龜板固本方對(duì)肺癌骨髓抑制小鼠骨髓造血微環(huán)境的影響

黎壯偉， 張廣麗

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520

肺癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤發(fā)病率的首位，化療是肺癌的主要治療手段之一，但化療會(huì)引起骨髓抑制等副作用，嚴(yán)重者可導(dǎo)致化療終止，影響后續(xù)的治療。化療引起的骨髓造血功能損傷也是影響患者生存質(zhì)量和治療效果的重要因素。因此，尋找有效藥物來(lái)減輕化療對(duì)骨髓抑制，修復(fù)化療對(duì)骨髓造血微環(huán)境損傷，成為目前研究的重點(diǎn)。龜板固本方在臨床上治療骨髓抑制具有良好的療效[1，2]，但其機(jī)制不詳，本研究從骨髓造血微環(huán)境損傷修復(fù)的角度研究龜板固本方治療肺癌化療骨髓損傷的療效及其機(jī)制，為龜板固本方改善骨髓造血功能提供科學(xué)依據(jù)，探索治療肺癌化療致骨髓抑制的有效處方。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株 C57BL/6 小鼠購(gòu)于北京華阜康科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證SCXK（京）2019-0008]，重量18 g～22 g，SPF 級(jí)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫（21 ± 2）℃，濕度30%～60%。Lewis 肺癌瘤株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥物 龜板固本方由龜板、黃精、桑椹、黃芪、紅參等組成，中藥飲片從廣州致信藥業(yè)股份有限公司購(gòu)買，按常規(guī)方法水煎取汁濃縮而成，實(shí)驗(yàn)用藥生藥含量為0.8 g/mL。重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液，規(guī)格75 μg/支，杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字S10980029。注射用環(huán)磷酰胺由江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格0.2 g/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857。

1.3 主要試劑和儀器 IMDM培養(yǎng)液購(gòu)自HYCLONE公司，批號(hào)：NWB0372；重組小鼠粒單系集落刺激因子購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司，批號(hào)：050755-1；重組白細(xì)胞介素-3購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，批號(hào)：120948；重組人促紅細(xì)胞生成素購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司，批號(hào)：P9BM0042。Napco-5410 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Shelden 公司）；全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器（YXQ－LS－SⅡ）；UV2101 PC 型紫外分光光度計(jì)（尤尼科上海儀器有限公司）。熒光顯微鏡（Leica Microsystems Ltd，德國(guó)），自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本Sysmex-820）。TPO Elisa 試劑、EPO Elisa 試劑和GM-CSF 試劑均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

將60 只Lewis 肺癌小鼠隨機(jī)分為4 組，空白組、模型組、龜板固本方組、西藥組，每組15只。除空白組外，其他3組均進(jìn)行造模。小鼠造模完成后24 h 開始給藥，龜板固本方組每只小鼠按0.4 ml/d 的劑量灌胃給藥；空白對(duì)照組和模型組給等量生理鹽水；西藥組皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液5 ng/g，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

2.2 建立Lewis肺癌小鼠化療致骨髓抑制模型

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis 肺癌細(xì)胞，常規(guī)離心，制成瘤細(xì)胞混懸液，消毒小鼠右前腋，取0.2 ml接種于皮下。待瘤體生長(zhǎng)至直徑1～1.5 cm 時(shí)，處死小鼠，選取生長(zhǎng)良好的瘤組織，剪碎、稱重，用細(xì)胞勻漿器制成勻漿，制備成濃度為1×107/ml 瘤細(xì)胞混懸液，每只小鼠右腋下接種0.2 ml（約1～2×106瘤細(xì)胞），接種4 d 后，以小鼠右腋下皮下可觸及腫瘤塊標(biāo)志造模成功，建立Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型。上述Lewis肺癌荷瘤模型小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺250 mg/kg（于臨用前配制），以外周血細(xì)胞（WBC、RBC、PLT）明顯低于正常小鼠（均P＜0.05），提示模型復(fù)制成功，完成Lewis 肺癌荷瘤小鼠化療致骨髓抑制模型[3]。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 外周血象檢測(cè)

