間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢效應(yīng)的研究進(jìn)展*

胡嘯天鄧志欽段莉李文翠王大平*

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種多能干細(xì)胞，其來(lái)源為中胚層和外胚層，具有易于體外分離培養(yǎng)、造血支持、多分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、旁分泌效應(yīng)等多種優(yōu)點(diǎn)。因此，MSCs被認(rèn)為是一種理想的種子細(xì)胞來(lái)源，可以治療多種疾病，從而被廣泛應(yīng)用于組織工程、免疫治療、干細(xì)胞移植等多個(gè)研究領(lǐng)域。但是很多研究表明，植入的外源性MSCs在靶向組織中檢出率很低，從而影響了其治療效果。因此，提高M(jìn)SCs歸巢率成為其治療疾病、獲得良好療效的關(guān)鍵，為此需要進(jìn)一步地明確MSCs的歸巢機(jī)制。

1 MSCs歸巢的定義

1983年，Gallatin等[1]首次將血源性淋巴細(xì)胞選擇性進(jìn)入二級(jí)淋巴器官這一過(guò)程稱為“淋巴細(xì)胞歸巢”，此后“歸巢”這一概念被引申至多種干細(xì)胞。2002年，Saito等[2]首次提出MSCs具有歸巢特性，當(dāng)機(jī)體組織受到刺激時(shí)，體內(nèi)部分MSCs被“喚醒”，從而歸巢到損傷部位進(jìn)行分化，以替代受損細(xì)胞。2009年，Karp等[3]建議將“MSCs歸巢”定義為“MSCs在靶組織的脈管系統(tǒng)里被捕獲，隨后跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至靶組織的過(guò)程”。

2 MSCs的歸巢機(jī)制

許多研究指出，MSCs的歸巢效應(yīng)所涉及的物質(zhì)與白細(xì)胞向炎癥組織歸巢的效應(yīng)十分相似。如Ann De Becker等[4]提出MSCs在治療各類疾病時(shí)，表現(xiàn)出了牢固的黏附、爬行、擴(kuò)散和跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的過(guò)程，并且在該過(guò)程中趨化因子CXCL9、CXCL16、CCL20和CCL25的表達(dá)都有顯著增強(qiáng)。盡管白細(xì)胞的歸巢機(jī)制已被研究得較為清楚，但是MSCs歸巢的具體機(jī)制仍不明確。不過(guò)令人欣慰的是，一些分子已被證實(shí)參與了MSCs的歸巢?，F(xiàn)將參與MSCs歸巢過(guò)程的相關(guān)分子及其機(jī)制介紹如下。

2.1 MSCs的動(dòng)員及遷移

許多研究表明，趨化因子及其受體操控著MSCs歸巢的動(dòng)員和遷移。目前研究最多的趨化因子為SDF-1（基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1），又稱CXCL12。同時(shí)，其研究最深入的受體為CXCR4。SDF-1/CXCR4軸的主要功能之一是調(diào)節(jié)前體細(xì)胞的移植、趨化及歸巢至損傷部位，是介導(dǎo)MSCs遷移分布的關(guān)鍵信號(hào)[5]。Jin等[6]通過(guò)缺氧預(yù)處理MSCs，使其上CXCR4過(guò)表達(dá)，相比未經(jīng)處理的MSCs，其在小鼠肝臟損傷模型中的歸巢能力更強(qiáng)且相比對(duì)照組能更好地促進(jìn)腎臟功能恢復(fù)。此外，Sohni等[7]還發(fā)現(xiàn)了hMSCs上其他能表達(dá)趨化功能的趨化因子受體，如CCR1-4、CCR7、CCR9、CXCR6等。但是相比這些受體的趨化因子，SDF-1具有最強(qiáng)的趨化能力。因此，SDF-1/CXCR4軸仍然是目前MSCs趨化研究領(lǐng)域最大的熱點(diǎn)。

