桑黃、蛹蟲草超臨界CO2萃取物的抗氧化活性及其黃酮和三萜含量

張 倩 孫瑞祥 王 妍 孫建堯 張 蕊 程顯好 楊樹德

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺(tái)264025）

桑黃，為多孔菌科火木層孔菌（Sanghuangporus sanghuang），含有多糖、黃酮及三萜類化合物等活性成分，是公認(rèn)的具有抗腫瘤活性的大型藥用真菌。其所含多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖等功效[1]；黃酮類和三萜類化合物具有抗氧化活性[2]，還有抗腫瘤、抗肝纖維化、增強(qiáng)免疫的作用[3]。

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又稱北蟲草，含有腺苷、蟲草素、蟲草酸、蛋白質(zhì)、多糖、超氧化物歧化酶等活性成分[4]。蛹蟲草的藥理功效包括抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、消炎、抗心律失常等[5]。蛹蟲草藥理方面的研究主要圍繞其多糖和核苷類衍生物展開，而對(duì)其抗氧化活性成分的研究較少。

超臨界二氧化碳萃取法可在接近室溫的條件萃取，具有無(wú)毒、無(wú)害、可避免熱敏性物質(zhì)氧化、無(wú)化學(xué)試劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，是提取黃酮、三萜等抗氧化活性成分的最佳方法之一[6]。筆者初步測(cè)定了人工培養(yǎng)的桑黃菌絲體和蛹蟲草子實(shí)體的超臨界CO2萃取物的抗氧化活性及其黃酮、三萜含量，旨在為今后桑黃和蛹蟲草的培養(yǎng)與產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用桑黃及蛹蟲草菌株為魯東大學(xué)食用菌教研室保存的菌種。桑黃的固體培養(yǎng)基為70 g大米中加90 g 水，蛹蟲草的培養(yǎng)基為30 g 大米加30 g 油麥，再加96 g水。

桑黃菌絲體和蛹蟲草子實(shí)體干燥、粉碎后過60目篩，送至南通睿智超臨界科技發(fā)展有限公司進(jìn)行萃取。萃取壓力為 45 MPa，溫度 50 ℃，CO2流量30 L/h，加適量乙醇為夾帶劑，萃取時(shí)間90 min；分離釜壓力為8 MPa，溫度為55 ℃，獲得萃取物。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 清除羥基自由基能力的測(cè)定

根據(jù) Sroka.Z 和 Cisowski.W 方法[7]，略有調(diào)整。取 9 mmol/L 硫酸亞鐵溶液 1 mL、9 mmol/L 水楊酸-乙醇2 mL 和各萃取物2 mL 于試管中，最后加入8.8 mmol/L 過氧化氫溶液2 mL 啟動(dòng)反應(yīng)，于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h。以蒸餾水作為空白調(diào)零，用分光光度計(jì)于510 nm 處測(cè)定吸光度值，空白對(duì)照組用2 mL蒸餾水代替樣品溶液。同時(shí)設(shè)立試劑空白管（加水楊酸而不加過氧化氫），使用與樣品溶液等體積的VC（0.2 mg/mL）溶液為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算清除羥基能力（SA）的公式如下：

其中：A0為空白對(duì)照液吸光值，AX為樣品吸光值，AY為樣品溶液在試劑空白管的吸光值。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

按照Ozen.T 等方法[8]測(cè)定DPPH 自由基清除活力。取各樣品溶液4 mL 與1 mL 0.004%DPPH 溶液于試管中搖勻，黑暗中靜置30 min，以無(wú)水乙醇為空白調(diào)零，在517 nm 處測(cè)吸光度值，空白對(duì)照組用4 mL 無(wú)水乙醇代替樣品溶液，同時(shí)設(shè)立不加DPPH的試劑空白管，以與樣品溶液等體積的VC（0.2 mg/mL）溶液為陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算清除DPPH能力（SA）：

其中：A0為空白對(duì)照液吸光值，AX為樣品吸光值，AY為樣品溶液在試劑空白管的吸光值。

1.2.3 黃酮類化合物含量的測(cè)定

總黃酮含量的測(cè)定參考Zhuang 等（2018）的方法[9]，略有調(diào)整。準(zhǔn)確稱取桑黃萃取物0.094 g，用乙醇溶解，配制成1.88 mg/mL 樣品溶液。準(zhǔn)確稱取蛹蟲草子實(shí)體0.136 g 用乙醇配制成2.72 mg/mL 樣品溶液。吸取蘆?。?.1 mg/mL）對(duì)照品溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于試管中，用乙醇稀釋至5 mL，同時(shí)吸取1.5 mL 樣品溶液于新試管中，用無(wú)水乙醇定容至5 mL，在上述試管中分別加入5%NaNO2溶液0.4 mL，搖勻靜置6 min；加入 10% Al（NO3）3溶液 0.4 mL，搖勻后靜置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用無(wú)水乙醇稀釋至10 mL，搖勻后靜置15 min；于510 nm 處檢測(cè)吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作進(jìn)行吸光度測(cè)定，按回歸方程計(jì)算黃酮含量。