每組小鼠分別于造模后（0 d）及給藥7 d 后（造模后8 d）尾靜脈采血，用自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

2.3.2 骨髓造血微環(huán)境檢測(cè)

小鼠給藥7 天后，經(jīng)頸椎脫臼處死，取股骨，用剪刀剪開股骨兩頭，露出骨髓腔，然后用消毒過的注射器、4 號(hào)針頭，吸取2 ml培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗骨髓腔收集骨髓細(xì)胞，全部置離心管內(nèi)，反復(fù)吹打使細(xì)胞完全分散，然后離心10 min（1 000 r/min），去上清，加入適量培養(yǎng)液充分混勻，制成骨髓有核細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性在95%以上。提取骨髓有核細(xì)胞懸液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ABC-ELISA）檢測(cè)骨髓有核細(xì)胞懸液上清中的紅細(xì)胞生成素（EPO），血小板生成素（TPO），粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）含量，具體按試劑盒說明書操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將所得結(jié)果建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龜板固本方對(duì)肺癌骨髓抑制小鼠外周血象的影響

在造模后當(dāng)天（0 d），模型組、龜板固本方組、西藥組的小鼠外周血白細(xì)胞（WBC）下降，均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組、龜板固本方組與西藥組的小鼠外周血WBC 組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明造模成功。用藥干預(yù)7 d后，龜板固本方組的WBC明顯高于干預(yù)前（0 d）（P＜0.05），也高于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示龜板固本方能顯著提升骨髓抑制小鼠的外周血白細(xì)胞。西藥組WBC 明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這跟西藥組使用粒細(xì)胞刺激因子注射液有關(guān)，見表1。

表1 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠外周血白細(xì)胞的影響（±s，×109/L）

表1 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠外周血白細(xì)胞的影響（±s，×109/L）

注：造模后0 d，與空白組比較，①P＜0.01；造模后8 d，與模型組比較，②P＜0.05；與西藥組比較，③P＜0.01；龜板固本方干預(yù)前后比較，④P＜0.05。

造模后8 d 6.54±1.25③2.34±0.78③3.92±0.64②③④17.8±3.95分組空白組模型組龜板固本方西藥組例數(shù)15 15 15 15造模后0 d 6.84±1.23 2.11±0.86①2.14±0.63①2.30±0.52①

在造模后當(dāng)天（0 d），模型組、龜板固本方組、西藥組的小鼠外周血血小板（PLT）下降，均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組、龜板固本方組與西藥組的外周血PLT 組間比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功。用藥干預(yù)7 d后，龜板固本方組的血小板明顯高于模型組（P＜0.01），與干預(yù)前比較，龜板固本方干預(yù)后，小鼠外周血血小板明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示龜板固本方能顯著提升骨髓抑制小鼠的外周血血小板，見表2。

表2 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠外周血血小板的影響（±s，×109/L）

表2 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠外周血血小板的影響（±s，×109/L）

注：造模后0 d，與空白組比較，①P＜0.01；造模后8 d，與模型組比較，②P＜0.01；龜板固本方干預(yù)前后比較，③P＜0.01。

造模后8 d 分組 例數(shù) 造模后0 d 653.60±86.71 209.60±41.10 390.13±72.04②③337.40±50.16空白組模型組龜板固本方西藥組15 15 15 15 652.53±85.43 252.93±63.97①268.20±56.64①237.47±30.76①

在造模后當(dāng)天（0 d），模型組、龜板固本方組、西藥組的小鼠外周血紅細(xì)胞（RBC）下降，均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），模型組、龜板固本方組與西藥組的外周血RBC 組間比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功。用藥干預(yù)7 d后，龜板固本方組的RBC明顯高于模型組（P＜0.01）；與干預(yù)前比較，龜板固本方干預(yù)后，小鼠紅細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示龜板固本方能顯著提升骨髓抑制小鼠的外周血紅細(xì)胞，見表3。

