后， 其促進骨形成的活性明顯提高了。其機理可能為：淫羊藿苷納米微粒作為一種新型藥物遞釋系統(tǒng)，具有粒徑小、載藥量高、黏附力強，且其載體本身易附著于細胞表面并與膜融合，進入細胞內(nèi)部的效率更高，使細胞內(nèi)部藥物濃度較淫羊藿苷普通溶液提高，從而發(fā)揮了更高的藥效。這表明淫羊藿苷納米微?？赏蔀榭构琴|(zhì)疏松癥的新劑型，但其是否應(yīng)用于臨床還有待進一步研究。