固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測(cè)定運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸的含量

陳 瓊,黃樹楷,黃 盼,許偉沂,龍 梓,彭麗詩

(仙樂健康科技股份有限公司,廣東汕頭 515041)

葉酸(folic acid,FA)即維生素B11,是蝶呤衍生物,也稱作蝶呤酰谷氨酸(pteroylglutamic acid,PGA),它可為核苷酸生物合成、氨基酸代謝和脫氧核糖核酸(DNA)甲基化提供單碳基團(tuán),能促進(jìn)骨髓中造血幼細(xì)胞成熟,是所有生物機(jī)體細(xì)胞繁殖和胎兒的發(fā)育生長(zhǎng)必需的維生素,故葉酸的缺乏可導(dǎo)致心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、誘發(fā)癌癥等,如巨幼紅細(xì)胞貧血、白血球減少癥、新生兒神經(jīng)管畸形、智力退化、免疫力降低等[1-7]。因此,在許多的食品中,尤其是營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品都把葉酸作為重要的添加物質(zhì)。

通常運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中,葉酸的添加量低,基質(zhì)較為復(fù)雜,常見配方中不僅含有牛奶、乳清及大豆等高蛋白的配料,而且還附帶谷物、水果等干擾成分,因此樣品前處理難度較大。而目前測(cè)定葉酸常用的方法有:比色法[8-10]、薄層層析法[11]、微生物法[12-16]和色譜分析法[17-23]等,其中比色法、薄層層析法雖操作相對(duì)簡(jiǎn)單,但對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品而言易受干擾,導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確度不高。微生物法是經(jīng)典方法,GB5009.211-2014 《食品中葉酸的測(cè)定》和EN 14131-2013 《Foodstuffs Determination of folate by microbiological assay》采用微生物法進(jìn)行測(cè)定,靈敏度高,但也存在著許多的局限性,如實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng),方法重復(fù)性差,受樣品中抑菌成分的影響等[24]。AOAC-2011.06測(cè)定嬰兒配方奶粉和成人營(yíng)養(yǎng)素中的總?cè)~酸采用LC-MS/MS法,但由于液質(zhì)法存在基質(zhì)效應(yīng),會(huì)影響其穩(wěn)定性和結(jié)果重現(xiàn)性[25-26],且液質(zhì)相對(duì)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),操作較為繁瑣。液相色譜法實(shí)現(xiàn)了葉酸與其他成分的分離,特異性高,但通常運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸的添加量較其他水溶性維生素低,若使用紫外檢測(cè)器時(shí)須加大取樣量,從而造成較為嚴(yán)重的干擾[27]。綜上,開發(fā)出操作便捷、靈敏度高、方法重復(fù)性及專屬性好的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品葉酸測(cè)定方法,有著重要的意義。

本文在現(xiàn)有的檢測(cè)方法基礎(chǔ)上,考察了沉淀蛋白法、酶解蛋白法、固相萃取法三種樣品前處理方法對(duì)比,并優(yōu)化了提取溶劑與流動(dòng)相的條件,以最優(yōu)條件對(duì)運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸進(jìn)行富集和純化,再讓弱熒光效應(yīng)的葉酸經(jīng)色譜柱分離,利用柱后衍生儀使葉酸與強(qiáng)氧化劑過二硫酸鉀進(jìn)行反應(yīng)生成有強(qiáng)熒光性的蝶呤-6-羧酸(如圖1),最后通過熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)曲線法定量。

圖1 葉酸的氧化反應(yīng)方程式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

運(yùn)動(dòng)能量棒(標(biāo)簽葉酸含量19 μg/g)、運(yùn)動(dòng)代餐粉(標(biāo)簽葉酸含量15 μg/g)、運(yùn)動(dòng)代餐奶昔(標(biāo)簽葉酸含量21 μg/g) 天貓旗艦店;反相弱陰離子交換Strata-X-AW固相萃取小柱(60 mg/3 mL) 美國(guó)Phenomenex公司;反相硅膠吸附C18固相萃取小柱(20 cc)、混合模式陰離子交換 Oasis MAX固相萃取小柱(20 cc) 美國(guó)Waters公司;葉酸標(biāo)準(zhǔn)品 含量95.3%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈 色譜純,美國(guó)TEDIA公司;磷酸二氫鉀、磷酸、氨水 色譜純,德國(guó)CNW公司;鹽酸 分析純,西隴科學(xué);甲醇 分析純,廣州化學(xué)試劑廠。