表3 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠外周血紅細(xì)胞的影響（±s，×1012/L）

表3 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠外周血紅細(xì)胞的影響（±s，×1012/L）

注：造模后0 d，與空白組比較，①P＜0.01；造模后8 d，與模型組比較，②P＜0.01；龜板固本方干預(yù)前后比較，③P＜0.05。

造模后8 d 9.88±0.99 5.13±0.74 6.35±1.33②③4.98±0.90分組空白組模型組龜板固本方西藥組例數(shù)15 15 15 15造模后0 d 10.16±1.84 5.72±1.24①5.07±1.23①5.15±2.49①

3.2 龜板固本方對(duì)肺癌骨髓造血微環(huán)境細(xì)胞因子GM-CSF、EPO和TPO的影響

用藥干預(yù)7 d后，與空白組相比，模型組、龜板固本方組和西藥組的GM-CSF 及EPO 含量明顯減少（P＜0.01），TPO 明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，龜板固本方能明顯提高GM-CSF、EPO及TPO含量（P＜0.01），降低TPO含量（P＜0.01）。

表4 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓造血細(xì)胞因子G-CSF、EPO和TPO的影響（±s）

表4 龜板固本方對(duì)骨髓抑制小鼠骨髓造血細(xì)胞因子G-CSF、EPO和TPO的影響（±s）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01。

分組空白組模型組龜板固本方西藥組TPO 28.60±9.12 159.67±30.32①61.93±14.73①②53.53±6.93①例數(shù)15 15 15 15 G-CSF 209.00±29.15 120.73±23.77①144.33±29.72①146.87±44.99①EPO 75.40±8.93 43.53±13.22①62.07±11.98①②47.40±17.59①

4 討論

機(jī)體正常的造血活動(dòng)依賴于造血干細(xì)胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）和支持造血干細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的骨髓微環(huán)境的相互作用。骨髓微環(huán)境是指造血干細(xì)胞能維持自身細(xì)胞系特征的特殊環(huán)境組成的組織區(qū)域，是造血干細(xì)胞賴以生存，進(jìn)行自我更新，并能產(chǎn)生大量祖細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境。它包括微血管系統(tǒng)、基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞因子[4]。骨髓微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)于造血細(xì)胞的自我更新及快速增殖至關(guān)重要[5]。造血干細(xì)胞能保持自我更新與多向分化增殖能力，與骨髓微環(huán)境細(xì)胞因子調(diào)控分不開。造血微環(huán)境是造血干細(xì)胞賴于生存的基礎(chǔ)，與造血生成調(diào)控密切相關(guān)。造血干細(xì)胞在骨髓微環(huán)境各種因素的調(diào)控下增殖、分化、發(fā)育及成熟。特別是促紅細(xì)胞生成素（EPO），血小板生成素（TPO）和粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是造血微環(huán)境中重要的造血調(diào)控細(xì)胞因子，參與調(diào)控骨髓造血祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟。EPO 是調(diào)節(jié)紅系生成的主要細(xì)胞因子，主要調(diào)控紅系造血干細(xì)胞的增殖、分化和成熟；TPO主要促進(jìn)巨核系祖細(xì)胞增殖，促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖與分化成熟，以及血小板的成熟和釋放；G-CSF 能選擇性和特異性地刺激造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞的定向增殖和分化，動(dòng)員造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血，并可加速粒細(xì)胞成熟。研究骨髓微環(huán)境細(xì)胞因子對(duì)造血細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞系維持具有重要意義。

中醫(yī)理論認(rèn)為，脾為后天之本，是氣血生化之源，脾虛則血生化無(wú)源；腎為先天之本，藏精主髓生血，腎虛則髓海不足而血不能化。若脾腎虧虛，則氣血生成不足?；熕碌墓撬枰种?，可歸為中醫(yī)“虛勞”范疇，其基本病機(jī)為脾腎虧虛，精虧髓損。對(duì)于化療所致骨髓抑制的治療原則以健脾益腎法為主。研究表明，中醫(yī)健脾補(bǔ)腎法能夠改善骨髓造血功能，具有較好的生血作用，能有效調(diào)節(jié)血清中TPO、EPO、GM-CSF 的表達(dá)，從而促進(jìn)骨髓抑制小鼠造血功能的恢復(fù)[6-9]；還能明顯改善肺癌化療者骨髓造血功能，提高外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白及血小板等。因此，從健脾補(bǔ)腎，填精益髓的治法入手來(lái)研究骨髓抑制的治療，具有較好的中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)、臨床基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的支持。

