一例大熊貓肺炎克雷伯菌與奇異變形桿菌感染的診斷

陳垚焱 劉頌蕊 蘇小艷 耿 毅* 黃文俊 陳 欣 白明煥 程子瑄

(1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都，611130；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都，610000)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)屬哺乳綱(Mammalia)，食肉目(Carnivora)，熊科(Ursidae)，大熊貓屬，被譽為“活化石”和“中國國寶”，屬國家Ⅰ級保護動物，是世界生物多樣性保護的旗艦物種。據第四次全國大熊貓野外種群調查，野生大熊貓劃分為秦嶺、岷山、邛崍山、大相嶺、小相嶺和涼山六大種群，33個相對獨立的局域種群，總數不足2 000只[1]，表明大熊貓已形成較為穩(wěn)定的種群，但其保護形勢依然嚴峻。研究表明，野生動物種群數量的下降不僅受氣候變化、棲息地破壞以及人類活動等因素的影響，同時疾病的危害也對種群數量的下降造成嚴重的威脅[2-3]。目前報道的大熊貓疾病有寄生蟲病(包括蛔蟲病、吸蟲病和體外寄生蟲病)[4]、細菌病(肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、大腸埃希菌Escherichiacoli和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa等)[5-8]和病毒病(犬瘟熱病毒CDV與輪狀病毒RV等)[8-10]等給大熊貓健康與生存造成嚴重影響。2018年7月，在四川某自然保護區(qū)發(fā)現1只死亡成體大熊貓，我們對其進行了病理學與病因學分析，旨在明確其死因，為更好地開展大熊貓保護工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

四川某自然保護區(qū)發(fā)現的1只死亡成年雄性大熊貓，體重52.9 kg。

1.1.2 主要試劑

福爾馬林固定液，TSA培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基(購于英國OXOID公司)，細菌基因組DNA提取試劑盒(購于北京天根生化科技有限公司)，擴增細菌16S rRNA基因通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)于生工生物工程(上海)股份有限公司成都分公司合成，2×TaqPCR Mastermix(購于北京天根生化科技有限公司)，ddH2O，反轉錄試劑盒(購于北京寶日醫(yī)生物技術有限公司)，動物組織總RNA提取試劑盒(購于北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢與病理組織學觀察

對死亡大熊貓進行系統(tǒng)病理剖檢，觀察各器官、組織的大體病變。同時取心、肺、胃、小腸、大腸、肝、胰、腎、脾、淋巴結、腦與肌肉等器官，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，H.E.染色，顯微鏡觀察。

1.2.2 病原學檢測

1.2.2.1 細菌學檢查

無菌操作從死亡大熊貓的肝、脾、心血、淋巴結及壞死肌肉等處取樣分別劃線接種于TSA與BHI平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24—48 h，挑取形態(tài)大小一致的單個優(yōu)勢菌落在相應平板上再次劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株，并觀察菌落與菌體形態(tài)特征。

取對數生長期的新鮮菌液，離心收集菌體，參考試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。采用擴增細菌16S rRNA 基因的通用引物PCR 擴增 16S rRNA基因，預期擴增片段大小為1 500 bp。PCR產物經DNA純化試劑盒純化后，送擎科梓熙(成都)有限公司測序。將分離菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中已知核酸序列進行BLAST比對。采用DNA Star軟件的Multiple Sequence Aligment程序進行多序列比對，用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2.2 病毒學檢查

