兩株野生雞腿菇分離鑒定及生物學(xué)特性研究

張秀偉 牛力立 蔡甫格 鮑 菊 曹家洪 張萬萍

（安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州安順561000）

雞腿菇學(xué)名毛頭鬼傘（Coprinus comatus），屬于擔(dān)子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、傘菌科、鬼傘屬，是一種珍稀食用菌[1]，被定為符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）要求的，集天然、營(yíng)養(yǎng)、保健三種功能為一體的16種珍稀食用菌之一[2]。

雞腿菇是一種世界性分布的菌類，野生菌多分布在我國北方省份，在貴州很少見。研究針對(duì)貴州當(dāng)?shù)氐? 株野生雞腿菇（圖1、圖2）進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為選育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的地方品種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生雞腿菇菌株：試驗(yàn)菌株于2018 年5 月、10月采自貴州安順市草坪地，組織分離后保存菌種，編號(hào)為MT-1、MT-2。菌種現(xiàn)保存在安順市農(nóng)科院分子生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

參照《多彩的蘑菇世界：東北亞地區(qū)原生態(tài)蘑菇圖譜》[3]進(jìn)行初步形態(tài)鑒定。

圖1 野生MT-1

圖2 野生MT-2

1.2.2 ITS序列分析及鑒定

利用CTAB 法提取2 個(gè)菌株的DNA，以ITS5（5′-GGAAAAGTCGTAACAAGG-3′）為正向引物，ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為反向引物（引物濃度1 nmol/L 加100 μL 水），進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Mastermix [天根生化科技（北京）有限公司]12.5 μL，引物 ITS5 和ITS4 各 1 μL，菌株 DNA1 μL，超純水補(bǔ)足 25 μL。PCR 程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，開始循環(huán)，95 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃復(fù)性 8 s，33 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增后產(chǎn)物由北京賽諾生物有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序，測(cè)定的結(jié)果在Gen Bank 上，運(yùn)用Blast進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.3 菌絲培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

制備PDA 平板培養(yǎng)基，取直徑5 mm 的兩菌株菌塊接入平板中間，于 5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d 用十字交叉法分別測(cè)其菌落直徑，并觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4 培養(yǎng)基pH試驗(yàn)

用NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）將PDA 培養(yǎng)基的pH 分別調(diào)至4、5、6、7、8、9、10、11，制備PDA 平板后，接入直徑5 mm 兩菌株菌塊，于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)10 d，測(cè)量菌落直徑（方法同1.2.3）。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 培養(yǎng)基碳源、氮源試驗(yàn)

以真菌生理培養(yǎng)基[4]（氮源1 g，碳源5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O0.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL）為基礎(chǔ)。以KNO3為氮源，配制以甘露醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、無碳源（CK）的碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基；以蔗糖為碳源，配制以硫酸銨、硝酸銨、酵母膏、蛋白胨、硝酸鉀、硝酸鈉、無氮源（CK）的氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基。將直徑5 mm 的菌塊接入試驗(yàn)培養(yǎng)基，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d，測(cè)量菌落直徑（方法同1.2.3）。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 光照試驗(yàn)

取直徑5 mm 的菌塊，接入PDA 培養(yǎng)基平板中，于全光照（24 h 光照）、半光照（12 h 光照，12 h 黑暗）、全黑暗（24 h 黑暗）條件，25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。菌落直徑測(cè)定方法同1.2.3。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.7 栽培試驗(yàn)

用培養(yǎng)好的兩菌株麥粒原種，接種在棉籽殼50%，玉米芯34%，麩皮10%，石灰3%，石膏1%，鈣鎂磷酸肥1%，糖1%的培養(yǎng)料上，菌絲長(zhǎng)滿袋后出菇管理。兩個(gè)菌株分別制作18個(gè)菌袋，框栽每框放置3 袋，2 框?yàn)橐粋€(gè)小區(qū)，重復(fù)3 次。記載菌絲出土期（覆土層布滿菌絲的時(shí)間）、原基形成期（覆土層出現(xiàn)大量原基時(shí)間）、采收期（子實(shí)體五六分熟時(shí)，菌環(huán)剛松動(dòng)時(shí)）。統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量（kg/小區(qū)），計(jì)算生物學(xué)效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生雞腿菇MT-1、MT-2的形態(tài)特征

根據(jù)野生子實(shí)體形態(tài)特征，參照《多彩的蘑菇世界：東北亞地區(qū)原生態(tài)蘑菇圖譜》[3]初步確定兩株真菌均為毛頭鬼傘。

2.2 野生雞腿菇MT-1、MT-2的ITS序列分析及鑒定

采用CTAB 法，提取兩株野生食用菌的DNA，用ITS5 為正向引物，ITS4 為反向引物，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，郵寄至北京賽諾生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下：

MT-1、MT-2 序列全長(zhǎng)分別為668 bp、667 bp。通過 GenBank BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MT-1、MT-2 與鬼傘屬的毛頭鬼傘最大同源性高達(dá)100%、99.38%，結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征，將兩種真菌鑒定為毛頭鬼傘。