2.2 MSCs黏附內(nèi)皮

MSCs歸巢完成動(dòng)員和遷移后，MSCs開(kāi)始向毛細(xì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞黏附，這時(shí)就需要MSCs表達(dá)細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的黏附分子配體相結(jié)合，介導(dǎo)該過(guò)程。目前所發(fā)現(xiàn)的有關(guān)MSCs黏附內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子主要為整合素和選擇素。其中一種整合素為VLA-4，它表達(dá)于約50%的人MSCs上。同時(shí)整合素細(xì)胞血管黏附因子1（VCAM-1）是VLA-4的配體，其主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞上，兩者構(gòu)成了VLA-4/VCAM-1軸。而Dykstra等[8]采用巖藻糖基化的方法增加MSCs上E-選擇素的表達(dá)，可以增加移植的MSCs的歸巢。Chi等[9]也發(fā)現(xiàn)在MSCs表面固定P選擇素配體后，更利于流動(dòng)的MSCs的捕獲和黏附。此外，在hMSCs上還有多種黏附分子（如細(xì)胞間細(xì)胞黏附分子l、內(nèi)皮因子等）存在不同程度的表達(dá)，但它們與MSCs的內(nèi)皮黏附乃至歸巢的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。但可以肯定的是，黏附分子是MSCs完成歸巢過(guò)程中不可缺少的成分。

2.3 MSCs穿越內(nèi)皮

在MSCs完成歸巢動(dòng)員及黏附內(nèi)皮后，想要發(fā)揮其治療作用，仍需從血液循環(huán)中遷移出來(lái)，從而進(jìn)入損傷部位。而穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞是其主要途徑。在此過(guò)程中各種趨化因子、金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）發(fā)揮著重要作用。許多研究表明，在組織受損后，趨化因子不僅能誘導(dǎo)MSCs沿血管內(nèi)皮滾動(dòng)而到達(dá)靶組織附近，并且能介導(dǎo)其向靶組織方向穿越血管內(nèi)皮。當(dāng)組織受損后，大量趨化因子如MCP-1、MIP-1等富集在受損區(qū)域，它們與MSCs上相應(yīng)受體（如CCR2、CCR3等）結(jié)合，促進(jìn)MSCs穿越血管內(nèi)皮[10]。由于MSCs體積較大但偽足運(yùn)動(dòng)能力偏弱，單純依靠趨化因子誘導(dǎo)其穿越內(nèi)皮難度較大。因此有研究還發(fā)現(xiàn)，MMP和FN也在MSCs穿越內(nèi)皮過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。研究證明，MMP可以分解基底膜來(lái)提高血管通透性，從而幫助MSCs越過(guò)血管內(nèi)皮。王俊等[11]發(fā)現(xiàn)促進(jìn)骨髓MSCs表達(dá)MMP-2和MMP-9可以使其獲得更強(qiáng)的遷移能力。而FN則能增強(qiáng)MSCs向血管內(nèi)皮深部黏附。Clements等[12]發(fā)現(xiàn)FN暴露的V區(qū)是MSCs上VLA-4的一個(gè)結(jié)合點(diǎn)，它們結(jié)合后使MSCs能夠黏附到血管內(nèi)皮外，從而進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)（見(jiàn)圖1、表1）。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢大體路線圖

表1 間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢各步驟參與分子

3 提高M(jìn)SCs歸巢率的策略

3.1 增強(qiáng)MSCs響應(yīng)歸巢刺激的能力

3.1.1 應(yīng)用相關(guān)化合物

當(dāng)使用MSCs治療時(shí)加入相關(guān)化合物可以觸發(fā)信號(hào)通路，使參與細(xì)胞運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵介質(zhì)表達(dá)。Li等[13]在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將HMG-CoA還原酶抑制劑與MSCs聯(lián)用可以提高其表面CXCR4的表達(dá)，有效增加MSCs移植后心肌梗死周圍MSCs的數(shù)量。Najafi等[14]發(fā)現(xiàn)MSCs用去鐵胺處理后使細(xì)胞表面的CXCR4、CCR7表達(dá)增加，并且HIF-1蛋白、MMP-2和MMP-9的活性相比未結(jié)合去鐵胺的MSCs也顯著增加。而且在體內(nèi)/外遷移中，用去鐵胺處理的MSCs的遷移率較對(duì)照組顯著增高。其原因是去鐵胺可穩(wěn)定HIF-1的含量并提高其活性，從而增加其所涉及的細(xì)胞遷移的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

