食源性微生物檢測(cè)及溯源研究進(jìn)展

粟麗千,張 倫,王 建,盧雪梅,*

(1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,廣東廣州 510006;2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510006;3.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510006)

食源性疾病是指經(jīng)攝食進(jìn)入人體的各類致病因子引起的一類疾病,通常包括食物中毒、腸道傳染病、人獸共患病等,這類疾病常伴隨中毒癥狀且具有一定的傳染性,是當(dāng)前人們廣泛關(guān)注的衛(wèi)生問題[1]。世界衛(wèi)生組織對(duì)2010年全球食源性疾病負(fù)擔(dān)的評(píng)估報(bào)告中指出:食源性致病微生物是引起人類患食源性疾病的最主要原因,食源性疾病造成的全球負(fù)擔(dān)與艾滋病毒、瘧疾及結(jié)核病等傳染病相當(dāng)[2]。

食源性致病微生物被認(rèn)為是伴隨食品生產(chǎn)及供應(yīng)的整個(gè)過程中出現(xiàn)的,造成食品污染、腐壞及變質(zhì)的生物因素,這類微生物以食物為媒介在人群及環(huán)境中廣泛傳播,可導(dǎo)致人體惡心、嘔吐、胃痛、腹瀉等,嚴(yán)重時(shí)可損傷臟器甚至誘發(fā)中毒性休克[3-4]。例如,志賀氏菌(又稱痢疾桿菌)經(jīng)侵襲作用進(jìn)入人體腸道后,可通過內(nèi)毒素及外毒素的雙重作用破壞腸粘膜而引發(fā)人體腸道疾病,臨床癥狀常表現(xiàn)為機(jī)體發(fā)熱、腹痛腹瀉、心衰等[5]。食源性致病微生物大體上可分為三類:一是致病菌,如鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等;二是致病性病毒,如輪狀病毒、冠狀病毒、諾如病毒等;三是寄生蟲,如豬帶絳蟲、旋毛蟲、蛔蟲等[6]。

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)及溯源方法通常是根據(jù)微生物基因型及表型進(jìn)行檢測(cè)或分型,包括培養(yǎng)基分離、形態(tài)觀察、生化鑒定、抗生素耐性分析及血清學(xué)分型等[7-8]。由于食品中存在多種致病微生物,因此檢測(cè)前通常需要對(duì)微生物進(jìn)行選擇性富集并分離,該過程不僅操作繁瑣、耗時(shí)長,且難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中多種微生物同時(shí)檢測(cè)[9]。因此,探索更為高效簡便的新型食源性微生物檢測(cè)及溯源方法對(duì)預(yù)防食源性微生物中毒、快速鎖定致病源并控制疾病傳播具有重要的意義。本文對(duì)近幾年出現(xiàn)的食源性致病微生物的檢測(cè)及溯源方法進(jìn)行綜述,并對(duì)這些新技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡要介紹,為食品安全監(jiān)管提供一定的技術(shù)支撐和參考。

1 食源性微生物檢測(cè)方法

1.1 免疫學(xué)檢測(cè)法

免疫學(xué)檢測(cè)法是利用抗原抗體間特異性結(jié)合的基本原理進(jìn)行微生物檢測(cè),不同的微生物有其特異的抗原,并能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體。基于此,可制備特異性單克隆抗體檢測(cè)微生物的特異抗原,也可利用相應(yīng)的微生物抗原檢測(cè)體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體。免疫學(xué)檢測(cè)法主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫層析技術(shù)(immunochromatography assay,ICA)、免疫磁性分離技術(shù)(immunomagnetic separation,IMS)及免疫熒光(immunofluorescence)技術(shù)[10-11]。

免疫磁性分離技術(shù)又稱免疫磁珠分離技術(shù),該項(xiàng)技術(shù)與其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合可在致病菌的檢測(cè)過程中發(fā)揮更大的作用[12]。例如,呂觀等[13]利用免疫磁珠結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的方法檢測(cè)牛肉中的鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后,所建立的方法在富集5 h后對(duì)牛肉中的鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)限可達(dá)1.2 CFU/mL;富集7 h后,金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限可達(dá)4.4 CFU/mL。在眾多的免疫檢測(cè)方法中,標(biāo)記的免疫層析技術(shù)應(yīng)用較為普遍,包括膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)、石墨烯標(biāo)記的免疫層析技術(shù)、磁性納米標(biāo)記的免疫層析技術(shù)及量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫層析技術(shù)[14-15]。