1260型高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司；Pinnacle PCX柱后衍生儀 美國(guó)Pickering公司;Tissuelyser-24冷凍研磨 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;CASCADA I型超純水機(jī) 美國(guó)PALL公司;XS205DU型分析天平 瑞士METTLER-TOLEDO公司;UNIVERSAL 320R型離心機(jī) 德國(guó)Hettich公司;DZKW-D-2型水浴鍋 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制 提取劑:取2.5 mL濃氨水,加水約950 mL,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.5,加水定容至1000 mL。

50 mmol磷酸二氫鉀(pH3.5):取磷酸二氫鉀6.8 g溶于950 mL水中,用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5,加水定容至1000 mL。

5%過二硫酸鉀溶液:取5 g過二硫酸鉀,加水定容至1000 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)曲繪制 精密稱取50 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL容量瓶中,用提取劑溶解并稀釋得到濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋得到濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液適量,按色譜條件進(jìn)樣分析,根據(jù)保留時(shí)間定性,標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1.2.3 樣品前處理方法的選擇

1.2.3.1 沉淀蛋白法 準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的試樣于燒杯中,用提取劑溶液60 ℃溶解后,轉(zhuǎn)入容量瓶中。加入10 mL 13%高氯酸溶液,混合均勻后靜止20 min。用提取劑定容至刻度,混勻離心,上清液過0.45 μm微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.2.3.2 酶解蛋白法 準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的試樣于離心管中,加入適量蛋白酶與α-淀粉酶,提取溶劑適量,37 ℃水浴振搖2 h,轉(zhuǎn)入容量瓶中,用提取劑定容至刻度,混勻過濾,濾液過0.45 μm微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.2.3.3 流動(dòng)相優(yōu)化 選用50 mmol/L磷酸二氫鉀水溶液∶乙腈=90∶10 (V/V)為流動(dòng)相,保持流動(dòng)相比例不變,用磷酸分別調(diào)50 mmol/L磷酸二氫鉀水溶液的pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.4 樣品溶液的制備 由于運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中通常含有谷物粒、堅(jiān)果碎、水果粒等顆粒較大的成分,且樣品本身黏度較大,若直接用粉碎機(jī)粉碎,會(huì)造成樣品粉碎不均勻且易黏附粉碎刀頭,造成卡機(jī)。本試驗(yàn)采取液氮冷凍的方式對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,再用冷凍球型研磨儀進(jìn)行粉碎,保證了樣品粉碎的均勻性。樣品前處理具體操作如下:精密稱取經(jīng)液氮冷凍粉碎均勻的樣品5～10 g至50 mL燒杯中,加入約25 mL提取劑,60 ℃水浴20 min,溶解后冷卻至室溫,用氨水或鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0±0.5,超聲提取10 min,時(shí)時(shí)振搖,轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶,用提取劑定容至刻度,5000 r/min離心10 min,精密吸取樣品上清液溶液1 mL,上樣于反相弱陰離子交換Strata-X-AW固相萃取小柱(依次用2 mL甲醇和2 mL水活化),待自然流干后,依次加入1 mL的25 mmol乙酸銨溶液(pH6～7)、1 mL甲醇淋洗柱床,棄去洗脫液。再每次用1 mL 5% NH4OH甲醇溶液進(jìn)行洗脫2次,待自然流干后,吹出柱床內(nèi)所有溶液并收集洗脫液,60 ℃以下氮吹至干,加提取劑定容至1 mL,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,待測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)注意避光操作。