龜板固本方是本研究課題組治療腫瘤相關(guān)性貧血的有效經(jīng)驗(yàn)方，主要藥物由龜板、黃精、桑椹、黃芪、紅參等組成，方中龜板性味甘咸，歸腎經(jīng)，為血肉有情之品，峻補(bǔ)精髓，補(bǔ)腎養(yǎng)陰；黃精性味甘平，歸脾腎經(jīng)，滋腎補(bǔ)脾益氣；桑椹子味甘，歸肝腎經(jīng)，滋陰補(bǔ)血，有滋補(bǔ)肝腎及補(bǔ)血之效；黃芪性甘，微溫，歸脾肺經(jīng)，補(bǔ)中益氣，補(bǔ)氣以生血；紅參味甘、微苦，性溫，能大補(bǔ)元?dú)?，益血生津。諸藥合用，具有健脾補(bǔ)腎，填精益髓的功效，切中骨髓抑制的中醫(yī)發(fā)病機(jī)理。在本課題組臨床研究中，利用龜板固本方治療相關(guān)性貧血進(jìn)行臨床觀察，研究結(jié)果表明，龜板固本方治療腫瘤相關(guān)性貧血，能夠提高外周血象中血紅蛋白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞比容，療效顯著（P ＜0.05）[1]。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，龜板固本方對(duì)肺癌化療引起的骨髓抑制有較好的拮抗作用，減輕化療患者外周血象中白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板的下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），化療患者口服龜板固本方治療后，生存質(zhì)量卡氏評(píng)分明顯提高，療效優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05）[2]。龜板固本方改善腫瘤相關(guān)性貧血及拮抗化療引起的骨髓抑制具有較好的療效。

采用環(huán)磷酰胺腹腔注射是制備小鼠骨髓抑制模型的成熟方法，造模成功后，小鼠外周血細(xì)胞下降[3，7，9，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠骨髓抑制造模后，外周血WBC、RBC 和PLT 均明顯下降，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），說明造模成功。經(jīng)過龜板固本方干預(yù)7 d后，骨髓抑制小鼠外周血常規(guī)的WBC、RBC、PLT 明顯升高，與干預(yù)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01或P ＜0.05）。與模型組比較，龜板固本方組小鼠外周血常規(guī)的WBC、RBC、PLT 明顯升高，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。進(jìn)一步研究表明，經(jīng)過龜板固本方干預(yù)后，龜板固本方組骨髓抑制小鼠骨髓微環(huán)境促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）和粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）含量上升，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。這些研究結(jié)果說明龜板固本方具有減輕骨髓抑制和促進(jìn)骨髓造血的功能。龜板固本方治療肺癌化療后骨髓抑制的機(jī)理除了切合骨髓抑制的中醫(yī)病機(jī)以外，初步認(rèn)為其機(jī)制可能是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的：龜板固本方通過調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的造血因子，通過提升造血因子的含量，修復(fù)骨髓造血微環(huán)境損傷，保護(hù)造血干細(xì)胞的作用，從而促進(jìn)骨髓造血機(jī)能修復(fù)，達(dá)到提升外周血中三系細(xì)胞，減輕化療藥物的副作用。但由于機(jī)體造血機(jī)制十分復(fù)雜，涉及造血干細(xì)胞自我擴(kuò)增、造血微環(huán)境、免疫功能和多個(gè)造血調(diào)控通路等，究竟龜板固本方是否通過其他途徑改善骨髓造血功能，仍需進(jìn)一步深入研究。