取死亡大熊貓的肝、脾、腎組織提取RNA，參考郭玲等[11]的方法進行犬瘟熱病毒的特異性檢測。參考雷燕等[12]的方法進行輪狀病毒的特異性檢測。

1.2.2.3 寄生蟲檢查

參考艾必燕等[13]的方法進行體外與體內寄生蟲的檢查。

2 結果

2.1 病理剖檢

死亡大熊貓右耳皮膚4處開放性損傷，右肩部一深度約2.5 cm的潰瘍損傷灶(圖1-A)，右后肢掌第二趾墊缺損0.5 cm2，掌墊0.5 cm深潰瘍灶2處。剝離皮膚確認無組織器官自溶后，發(fā)現死亡大熊貓右肩部肌肉呈藍褐色(圖1-B)，并有惡臭味，肩部潰瘍處皮下肌肉壞死。腋下淋巴結、頸部淋巴結與頜下淋巴結等淺表淋巴結腫大，呈藍褐色，切面色澤不均勻，質地變脆(圖1-C)；胸肌與肋間肌萎縮，睪丸大小不對稱，左側大于右側。心臟擴張，冠狀溝血管擴張淤血，心室與心房內積血；肺門淋巴結腫大，呈紫褐色，肺萎縮，體積縮小，邊緣銳薄，被膜皺縮，并見斑狀出血(圖1-D)。肝腫脹，呈紫黑色(圖1-E)，膽囊擴張，膽汁充盈；脾萎縮，體積縮小，被膜皺縮(圖1-F)；腎腫脹，色澤不均勻，切面見部分區(qū)域呈暗紫色(圖1-G)，腎門淋巴結腫大，呈紫褐色；胰腺呈灰白色，輕度腫大；腸系膜淋巴結腫大，呈暗紫色(圖1-H)，胃腔與腸腔內未見明顯的異常，但黏膜易脫落。

圖1 死亡大熊貓剖檢病變Fig.1 Gross lesions of the dead giant panda 注：A：右肩部皮膚潰瘍；B：右肩部肌肉呈藍褐色；C：右側腋下及頸淋巴結腫大；D：右側肺斑塊狀出血；E：肝腫脹，呈紫黑色；F：脾萎縮，被膜皺縮；G：腎切面色澤不均，部分呈紫褐色；H：腸系膜淋巴結腫大，呈紫褐色 Note：A，skin ulcer in right shoulder.B，the muscles of the right shoulder were blue and brown.C，right axillary and cervical lymph node enlargement.D，hemorrhage in right lung.E，swelling in liver with purplish black.F，atrophy of spleen and the capsule was shrinking.G，the section of kidney was inhomogeneity in color，part of which is bluish brown.H，enlargement in mesenteric lymph nodes with bluish brown

2.2 病理組織學觀察

病理組織學觀察發(fā)現，死亡大熊貓心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、肌肉與腸道等組織器官都發(fā)生較明顯的病理損傷，并在心、肝、肺與淋巴結等都發(fā)現大量細菌入侵。

心：心肌纖維表現為顆粒變性，肌間隙增寬，其間偶見細菌團塊，并致心肌局部形成局灶性溶解壞死灶(圖2-A)。

肝：局部區(qū)域肝小葉中央靜脈與肝血竇擴增淤血(圖2-B)，肝細胞較為廣泛性顆粒與水泡變性，部分中央靜脈與小葉間血管內見長短不一桿狀細菌，且部分肝小葉內見細菌入侵，并致灶性壞死(圖2-C)。

脾：被膜增厚，實質內大量結締組織小梁增生，白髓區(qū)域縮小，紅髓與白髓區(qū)淋巴細胞顯著減少，紅髓淤血，大量含鐵血黃素沉著(圖2-D)。

肺：部分區(qū)域肺泡壁毛細血管擴增淤血，肺泡腔內出現多少不等的紅細胞、巨噬細胞及中性白細胞，并在部分血管與肺泡內發(fā)現大量桿狀細菌入侵(圖2-E)；另外，部分區(qū)域表現為肺萎陷(圖2-F)，肺泡明顯縮小，肺泡壁結締組織增生。

腎：腎小囊內出現多少不等的蛋白滲出，腎小管腔內有蛋白樣管型，腎小管上皮細胞廣泛性壞死，腎間血管內見多量桿狀細菌，腎組織內也見桿狀細菌入侵，并引起入侵部位組織壞死(圖2-G)。

骨骼肌(右肩部)：肌纖維肌漿凝固，肌橫紋與縱紋消失，肌纖維壞死，肌間隙大量中性粒細胞、巨噬細胞浸潤(圖2-H)，并在肌間隙見多量入侵的藍染細菌團塊(圖2-I)。

淋巴結：淋巴結血管腔內見多量桿狀細菌，淋巴竇內多量滲出的漿液、巨噬細胞、中性粒細胞，同時有細菌的入侵(圖2-J)；皮質區(qū)淋巴細胞廣泛性壞死，同時有多量細菌入侵(圖2-K)。