表1列出了常見的免疫學(xué)檢測(cè)法在食源性微生物檢測(cè)中的應(yīng)用舉例?；诿庖邔W(xué)的檢測(cè)方法最突出優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)特異性高,Zhang等[24]基于雞抗蛋白A IgY和任意非特異性哺乳動(dòng)物IgG的雙重識(shí)別作用來檢測(cè)金黃色葡萄球菌,通過優(yōu)化體系,在未經(jīng)富集的100 μL PBS溶液中,金黃色葡萄球菌的檢測(cè)下限可達(dá)11 CFU/mL,線性范圍為5.0×102～5.0×104CFU/mL,整個(gè)檢測(cè)過程在90 min內(nèi)即可完成。這種檢測(cè)方法不僅特異性強(qiáng),而且操作簡便,為食品樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)開辟了一條新的途徑。

表1 常見免疫學(xué)檢測(cè)法應(yīng)用舉例

1.2 分子檢測(cè)法

分子檢測(cè)法主要是對(duì)微生物遺傳信息擴(kuò)增并檢測(cè)比對(duì),包括PCR及其各類衍生技術(shù)、DNA探針技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(nuclear acid sequence-based amplification,NASBA)、DNA微陣列(又稱基因芯片)技術(shù)等[25-28]。

在各類PCR檢測(cè)方法中,多重PCR(multiple PCR)在檢測(cè)的靈敏度及特異性方面有著獨(dú)到的優(yōu)勢(shì),具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡便性,可以同時(shí)檢測(cè)或鑒定多種病原微生物,已廣泛用于各類食品中微生物檢測(cè)[29-30]。但由于PCR對(duì)檢測(cè)樣品中的靶微生物濃度要求較高,因此檢測(cè)前通常需要將其富集以制備出高質(zhì)量的DNA,這部分工作通常費(fèi)時(shí)費(fèi)力[31]。常用的方法有選擇性培養(yǎng)增殖、離心、過濾或免疫吸附富集等方法。此外,數(shù)字PCR(digital PCR)是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù),將DNA或cDNA樣品分割為許多單獨(dú)、平行的PCR反應(yīng)來稀釋背景,從而實(shí)現(xiàn)更高的檢測(cè)靈敏度、分辨率、速度和精密度[32]。

無法分辨存活和死亡的微生物是傳統(tǒng)PCR法的一個(gè)主要缺點(diǎn),這會(huì)導(dǎo)致誤導(dǎo)性結(jié)果的產(chǎn)生。為了彌補(bǔ)這一缺陷,在提取DNA前,研究人員使用生物染料如單疊氮乙錠(ethidium bromide monoazide,EMA)或單疊氮丙啶(propidium monoazide,PMA)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,使EMA/PMA嵌入死亡細(xì)胞的DNA中并與之共價(jià)結(jié)合,隨后再按照常規(guī)方法進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增分析,死細(xì)胞DNA擴(kuò)增反應(yīng)被強(qiáng)烈抑制,這樣可有效區(qū)分活細(xì)胞及死細(xì)胞的DNA[33]。目前,科學(xué)家已將該項(xiàng)技術(shù)用于檢測(cè)各種微生物,包括食品和環(huán)境中的細(xì)菌細(xì)胞和孢子、真菌、病毒和酵母等[34]。Kragh等[35]利用PMA長擴(kuò)增的方法建立了對(duì)食品中加工和熱處理的單核細(xì)胞增生性李斯特菌活菌的定量PCR方法。Miotto等[36]評(píng)估了不同濃度PMA在不同光照時(shí)間和光照強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞懸液和食物基質(zhì)中大腸桿菌細(xì)胞的影響,確定了PMA濃度為50 μmol/L、光強(qiáng)650 W下處理15 min為大腸桿菌PMA-qPCR定量檢測(cè)的最優(yōu)條件。盡管EMA/PMA-PCR能有效區(qū)分活菌和死菌,但EMA/PMA-PCR的操作程序較為繁瑣。Soejima等[37]創(chuàng)新性地使用鉑化合物對(duì)水和牛奶中的活微生物和死亡微生物進(jìn)行區(qū)分,鉑化合物與EMA/PMA作用機(jī)理類似,但使用鉑化物的PCR法更為簡便快速。Canh等[38]使用脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate,SD)預(yù)處理以提高EMA、PMA和順式二氯二胺-鉑金(cis-dichlorodiammineplatinum,CDDP)在RT-PCR方法中對(duì)病毒的定量效率,結(jié)果表明,SD預(yù)處理能有效增強(qiáng)3種活性標(biāo)志物對(duì)病毒的穿透能力,且以SD預(yù)處理的CDDP-RT-qPCR方法最能反映病毒的感染性。

