明膠-羥基磷灰石與明膠-硅羥基磷灰石成骨作用的比較研究*

劉娟 孟國(guó)龍 姚瑞娟 何靜 吳方*

天然骨是由有機(jī)膠原纖維和以納米羥基磷灰石為主的無機(jī)成分組成的。無機(jī)成分中還含有微量元素或離子，如硅、鍶、鋅等，在骨的形成和發(fā)育過程中起著重要的作用[1-2]。Thian等[3]的研究表明，硅涂層鈦的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量明顯高于未涂層鈦，2.2 wt%的硅含量可能是提高HA生物活性的最佳摻量。Zhao等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，硅摻雜的Ti O2納米管能顯著增強(qiáng)小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）的成骨相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明微量元素硅能夠改善材料的生物活性。

在骨組織工程中，以靜電紡絲為基礎(chǔ)制備有機(jī)和無機(jī)復(fù)合材料，在結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然骨。筆者采用靜電紡絲法合成了明膠-HA和明膠-SiHA纖維膜的復(fù)合材料，其具有高孔隙率、類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）材料的纖維結(jié)構(gòu)。研究表明，靜電紡絲的纖維形態(tài)，包括纖維直徑和纖維取向可以直接影響細(xì)胞行為[5-6]。除此之外，很多生長(zhǎng)因子也能包裹在紡絲纖維的網(wǎng)格中，從而影響細(xì)胞行為[7-8]。郭瑞征等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)納米羥基磷灰石礦化的明膠靜電紡絲，可促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖及向成骨方向分化，且礦化時(shí)間越長(zhǎng)，效果越明顯。

在純HA、鈦、氧化鈦等無機(jī)材料表面，大量研究表明硅顯著提高了HA表面生物活性，而在無機(jī)和有機(jī)復(fù)合的仿生礦化材料上研究硅影響HA表面生物活性機(jī)理的較少。因此，本文主要研究微量元素硅對(duì)明膠-HA纖維復(fù)合材料表面礦化行為的影響以及其提高復(fù)合材料生物活性的機(jī)理;采用更接近體內(nèi)環(huán)境的方式，共培養(yǎng)小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（RAW264.7）的條件下，研究硅的摻入對(duì)明膠-HA復(fù)合材料表面細(xì)胞的增殖、鋪展及成骨、破骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

電子天平（Excelence plus xp，梅特勒-托利多有限公司）;磁力恒溫?cái)嚢杵鳎?5-2型，上海司樂儀器有限公司）;注射泵（TS2-60，保定蘭格恒流泵有限公司）;高壓靜電發(fā)生器（DW-P503-2ACCD，天津動(dòng)員高壓電源廠）;注射器（10 mL，四川康寧醫(yī)用器材有限公司）;加熱器（KHNFJ39PTC，康佳集團(tuán)股份有限公司）;掃描電子顯微鏡（日本株式會(huì)社日立制作所，F(xiàn)ESEM，S4800）。

材料制備所需試劑均為分析純和化學(xué)純（成都市科龍化工試劑廠）;明膠（220LB，羅賽洛廣州明膠有限公司）;碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS，貝斯特試劑有限公司）;模擬體液（自制，×1.2倍）;小鼠前顱骨細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，MC3T3-E1）;小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RAW264.7）;胎牛血清（FBS，HyClone，Thermo Fisher Scientific Inc.，美國(guó)）;1%抗生素（Gibco,Invitrogen Corporation，美國(guó)）;DMEM高糖培養(yǎng)基（孟德爾科技公司，成都，中國(guó)）;CCK-8（同仁化學(xué)研究所）;二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA，適馬股份有限公司）;鬼筆環(huán)肽（phalloidin，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）;4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）;ELISA試劑盒（96T，上海藍(lán)基生物科技有限公司）。

1.2 材料制備

1.2.1 HA和SiHA前驅(qū)液的制備

采用濕法化學(xué)法合成前驅(qū)液。將Ca(NO3)24H2O和正硅酸乙酯（TEOS）加入250 mL去離子水中，在70℃條件下水浴。(NH4)2HPO4溶于去離子水125 mL，磁力攪拌器攪拌30 min。滴加完成后，在70°C水浴中陳化24 h，得到HA-0.8wt%Si的硅羥基磷灰石前驅(qū)液。不添加TEOS步驟同上制備HA前驅(qū)液，凍干備用。

1.2.2 明膠靜電紡絲膜的制備

以13 wt%明膠-2 wt%HA、13 wt%明膠-2 wt%HA-0.8%Si為原料制備紡絲液。將上述制備的紡絲液在超純水中溶解，加熱攪拌4 h，形成10 mL均勻混合物。裝入10 mL注射器與不銹鋼針（外徑0.9 mm，內(nèi)徑0.6 mm）連接。電源為15 kV的高壓直流電源。針頭距包有一層鋁箔的接收板15 cm。以推進(jìn)速度為0.3 mL/h收集紡絲材料。