3.1.2 低氧預(yù)處理

現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)，將MSCs短期暴露于缺氧條件下可能會(huì)誘導(dǎo)參與細(xì)胞遷移的一些基因表達(dá)，如CXCR4、CXCR7、CX3CR1和SDF1a。周治來(lái)等[15]發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)處理大鼠臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)其遷移至脊髓損傷區(qū)域加速修復(fù)。Antebi等[16]也證實(shí)了短期生理性缺氧可增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果。Ho等[17]證實(shí)低氧預(yù)處理后的MSCs相比空氣對(duì)照組加速了節(jié)段性骨缺損的修復(fù)。

3.1.3 培養(yǎng)預(yù)處理

為了研究MSCs的遷移活性是否可以通過(guò)添加趨化因子或生長(zhǎng)因子的預(yù)處理來(lái)影響，Lejmi等[18]用趨化因子MIP-1和MIP-3對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)這兩種趨化因子能夠在體外增加MSCs的遷移。Hengartner等[19]在用IL-1體外刺激MSC時(shí)，發(fā)現(xiàn)IL-1是調(diào)節(jié)MMP1和免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵介質(zhì)，并且IL-1介導(dǎo)的MMP1表達(dá)的上調(diào)可能促進(jìn)了MSCs的內(nèi)源募集或移植的MSCs的體內(nèi)遷移。

3.1.4 基因修飾

已有大量研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CXCR4可以趨化MSCs歸巢的瞬時(shí)啟動(dòng)并且增加MSCs的運(yùn)動(dòng)性。體外培養(yǎng)的MSCs上的CXCR4表達(dá)率低，因此直接移植未經(jīng)處理的MSCs，其歸巢效果相對(duì)而言差。既往通常采用病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CXCR4基因的方法來(lái)加強(qiáng)MSCs對(duì)SDF-1的敏感度。Wang等[20]通過(guò)超聲微氣泡聯(lián)合脂質(zhì)體包被轉(zhuǎn)染CXCR4到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，與傳統(tǒng)的病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，該方法具有更高的轉(zhuǎn)染效率，且Transwell實(shí)驗(yàn)表明該方法轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移能力與對(duì)照組相比提高了9倍。

3.1.5 糖工程學(xué)

細(xì)胞遷移涉及一系列事件，這些事件是由靶組織流動(dòng)的內(nèi)皮細(xì)胞之間的抗剪切黏附分子相互作用引起的。其中，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素在此步驟中起關(guān)鍵作用。E-選擇素是結(jié)合了特定糖類序列的凝集素，其上含有a-2,3-甲硅烷基。然而E-選擇素的配體在造血干細(xì)胞中表達(dá)，而MSCs不表達(dá)E-選擇素的配體。但是MSCs表達(dá)的一個(gè)CD44糖型含有a-2,3-甲硅烷基。因此在特定酶條件下的糖轉(zhuǎn)移的應(yīng)用程序后，MSCs上的天然CD44的糖型被轉(zhuǎn)換為E-選擇素的配體，并且不會(huì)對(duì)細(xì)胞活力和潛力造成影響。這個(gè)配體也被稱作HCELL[21]。

肖飛等[22]證明CD44分子的體外巖藻糖基化修飾能顯著加強(qiáng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢能力，這可能是通過(guò)SDF-1、MCP-1的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外Blocki等[23]設(shè)計(jì)了一種微囊，這種微囊包括了低濃度的瓊脂糖、細(xì)胞外基質(zhì)、膠原纖維蛋白等。在該微囊的保護(hù)下，MSCs可以長(zhǎng)期存活和增殖且微囊本身的降解不會(huì)引起體內(nèi)的不良反應(yīng)。