1.3 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是將生物分子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可定量觀測(cè)的其他信號(hào)并進(jìn)行放大的技術(shù),主要由感受器和能量轉(zhuǎn)換器兩部分構(gòu)成。生物傳感器的原理為待測(cè)物質(zhì)經(jīng)感受器時(shí)與感受器上的敏感原件結(jié)合,這些敏感材料通常是具有生物活性的酶、抗原、抗體、細(xì)胞、微生物等,后經(jīng)適當(dāng)?shù)哪芰哭D(zhuǎn)換將待測(cè)物質(zhì)的濃度信息轉(zhuǎn)化為光、電、聲等信號(hào)并進(jìn)行放大傳輸,最終在顯示器上輸出[39]。近年來,由固定化生物敏感材料作為識(shí)別元件的傳感器用于微生物檢測(cè)的技術(shù)相繼報(bào)道,尤其是電化學(xué)生物傳感技術(shù),已廣泛地應(yīng)用于各類病原體的檢測(cè)[40]。Zhang等[41]將大腸桿菌16S rDAN上的某一特定可變序列作為生物標(biāo)記物,以寡核苷酸探針和納米縫隙網(wǎng)絡(luò)電極為傳感元件,構(gòu)建了一種可快速靈敏檢測(cè)大腸桿菌的方法,檢測(cè)下限可達(dá)100 CFU/mL。

在過去的十幾年中,納米材料的出現(xiàn)為下一代生物傳感器的發(fā)展開辟了新的方向。Yin等[42]設(shè)計(jì)一種由胍基官能化上轉(zhuǎn)換熒光納米粒、鞣酸和過氧化氫組成的熒光納米傳感器,并將其成功應(yīng)用于食品中七種常見細(xì)菌的同時(shí)檢測(cè)。Nasrin等[43]基于金納米粒子(AuNPs)和熒光CdSe TeS量子點(diǎn)的局域表面等離子體共振行為,提出了一種對(duì)諾如病毒具有良好選擇性和靈敏度的無標(biāo)記傳感方法,該檢測(cè)方法能在低病毒濃度下進(jìn)行超靈敏檢測(cè),為開發(fā)高性能、高靈敏度的生物醫(yī)學(xué)病毒檢測(cè)傳感探針提供了技術(shù)支持。此外,通過結(jié)合納米材料的固有特性,在納米尺度上設(shè)計(jì)電極界面控制以增強(qiáng)其傳感能力,是近年生物傳感器研究的熱門話題,顯露出良好的開發(fā)潛力[44]。新興性能優(yōu)良的納米材料應(yīng)用于生物傳感器,不僅提高了生物傳感器的傳感能力,還使傳感器具備了微型化的能力,為開發(fā)水源性和食源性病原體的檢測(cè)提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持[45]。