1.2.3 材料交聯(lián)和礦化

將電紡樣品剪成1 cm×1 cm小方塊。交聯(lián)時(shí)EDC濃度為75 mm，乙醇濃度為90%，EDC/NHS摩爾比為2.5﹕1。將剪好的樣品交聯(lián)12 h（4℃），取出用超純水洗3次。再將樣品浸泡在裝有10 mL 1.2×SBF的離心管中礦化，離心管置于37℃水浴1、3、7 d。

1.3 材料表面形貌觀察

用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡分別觀察電紡樣品、交聯(lián)樣品和礦化樣品的表面形貌。

1.4 細(xì)胞共培養(yǎng)

將細(xì)胞MC3T3-E1（接種密度為1×104/mL）接種于礦化后的樣品上。細(xì)胞培養(yǎng)基采用含10%血清的DMEM。培養(yǎng)基2 d換1次。培養(yǎng)MC3T3-E1培養(yǎng)至第3 d時(shí)，接種小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264.7（接種密度為10×104/mL）到材料表面進(jìn)行共培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)至1、3、7 d時(shí)，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8）培養(yǎng)（37℃）4 h后，使用酶標(biāo)儀（450 nm）測(cè)量吸光度（OD值）。

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后，分別使用二乙酸熒光素（FDA）、鬼筆環(huán)肽（phalloidin）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.7 成骨、破骨分化相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)

細(xì)胞在材料表面分別培養(yǎng)2、7、14 d后，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒測(cè)定成骨分化標(biāo)志蛋白因子堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、I型膠原（collagen-1，COL-1）和破骨相關(guān)蛋白因子白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、破骨分化標(biāo)志蛋白因子抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的表達(dá)量。用酶標(biāo)儀（450 nm）測(cè)定樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1 材料表征

2.1.1 靜電紡絲纖維

兩組樣品在交聯(lián)前均有均勻光滑的纖維，無機(jī)團(tuán)聚體散布于纖維間，納米纖維的直徑大多在200～350 nm;樣品交聯(lián)后，纖維仍保持光滑、均勻的結(jié)構(gòu)，但纖維直徑為400～500 nm。交聯(lián)前后電紡明膠-HA、明膠-Si HA樣品表面的掃描電鏡圖如圖1所示。

圖1 A、B.交聯(lián)前電紡明膠-HA、明膠-SiHA樣品表面的掃描電鏡圖;C、D.交聯(lián)后電紡明膠-HA、明膠-SiHA樣品表面的掃描電鏡圖

2.1.2 礦化表征

明膠-HA和明膠-SiHA復(fù)合納米纖維礦化1、3、7 d表面的掃描電鏡圖如圖2所示。兩組材料表面均有大量的礦物沉積物。明膠-HA樣品纖維表面呈球狀沉積，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，礦化晶體持續(xù)生長(zhǎng)，典型的非均勻形核結(jié)構(gòu)。明膠-SiHA樣品則沿納米纖維礦化，樣品在整個(gè)礦化過程中，纖維結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。

圖2 A.明膠-HA礦化1 d表面掃描電鏡圖;B.明膠-SiHA礦化1 d表面掃描電鏡圖;C.明膠-HA礦化3 d表面掃描電鏡圖;D.明膠-SiHA礦化3 d表面掃描電鏡圖;E.明膠-HA礦化7 d表面掃描電鏡圖;F.明膠-SiHA礦化7 d表面掃描電鏡圖

2.2 生物活性檢測(cè)

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

兩組材料表面培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞FDA染色結(jié)果如圖3A、圖3B所示。可以看到，梭形的MC3T3-E1和圓形的RAW264.7共同存在于兩組材料表面。明膠-SiHA樣品上細(xì)胞數(shù)量要多于明膠-HA樣品。兩組材料表面培養(yǎng)3 d后的細(xì)胞骨架和細(xì)胞核染色結(jié)果如圖3C、圖3D所示。明膠-SiHA樣品的細(xì)胞數(shù)量要多于明膠-HA樣品，MC3T3-E1的細(xì)胞骨架呈梭形狀，同時(shí)存在圓形的RAW264.7。

從圖3可以看出，相比于明膠-HA組，明膠-SiHA組材料表面的細(xì)胞鋪展更大，圓形的RAW264.7細(xì)胞堆積較明顯。

圖3 A.明膠-HA表面培養(yǎng)3 d后細(xì)胞FDA染色結(jié)果;B.明膠-SiHA表面培養(yǎng)3 d后細(xì)胞FDA染色結(jié)果;C.明膠-HA表面培養(yǎng)3 d后細(xì)胞鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果;D.明膠-SiHA表面培養(yǎng)3 d后細(xì)胞鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果

2.2.2 細(xì)胞增殖測(cè)試結(jié)果

隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，兩組材料的OD值都逐漸上升，說明兩組樣品都有良好的生物相容性。在整個(gè)共培養(yǎng)過程中，明膠-SiHA樣品的增殖情況要大于明膠-HA組。前期（1、3 d）兩組材料比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后期（7 d）兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種細(xì)胞接種于不同材料上培養(yǎng)1、3、7 d的增殖測(cè)試結(jié)果如圖4所示。