雖然我們已經(jīng)引入了一些策略來(lái)提高M(jìn)SCs響應(yīng)歸巢刺激的能力，但體外擴(kuò)增和一些操作可能會(huì)改變細(xì)胞的一些特性，如其增殖能力、分化潛能和遺傳穩(wěn)定性。這可能會(huì)對(duì)其臨床安全產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，一些學(xué)者更傾向于調(diào)節(jié)目標(biāo)位點(diǎn)，來(lái)設(shè)計(jì)一種更有吸引力的環(huán)境來(lái)增強(qiáng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的招募。這些策略被認(rèn)為比基于干細(xì)胞本身的策略更為有效。

3.2 提高靶部位對(duì)MSCs的吸引力

在組織損傷后，受損細(xì)胞中SDF-1的表達(dá)增加，繼而通過(guò)SDF-1濃度梯度的趨化吸引來(lái)完成損傷部位干細(xì)胞的招募和保留。然而，由于SDF-1增加的自然現(xiàn)象似乎不足以使病變完全再生和修復(fù)，因此正在尋求更全面的方法來(lái)增強(qiáng)MSCs對(duì)損傷組織/器官的趨化作用，討論如下。

3.2.1 趨化因子編碼基因直接轉(zhuǎn)染靶組織

超聲靶向微泡破壞（ultrasound targeted microbubble destruction，UTMD）是一種非侵入性和選擇性的基因傳遞方法。在一項(xiàng)研究中，通過(guò)UTMD方法處理MSCs并植入大鼠的心肌梗死模型中，可以增加MSCs的遷移率，并且發(fā)現(xiàn)缺血心肌中SDF-1的表達(dá)增加，且MSCs表面CXCR4的表達(dá)增加，表明UTMD可能通過(guò)SDF-1/CXCR4軸輔助MSCs歸巢[24]。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)（Ⅰ期）中，17名患者接受了心肌內(nèi)膜注射JVS-100。JVS-100是編碼SDF-1的DNA質(zhì)粒。治療12個(gè)月后，結(jié)果顯示接受注射的患者生活質(zhì)量有所改善[25]。

3.2.2 支架材料在靶組織中的應(yīng)用

由各種生物材料控制釋放趨化因子可以增強(qiáng)MSCs向它們的募集。有學(xué)者提出可注射水凝膠，如CHGP-HEC，是通過(guò)募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原位軟骨組織再生的好選擇[26]。此外，明膠水凝膠、PLGA支架（聚乳酸聚乙醇酸共聚物）以及聚乙二醇水凝膠也被用來(lái)實(shí)現(xiàn)MSCs的招募。Chen等設(shè)計(jì)了一類D型氨基酸自組裝肽納米水凝膠支架，其不僅具有良好的生物活性、生物相容性和生物穩(wěn)定性，還能夠促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）的增殖和遷移[27]。在另外一些研究中，3D支架材料被學(xué)者寄予厚望。3D打印是一種強(qiáng)大的技術(shù)，通過(guò)逐層沉積細(xì)胞加載的生物相容性墨水，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)預(yù)先制定，可重復(fù)且準(zhǔn)確地形成具有幾何形狀的組織狀結(jié)構(gòu)[28]。已有文章提出，基因激活的生物油墨與MSCs結(jié)合可以幫助其擴(kuò)散[29]。而Cunniffe等[30]已成功將MSCs與由RGD-照射的海藻酸鹽和納米透明質(zhì)酸制成的基因激活生物油墨結(jié)合，其復(fù)合的質(zhì)粒DNA表達(dá)BMP2和TGF 3。而Chung等[31]考慮到患者特異性移植物替代節(jié)段性骨修復(fù)的需要，制作了3D打印的PLLA模板，其孔隙度和孔徑大小與天然組織相似，在hMSC動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下具有良好的生物相容性，和對(duì)生理相關(guān)的機(jī)械載荷的響應(yīng)。因此，這種移植物替代物被認(rèn)為有利于在患者的臨界尺寸骨缺損矯正中進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