1.2.5 色譜條件 檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)365 nm,發(fā)射波長(zhǎng)440 nm;柱前流動(dòng)相:50 mmol磷酸二氫鉀(pH3.5)∶乙腈=90∶10;流速:1.0 mL/min;色譜柱:Venusil MP C18,4.6 mm×250 mm,5.0 μm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;柱后衍生劑:5%過二硫酸鉀溶液;衍生體積:0.5 mL;衍生溫度:60 ℃;衍生儀流速:0.3 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜結(jié)果積分處理采用1260型高效液相色譜儀配套的Agilent ChemStation色譜工作站,并利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 沉淀蛋白法 高蛋白含量樣品的前處理中,沉淀蛋白并提取目標(biāo)物是最常用手段,而效果較佳常見的蛋白沉淀劑有亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、三氯乙酸和高氯酸等。亞鐵氰化鉀和乙酸鋅混合會(huì)生成亞鐵氰化鋅,可與蛋白質(zhì)共沉淀,但同時(shí)也會(huì)與少部分葉酸結(jié)合沉淀,造成目標(biāo)物的損失。而三氯乙酸則會(huì)破壞葉酸的蝶啶環(huán),使后續(xù)氧化衍生無法進(jìn)行,高氯酸既可兼顧除蛋白質(zhì),又可保證葉酸的蝶啶環(huán)不被破壞,故選擇高氯酸沉淀劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3組平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表1,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉淀蛋白法回收率在78.7%～88.4%之間,去除蛋白效果雖好,但仍有部分目標(biāo)物損失,可能原因是在低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH下,蛋白質(zhì)陽離子與高氯酸陰離子下形成難溶性鹽,蛋白變性從而沉淀,該沉淀形成過程迅速,導(dǎo)致沉淀物內(nèi)部包裹住少量葉酸分子,形成包埋,導(dǎo)致部分葉酸損失。

表1 沉淀蛋白法測(cè)定葉酸含量

2.1.2 酶解蛋白法 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2,酶解樣品色譜圖見圖3,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白被酶解成多肽、氨基酸等亦進(jìn)入樣品溶液,使目標(biāo)峰被干擾,酶解法前處理效果不理想?？赡艿脑?yàn)榈鞍酌甘敲附獾鞍鬃畛Ｒ姷拿钢?其作用機(jī)理是識(shí)別肽鍵兩側(cè)的氨基酸殘基的特定R基,與之結(jié)合使肽鍵斷裂[28],從而使蛋白大分子瓦解。而淀粉酶是重要的淀粉水解酶,其作用于淀粉時(shí)從淀粉分子的內(nèi)部切開α-1,4糖苷鍵,生成糊精和還原糖[29-30],水解下來的小分子在該激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)下同樣有熒光吸收,從而造成了目標(biāo)峰被干擾。

圖2 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖3 酶解法樣品色譜圖

2.1.3 固相萃取法(C18、MAX、STRATA-X-AW) 固相萃取能有效地將分析物與干擾組分分離,減少目標(biāo)色譜峰的干擾,是分離凈化常用手段。選用市售C18小柱、MAX小柱、STRATA-X-AW小柱對(duì)運(yùn)動(dòng)能量棒樣品溶液進(jìn)行SPE純化,結(jié)果以目標(biāo)物的加標(biāo)回收率作為比較依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比其他兩款小柱,反相弱陰離子STRATA-X-AW小柱對(duì)樣品提取液的凈化效果最好,加標(biāo)回收率最高,主要是因?yàn)樵谌跛嵝詶l件下,STRATA-X-AW小柱能夠吸附具有一定酸性的葉酸目標(biāo)物,淋洗雜質(zhì)后,再進(jìn)行洗脫,洗脫液較為干凈,雜質(zhì)少,起到很好的凈化效果。