1.2.4 三萜類化合物含量的測(cè)定

總?cè)坪康臏y(cè)定參考張倩倩等（2018）的方法[10]。分別將熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1 mg/L）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL 置于試管中，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和1 mL高氯酸，將全部試管65 ℃水浴加熱45 min 后加入0.5 mL 冰醋酸，用乙酸乙酯定容至5 mL，搖勻后室溫中靜置15 min，然后于550 nm 處測(cè)定吸光值。以熊果酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品溶液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液同上進(jìn)行吸光度測(cè)定，按回歸方程計(jì)算三萜含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取物清除羥基自由基能力

H2O2/Fe 體系中產(chǎn)生的·OH 氧化水楊酸會(huì)產(chǎn)生有色物質(zhì)，若把清除·OH 的物質(zhì)加入體系中，則有色物質(zhì)生成會(huì)減少，降低吸光度。吸光度越低，·OH清除效果越好。兩種萃取物清除·OH 的活性如表1所示，經(jīng)換算可知，1 mg桑黃菌絲體超臨界CO2萃取物對(duì)·OH 的清除率與0.17 mg VC 相當(dāng)，1 mg 蛹蟲草子實(shí)體超臨界CO2萃取物對(duì)·OH 的清除率與0.28 mg VC相當(dāng)。

表1 桑黃、蛹蟲草超臨界CO2萃取物對(duì)羥自由基的清除能力

2.2 清除DPPH自由基能力

DPPH 自由基存在單電子，在517 nm 處有一強(qiáng)吸收，溶于醇后顯紫色。當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，自由基清除劑與DPPH 自由基單電子配對(duì)而減少吸收值，其接受的電子數(shù)量與褪色程度有線性關(guān)聯(lián)。根據(jù)表2 可推算出，1 mg 桑黃菌絲體超臨界CO2萃取物清除DPPH 自由基的能力與1.57 mg VC 的能力相當(dāng)，1 mg 蛹蟲草子實(shí)體超臨界CO2萃取物清除DPPH自由基的能力與0.12 mg VC的相當(dāng)。

表2 桑黃、蛹蟲草超臨界CO2萃取物對(duì)DPPH自由基清除能力

2.3 萃取物中黃酮類化合物含量的測(cè)定結(jié)果

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定了兩種超臨界CO2萃取物中黃酮類物質(zhì)的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=15.422x-0.0292（R2=0.997）。由圖1可知，桑黃菌絲體、蛹蟲草子實(shí)體的超臨界CO2萃取物中黃酮類物質(zhì)的含量較高，分別為4.67%、4.08%，兩者存在顯著性差異。

2.4 萃取物中三萜類化合物含量的測(cè)定結(jié)果

以熊果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定了兩種超臨界CO2萃取物中三萜類物質(zhì)的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=20.821x-0.0223（R2=0.989）。由圖2 可知，桑黃菌絲體、蛹蟲草子實(shí)體的超臨界CO2萃取物中三萜類物質(zhì)含量分別為34.89%、19.25%，兩者存在極顯著性差異。

圖1 桑黃菌絲體及蛹蟲草子實(shí)體超臨界CO2萃取物中黃酮類物質(zhì)含量

圖2 桑黃菌絲體及蛹蟲草子實(shí)體超臨界CO2萃取物中黃酮類物質(zhì)含量

3 小結(jié)與討論

作為兩種重要的藥用真菌，桑黃、蛹蟲草受到了很多研究人員的青睞，其活性成分的提取技術(shù)研究報(bào)道較多，但是采取超臨界CO2萃取技術(shù)提取這兩種真菌活性成分的研究報(bào)道不多。研究發(fā)現(xiàn)，兩種超臨界CO2萃取物中的黃酮和三萜類物質(zhì)的含量明顯高于前人的報(bào)道[11-12]。兩種萃取物均有一定的清除羥自由基和DPPH 自由基的活性，其中，桑黃菌絲體的萃取物具有較強(qiáng)的清除DPPH 的活性，清除羥自由基的活性較弱。桑黃菌絲體萃取物中黃酮類化合物的含量略高于蛹蟲草子實(shí)體萃取物，而三萜類化合物的含量高0.8 倍，預(yù)示三萜類化合物對(duì)清除羥自由基的活性貢獻(xiàn)不大，而與DPPH 的清除活性相關(guān)。考慮到黃酮和三萜類化合物的組成比較復(fù)雜，不同的組分之間清除自由基的活性不同。因此，要更清晰闡明桑黃菌絲體和蛹蟲草子實(shí)體的超臨界CO2萃取物的抗氧化活性差異的根本原因，需要借助質(zhì)譜、核磁共振儀等具有高分辨力的精密儀器來解析兩種萃取物的組成成分。此外，對(duì)屬于木腐菌的桑黃而言，在大米培養(yǎng)基中添加木質(zhì)纖維素成分，對(duì)其活性成分的組成與含量可能有一定影響，這方面的工作也很有必要開展。