圖4 兩種細(xì)胞接種于明膠-HA和明膠-SiHA材料共培養(yǎng)1、3、7 d的增殖檢測(cè)情況:*表示明膠-SiHA組與明膠-HA組比較，P<0.05;**表示明膠-SiHA組與明膠-HA組比較，P<0.01

2.2.3 成骨、破骨分化標(biāo)志蛋白量檢測(cè)

隨著時(shí)間的增加，明膠-HA的ALP表達(dá)量逐漸降低，而明膠-SiHA的ALP表達(dá)量并未變現(xiàn)出有明顯的變化趨勢(shì);兩組材料的COL-1表達(dá)量都隨著時(shí)間的增加而增多，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。成骨分化標(biāo)志蛋白ALP、COL-1的檢測(cè)結(jié)果見圖5A、圖5B。在前期2 d和7 d時(shí)，兩組材料的TRAP、IL-1表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，到14 d時(shí)，兩種破骨分化因子在明膠-SiHA樣品的表達(dá)量均略高于明膠-HA樣品，但差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。破骨分化標(biāo)志物TRAP、IL-1的檢測(cè)結(jié)果如圖5C、圖5D所示。

圖5 共培養(yǎng)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白含量的檢測(cè):A、B.成骨分化標(biāo)志物ALP、COL-1表達(dá)量;C、D.破骨分化標(biāo)志物TRAP、IL-1表達(dá)量

3 討論

深入了解礦化過程有助于筆者更好地模擬天然骨環(huán)境，設(shè)計(jì)先進(jìn)骨組織材料。然而對(duì)硅如何提高HA生物活性的研究較少，筆者推測(cè)其可能通過調(diào)節(jié)明膠纖維的礦化，進(jìn)而對(duì)HA生物活性產(chǎn)生影響。為此，筆者系統(tǒng)研究了硅對(duì)明膠-HA復(fù)合纖維生物活性的影響。

材料表征結(jié)果表明，明膠-HA呈球狀礦化沉積物，典型的非均相成核。而明膠-SiHA復(fù)合納米纖維礦化發(fā)生在沿納米纖維方向。整個(gè)礦化過程中明膠-SiHA樣品保持了良好的纖維結(jié)構(gòu)，而明膠-HA礦化后期幾乎沒有纖維結(jié)構(gòu)。硅的摻入導(dǎo)致明膠-HA納米纖維的成核行為發(fā)生了顯著的變化，從典型的非均勻礦化到纖維內(nèi)的更均勻的沿絲礦化，材料表面提供了更多的Ca-P沉積成核位點(diǎn)[10]。細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，硅元素能促進(jìn)細(xì)胞在早期（1、3 d）的增殖，到7 d時(shí)變得不明顯[3]。細(xì)胞黏附和鋪展結(jié)果表明，明膠-SiHA表面的細(xì)胞數(shù)量明顯多于明膠-HA樣品，并且MC3T3-E1細(xì)胞骨架更清晰完整，說明硅對(duì)成骨細(xì)胞黏附及鋪展都有促進(jìn)作用[3,10]。研究表明電紡絲的纖維形態(tài)可以直接或間接影響細(xì)胞行為[5-8]。具有良好的纖維結(jié)構(gòu)且表面有均勻的沿絲礦化結(jié)構(gòu)的明膠-SiHA相對(duì)于明膠-HA對(duì)HA生物活性的促進(jìn)作用明顯。

共培養(yǎng)時(shí)，成骨和破骨相關(guān)蛋白檢測(cè)表明，硅對(duì)于前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化行為影響不明顯。這可能跟細(xì)胞的所處的環(huán)境相關(guān)，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞會(huì)分泌相關(guān)抑制因子，使共培養(yǎng)系統(tǒng)處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，這是體內(nèi)細(xì)胞的一種穩(wěn)定狀態(tài)。這種平衡一旦打破，就會(huì)使某一種細(xì)胞處于支配地位，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)增生或風(fēng)濕等疾病。所以在共培養(yǎng)條件下更能模擬體內(nèi)環(huán)境，且更能揭示體內(nèi)的微量元素硅提高明膠-HA表面的生物活性的機(jī)理[11]。

硅能提高材料表面的生物性能，原因是由于其改變明膠-HA表面的礦化行為，使材料表面的礦化呈均勻的沿明膠纖維礦化，且使材料表面有更多Ca-P沉積成核位點(diǎn)。在成骨相關(guān)和破骨相關(guān)細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，硅的摻入能促進(jìn)明膠-HA表面細(xì)胞的早期增殖，但對(duì)成骨和破骨細(xì)胞的分化影響不明顯。因此，在更接近體內(nèi)環(huán)境的共培養(yǎng)條件下，明膠-HA材料表面的生物活性的提高與表面的礦化行為有著重要的聯(lián)系。研究其對(duì)生物活性提高的機(jī)理，對(duì)將來可能將微量元素用于骨修復(fù)，或者作為減少植入材料體炎癥等提供一定的基礎(chǔ)研究理論。