2.3 供試碳源對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表1 可以看出，供試碳源培養(yǎng)基上兩株雞腿菇菌絲均能生長(zhǎng)，菌落圓形、灰白色。最佳碳源為甘露醇，MT-1、MT-2 的菌絲濃密，菌落直徑分別為6.43 cm、4.98 cm，與其他碳源培養(yǎng)基菌落直徑差異顯著。在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上兩菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，菌落直徑最小。

葡萄糖、麥芽糖兩處理間，MT-1 菌落直徑無顯著性差異，與其他碳源處理差異顯著。葡萄糖、麥芽糖或無碳源（CK）三處理間，MT-2 菌落直徑無顯著差異。

表1 供試碳源對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

同一碳源培養(yǎng)基上，MT-1 的菌落直徑均大于MT-2的直徑。

2.4 供試氮源對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表2 結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基有無氮源兩個(gè)菌株菌絲均能生長(zhǎng)，菌落灰白色、圓形。MT-1、MT-2培養(yǎng)基最佳氮源均為蛋白胨，菌落濃密，直徑分別為7.72 cm、8.48 cm。

氮源為蛋白胨或NH4NO3，MT-1 菌落直徑排前二，兩者間無顯著性差異，兩者與其他氮源培養(yǎng)基差異顯著；含有硝基氨培養(yǎng)基上的菌落稀疏，長(zhǎng)勢(shì)較差；氮源為酵母膏培養(yǎng)基，MT-1 菌落直徑位列第三，與其他氮源培養(yǎng)基差異顯著。

MT-2 在以NH4NO3為氮源的培養(yǎng)基上，菌落直徑位列第二，與其他氮源培養(yǎng)基差異顯著。

2.5 pH對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表3結(jié)果可以看出，兩個(gè)菌株對(duì)培養(yǎng)基pH 適應(yīng)范圍較廣，pH4～11 菌絲均能生長(zhǎng)，菌落均呈灰白色、圓形。試驗(yàn)pH范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基pH上升菌落擴(kuò)展速度加快，pH7 時(shí) MT-1、MT-2 菌落達(dá)最大值，分別為10.61 cm、10.40 cm。

表2 供試氮源對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

表3 pH對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

MT-1 菌落直徑，培養(yǎng)基 pH7 與其他 pH 處理間差異顯著；培養(yǎng)基pH4、pH5、pH6、pH8、pH9 四處理間MT-1菌落直徑無顯著性差異。

MT-2 菌落直徑，培養(yǎng)基 pH5、pH6、pH7 三者間無顯著性差異，與其他pH 處理差異顯著；pH8 與pH9無顯著性差異；pH10與pH11無顯著性差異。

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表4可以看出，在試驗(yàn)最低溫度（5 ℃）和最高溫度（35 ℃）兩個(gè)菌株菌絲體均不能生長(zhǎng)，溫度25 ℃時(shí)MT-1、MT-2 菌落直徑最大，分別為8.68 cm、8.60 cm。培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度下降，MT-1、MT-2 的菌落直徑分別為 8.47 cm、5.93 cm。由此可見，MT-1菌株相比MT-2更耐高溫。

2.7 光照對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

由表5 可見，光照對(duì)兩菌株菌絲體的生長(zhǎng)有抑制作用，在全黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲濃密，MT-1、MT-2 的菌落直徑分別為8.6 cm、8.5 cm，與其他兩個(gè)光照處理差異顯著；在全光照下兩菌株菌絲體生長(zhǎng)最慢，且菌絲稀疏。

表4 培養(yǎng)溫度對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

表5 光照對(duì)MT-1、MT-2菌絲體生長(zhǎng)的影響

圖3 人工栽培MT-1

2.8 兩菌株栽培結(jié)果

表6 MT-1及MT-2覆土栽培結(jié)果

由表5可見，覆土后MT-1、MT-2菌絲出土?xí)r間一致，均為9 d，菌絲潔白健壯。MT-1 現(xiàn)原基（17 d）比MT-2（20 d）早，采收時(shí)間也早。MT-1、MT-2 的生物學(xué)效率分別為73.78%、54.54%。

3 小結(jié)與討論

子實(shí)體形態(tài)特征與ITS 序列分析相結(jié)合鑒定結(jié)果，獲得兩株野生菌為毛頭鬼傘。

對(duì)兩株雞腿菇菌絲體生物學(xué)特性的研究表明，有機(jī)氮源更利于兩菌株菌絲生長(zhǎng)；甘露醇為兩個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源，與朱玉蘭等研究結(jié)果不同[5]，可能為菌株個(gè)體差異；乳糖為碳源培養(yǎng)基菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，與曹晉良等試驗(yàn)結(jié)果相似；兩菌株培養(yǎng)基最適pH 為7，與以往研究不同[6-9]，表明來自不同地區(qū)野生雞腿菇菌株對(duì)培養(yǎng)基pH 要求是有差異的。兩菌株菌絲生長(zhǎng)對(duì)溫度及光照要求與前人相關(guān)研究結(jié)果一致。

圖4 人工栽培MT-2

試驗(yàn)培養(yǎng)料上兩菌株均能出菇，MT-1 生物學(xué)效率高于MT-2。MT-2野外采集時(shí)間為10月，溫度較低，而試驗(yàn)出菇時(shí)遇到一段時(shí)間的高溫，可能對(duì)其產(chǎn)量產(chǎn)生了一定的影響。