表2 不同固相萃取柱回收率

圖4 STRATA-X-AW小柱凈化樣品色譜圖

2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

葉酸水溶性較差,水中溶解度只有1.6 μg/mL,常用0.5%氨水溶液(pH約10)作為提取劑使葉酸轉(zhuǎn)化成葉酸鹽,增加其溶解度及穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液的pH對(duì)衍生反應(yīng)產(chǎn)物保留能力及穩(wěn)定性有一定的關(guān)聯(lián),分離結(jié)果表明,流動(dòng)相pH在2.0～3.5時(shí),pH越小葉酸的保留時(shí)間越往后延,且此時(shí)體系緩沖能力不夠,從而導(dǎo)致重復(fù)性不佳。當(dāng)pH在3.5以上對(duì)葉酸的保留時(shí)間影響較小,重復(fù)性仍然不佳。但是pH越大,基線越不平穩(wěn)。而低pH對(duì)色譜柱、色譜系統(tǒng)的壽命也有影響。當(dāng)pH=3.5時(shí),體系緩沖能力剛好能符合重復(fù)性要求。綜合考慮,實(shí)驗(yàn)使用鹽酸調(diào)節(jié)其提取劑pH為8.5,同時(shí)選用pH為3.5的磷酸二氫鉀水溶液∶乙腈=90∶10 (V/V)作為流動(dòng)相,既能使得目標(biāo)溶液處于緩沖液能力范圍內(nèi),保留時(shí)間穩(wěn)定,又能使得基線穩(wěn)定,對(duì)色譜系統(tǒng)無影響,能滿足檢測(cè)色譜條件要求。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與儀器定量限 在最佳色譜條件下,檢測(cè)一系列葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2～2.0 μg/mL),以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)方法在0.232～2.318 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=12.496x-0.04687,決定系數(shù)R2=0.9971。以10倍信噪比(S/N)計(jì)算,進(jìn)樣量為10 μL,該方法的儀器定量限為0.0774 μg/mL。

2.3.2 重復(fù)性、專屬性及回收率 按最佳色譜條件,對(duì)市售運(yùn)動(dòng)能量棒樣品進(jìn)行6 次檢測(cè)。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性較好,峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%,測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定。分別取陰性樣品各9份,每份5 g,分成3組,每組平行3個(gè)樣,加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,分別配制成與待測(cè)樣品中葉酸80%、100%、120%含量的回收率樣品,按照方法測(cè)定葉酸含量,測(cè)定結(jié)果如表3,回收率在96.98%～100.50%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.98%～3.76%之間,方法回收率良好,準(zhǔn)確度較高,陰性樣品未檢出,見圖5,適用于不同基質(zhì)葉酸的測(cè)定。

表3 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

圖5 陰性樣品色譜圖

2.3.3 溶液穩(wěn)定性 每隔適當(dāng)時(shí)間測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度為1.2 μg/mL)葉酸濃度的百分比及市售樣品葉酸含量的百分比,考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果如表4,在該實(shí)驗(yàn)條件下,標(biāo)準(zhǔn)品溶解和三款運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品能在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定(98.54%～102.90%),可滿足檢測(cè)要求。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本文開發(fā)了固相萃取-HPLC柱后氧化衍生熒光法測(cè)定運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸含量的方法。分別考察了沉淀蛋白法、酶解蛋白法及固相萃取法的樣品前處理方式及流動(dòng)相的優(yōu)化條件,樣品經(jīng)反相弱陰離子固相萃取小柱純化,C18色譜柱分離,柱后衍生儀氧化衍生后,再經(jīng)熒光檢測(cè)器,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明,在0.232～2.318 μg/mL范圍內(nèi)方法線性良好,R2=0.9971,進(jìn)樣量為10 μL,方法的儀器定量限為0.0774 μg/mL,靈敏度足以滿足運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸的檢測(cè)需要,方法回收率在96.98%～100.50%之間,標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。本方法很好地解決復(fù)雜基質(zhì)的運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸的提取、凈化除雜等問題。操作方便快捷,結(jié)果準(zhǔn)確,線性范圍廣,靈敏度高,重現(xiàn)性、專屬性、回收率及穩(wěn)定性較為滿意,能夠滿足運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品中葉酸含量檢測(cè)的需求。