3.2.3 電場(chǎng)的應(yīng)用

Guangping等[32]發(fā)現(xiàn)，電場(chǎng)激活多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如PI3K/PTEN，KCNJ15/Kir4.2的膜通道，這些途徑可以涉及MSCs的定向遷移。如今，Zhao等[33]應(yīng)用ETC（電場(chǎng)定向芯片）完成了在一個(gè)高通量篩選電場(chǎng)平臺(tái)上的定向細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，能夠識(shí)別所選細(xì)胞類型的電場(chǎng)敏感范圍，促進(jìn)其細(xì)胞的遷移。并且，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)ES（電刺激）或者PEMF（脈沖電磁場(chǎng)）處理過(guò)的MSCs具有更強(qiáng)的成骨分化能力[34]。

盡管電場(chǎng)應(yīng)用在體內(nèi)難以得到優(yōu)化，但是對(duì)人體是安全的，因此在用于細(xì)胞治療時(shí)可以對(duì)損傷組織帶來(lái)更直接的細(xì)胞歸巢而沒(méi)有其他損害。

3.3 植入途徑的選擇

目前，移植MSCs的途徑主要有3種，分別為靜脈注射、動(dòng)脈注射及局部注射。Idriss等[35]分別采用靜脈和脾內(nèi)注射MSCs治療肝纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射是更合適、更有效的治療路徑。而在MSCs治療結(jié)腸炎的研究中，Wang等[36]發(fā)現(xiàn)腹腔注射是MSCs的最佳給藥途徑，通過(guò)此途徑給藥的MSCs表現(xiàn)出更高的細(xì)胞遷移率。但是Goncalves等[37]發(fā)現(xiàn)，在治療結(jié)腸炎時(shí)靜脈注射比腹膜內(nèi)注射效果更好，這種不一致可能歸因于MSCs的類型不同，不同的MSC的增殖率和分化的能力，以及在細(xì)胞因子分泌蛋白質(zhì)和趨化因子受體表達(dá)的顯著差異都有可能影響遷移。所以，在解釋研究結(jié)果和選擇具體的臨床應(yīng)用時(shí)，應(yīng)系統(tǒng)地考慮不同來(lái)源MSCs的生物學(xué)差異。因此，相關(guān)研究雖然已報(bào)道了各個(gè)植入方式的優(yōu)缺點(diǎn)，但仍未統(tǒng)一出何種途徑最適宜植入MSCs。這也是未來(lái)需要研究的方向之一。

4 小結(jié)與展望

MSCs的歸巢率直接決定了其治療效果，因此只有保證了在治療中有一個(gè)可觀的歸巢率，才能保證其療效。許多趨化因子、黏附分子等與MSCs歸巢直接或間接相關(guān)，因此各國(guó)學(xué)者已經(jīng)做了巨大努力來(lái)利用趨化因子配體/受體軸瞄準(zhǔn)靶組織/器官，以增強(qiáng)MSCs定向遷移至損傷部位的能力。盡管在基于細(xì)胞的這些策略上取得了初步成功，但這些策略要么費(fèi)用高昂，要么存在一定安全問(wèn)題，在臨床上難以推廣和應(yīng)用。為了解決這些問(wèn)題，研究者們將目光轉(zhuǎn)向基于靶組織的策略。使用支架材料、電場(chǎng)等技術(shù)雖然更安全、更吸引人，但仍需研究者們做更深入的研究來(lái)提高其最終的效率。而現(xiàn)今最束縛研究者們開(kāi)展深入研究的困難便是MSCs的歸巢機(jī)制尚不明確。只有更加充分地了解MSCs的歸巢體系，對(duì)其過(guò)程中的每一個(gè)步驟、每一個(gè)參與分子及每一種影響因素都做到心中有數(shù)，才能從根本上提高M(jìn)SCs的歸巢率，使其在細(xì)胞治療領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，造福全人類。