腸：十二指腸、空場、回腸、結腸與直腸黏膜上皮脫落，腸腺上皮變性、壞死(圖2-L)。

圖2 死亡大熊貓病理組織損傷Fig.2 Histopathological lesions of the dead giant panda 注：A：心肌間隙內細菌團塊，肌纖維壞死；B：肝中央靜脈與肝血竇淤血；C：肝小葉內細菌入侵，肝細胞顆粒變性；D：脾淤血，淋巴細胞減少，脾小梁增生；E：肺泡腔漿液滲出，細菌入侵，出血；F：肺萎陷；G：腎內血管細菌入侵，腎小管上皮壞死；H：骨骼肌壞死，肌間隙大量中性粒細胞與巨噬細胞浸潤；I：侵入骨骼肌的細菌團塊；J：淋巴結淋巴細胞壞死與細菌團塊；K：侵入淋巴結的細菌；L：腸上皮壞死脫落，腸腺細胞變性、壞死 Note：A，bacterial mass in intermyocardial space，necrosis in myocardial fiber.B，congestion in hepatic central vein and hepatic sinus.C，bacterial invasion in hepatic lobules，granulosa degeneration in hepatic cells.D，congestion in spleen，lymphopenia and splenic trabecular hyperplasia.E，serous exudation，bacterial invasion，and hemorrhage in pulmonary alveoli.F，pulmonary collapse.G，bacterial invasion in renal blood vessels，necrosis in renal tubular epithelia.H，necrosis in skeletal muscle，massive neutrophil and macrophage infiltration in intermuscular space.I，bacterial mass in skeletal muscle.J，necrosis of lymphocytes and bacterial masses in lymph nodes.K，bacterial invasion in lymph nodes.L，necrosis and exfoliation of intestinal epithelia，degeneration and necrosis of intestinal gland

2.3 病原學檢查

2.3.1 細菌學檢查

2.3.1.1 細菌的分離與純化

從死亡大熊貓的肝、脾、心血、淋巴結與壞死肌肉等處取樣劃線接種于 TSA 與 BHI平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24—48 h，結果在平板上均出現2種菌落形態(tài)、色澤較為一致的優(yōu)勢菌。分別挑取單菌落在BHI平板進行劃線，37 ℃恒溫 24 h，對分離細菌進行純化，獲得純化優(yōu)勢菌2株(SM1與SM2)。SM1在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成較大的灰白色黏液菌落，以接種環(huán)挑之，易拉成絲，為G-、無芽孢、兩端鈍圓的桿菌；SM2在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成以接種部位為中心的厚薄交替的波紋狀菌苔，為G-，單個、成對或短鏈狀排列的桿菌。

2.3.1.2 分離菌16S rDNA序列分析

提取純化細菌 DNA 為模板，擴增出預期 1 500 bp 大小的DNA 片段，擴增產物經 DNA 純化試劑盒純化后，送擎科梓熙(成都)有限公司進行序列測定，將測得的 16S rDNA 序列在GenBank 中進行 BLAST 比對，結果發(fā)現2分離菌16S rDNA 序列分別與肺炎克雷伯菌及奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)的16S rDNA 序列同源性最高，達99%以上。采用DNAStar軟件分別將2分離菌的16S rDNA序列與GenBank中同源性較高的16S rRNA序列進行多序列比對，并構建系統(tǒng)進化樹(圖4)。結果顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹上分離株菌SM1與Klebsiellapneumoniae聚為一支；分離株菌SM2與Proteusmirabilis聚為一支。由此鑒定2分離菌分別為Klebsiellapneumoniae與Proteusmirabilis。

2.3.2 病毒學檢查

犬瘟熱病毒和輪狀病毒PCR檢測結果均為陰性。

2.3.3 寄生蟲學檢查

未見蜱、虱等體外寄生蟲；剖檢死亡大熊貓的腸道和臟器也均未見大量蛔蟲等內寄生蟲。

3 討論

病理剖檢發(fā)現，死亡大熊貓身體具有明顯的外傷，進一步的組織學檢測發(fā)現肩部骨骼肌、肝、腎、肺與淋巴結內都發(fā)現大量細菌入侵，且這些組織與器官都發(fā)生明顯的變性、壞死與炎性細胞浸潤，從而導致相應器官功能障礙，尤其是心、肝、腎與肺損傷所致的多器官功能障礙應該是該例大熊貓的死因。病毒學檢查犬瘟熱病毒和輪狀病毒均為陰性；寄生蟲學檢查腸道內有少量蛔蟲，不足100條，不屬于致病原因[14]；細菌學檢查從死亡大熊貓肝、脾、心血、淋巴結及壞死肌肉等組織分離到細菌，表明死亡大熊貓發(fā)生了全身性感染。分離菌的16S rDNA序列分析表明，感染的細菌為肺炎克雷伯菌及奇異變形桿菌，這些細菌通過身體的外傷途徑入侵致菌血癥引起全身性感染是本例大熊貓死亡的病因。

菌血癥指血液中出現微生物，多是細菌由局部病灶入血引起全身性感染。據國內外學者研究發(fā)現，肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌都有引起菌血癥的相關報道。Bleich等[15]研究發(fā)現，肺炎克雷伯菌等機會性病原體會引起菌血癥導致全身性感染，病理觀察表現為全身性多組織器官損傷，并有大量細菌團塊入侵。Wei等[16]建立了奇異變形桿菌機會性感染的小鼠模型，發(fā)現其感染能致小鼠全身性菌血癥。本次病例的病理學觀察結果與上述報道基本一致，表明肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌感染是本例大熊貓的組織器官損傷與致死的重要原因。

克雷伯菌(Klebsiellaspp.)是能引起多種動物患病的條件性致病菌，國內外先后從患病的馬、牛、豬、雞、鴨、麝鼠、珍珠雞等動物體內分離到該菌[17-18]。在大熊貓自鄔捷等[19]1988年首次從2例患出血性腸炎大熊貓體內和糞便中分離出作為致病菌的肺炎克雷伯氏菌后，該菌對大熊貓的危害與相關研究受到了關注[7，20-21]。肺炎克雷伯菌對大熊貓的致病在臨床上分為腸炎型和敗血型兩種類型[17]，本病例表現為全身性感染，全身多組織器官變性與壞死，雖見腸黏膜上皮脫落，腸腺上皮變性、壞死，但未見明顯腸炎表現，因此，本病例屬于敗血型。

奇異變形桿菌廣泛分布于自然界、人與動物體表，是一種較常見的條件致病菌。P.m.在人、動物體內或體表的適宜環(huán)境生長并大量繁殖時，可誘發(fā)尿道炎、腎盂腎炎、中耳炎、菌血癥及急、慢性腹瀉、脊髓炎等多種疾病，嚴重時可致死[22]。2007年，王承東等[23]發(fā)現了一例雌性大熊貓生殖道感染奇異變形桿菌感染。奇異變形桿菌在大熊貓腸道較為常見，屬腸道內的正常菌群，一般不會致病，只有在當其定居部位改變、機體抵抗力降低或菌群失調時可致病[24]。本病例中大熊貓的脾臟明顯萎縮，淋巴細胞數量顯著減少，表明其免疫力較為低下，可能是其易發(fā)生感染的重要原因。

對于本只大熊貓外傷形成的原因，根據現有的研究結果我們還不能做出較為確切的判定。Martinez等[25]的調查發(fā)現，在毗鄰野生動物棲息地的農村，家養(yǎng)犬只可能會攻擊野生動物，導致野生動物受傷，對野生動物生存造成潛在威脅；Chaudhary等[26]也發(fā)現，保護區(qū)周圍的犬只不僅野生動物生存構成威脅，同時存在較高疾病傳播的風險。由此可見，犬只對野生動物的生存與保護有重要影響，不但會攻擊野生動物，而且還可能會傳播疾病。盡管目前還未見犬只攻擊大熊貓的案例報道，但也要引起關注，加強保護區(qū)周邊犬只的管理。