1.4 儀器檢測(cè)法

用于微生物檢測(cè)的儀器法主要包括光譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)及色譜技術(shù)等。光譜技術(shù)具有非侵入和無損的特點(diǎn),不僅可以降低檢測(cè)成本,還可避免環(huán)境污染[46]。有“指紋圖譜”之稱的表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced raman scattering,SERS)在食源性微生物的檢測(cè)中具有分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[47]。Wu等[48]描述了一種基于適體的SERS技術(shù)用于檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的方法,該方法將拉曼報(bào)告分子4-巰基苯甲酸與適配子修飾的金納米顆粒(AuNPs)鏈接作為信號(hào)探針,并用鍍金聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜增強(qiáng)拉曼散射,該方法有效地簡化了分析過程,其檢測(cè)線性范圍為1.2×102～1.2×106CFU/mL,檢出限為12 CFU/mL。此外,近紅外光譜成像技術(shù)在食品的化學(xué)危害檢測(cè)、微生物危害檢測(cè)、物理危害檢測(cè)等安全評(píng)估中發(fā)揮著不可或缺的作用[49]。Tao等[50]利用可見光-近紅外光譜(visible-near-infrared,VIS-NIR)在400～2500 nm的光譜范圍內(nèi)檢測(cè)了去殼花生仁中黃曲霉毒素B的污染情況,利用不同范圍的全光譜數(shù)據(jù)建立偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型,對(duì)花生仁黃曲霉的污染進(jìn)行了有效的鑒定。

質(zhì)譜技術(shù)則更多地應(yīng)用于腐敗菌檢測(cè)領(lǐng)域,同時(shí)也可以檢測(cè)到革蘭氏陽性菌,讓食物中細(xì)菌有效分離并在質(zhì)譜上得到驗(yàn)證[51]。熟肉類產(chǎn)品的包裝通常存在細(xì)菌腐敗的風(fēng)險(xiǎn),Geeraerts等[52]利用質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合基因組DNA-PCR及基因測(cè)序的方法對(duì)熟火腿貯存過程中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析,得出麥芽糖桿菌、薩氏乳桿菌和變形沙雷氏菌是熟火腿中存在的主要細(xì)菌類型,且揮發(fā)物質(zhì)中的2,3-丁二醇、乙酸乙酯和乙醇等物質(zhì)可作為腐敗的標(biāo)志。

色譜技術(shù)不僅可用于檢測(cè)微生物本身,還更適用于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)[53-54]。食品中的真菌毒素,尤其是黃曲霉毒素,是最具代表性的微生物代謝產(chǎn)物,具有一定的毒性[55]。Frimpong等[56]利用高效液相色譜分析了從辣椒中分離到的22株產(chǎn)毒真菌菌株,其中有11株菌株屬于能產(chǎn)生黃曲霉毒素B1等有害物質(zhì)的曲霉菌屬、鐮刀菌屬和青霉菌屬。

近幾年來,幾種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn),已逐漸成為當(dāng)今主流檢測(cè)手段之一。如Najat等[57]采用頂空-固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技術(shù)檢測(cè)牛奶中沙門氏菌釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物,這種檢測(cè)方法可在37 ℃孵育5 h內(nèi)檢測(cè)和鑒定沙門氏菌。盡管儀器檢測(cè)法具有樣品消耗量低、分析檢測(cè)快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),但也存在樣品處理時(shí)間長、檢測(cè)難以標(biāo)準(zhǔn)化等不足[58]。

1.5 其他檢測(cè)方法

除上述幾種常見的檢測(cè)方法外,ATP生物發(fā)光技術(shù)及噬菌體檢測(cè)技術(shù)也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[59]。ATP生物發(fā)光技術(shù)通過檢測(cè)食品中微生物ATP總量以反映食品受污染的嚴(yán)重程度,不僅具有省時(shí)、便捷、可現(xiàn)場檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),還可用于大樣本檢測(cè)?？軙跃У萚60]采用免疫磁珠技術(shù)聯(lián)合ATP生物發(fā)光技術(shù)用于食品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌及金黃色葡萄球菌的檢測(cè),該法不僅顯著縮短了預(yù)增菌時(shí)間,還具有快速、低廉、易推廣的特點(diǎn)。張志杰[61]利用納米探針技術(shù)結(jié)合ATP生物發(fā)光技術(shù)設(shè)計(jì)了一種用于大腸桿菌檢測(cè)的新型生物傳感器,檢測(cè)可在20 min內(nèi)完成。ATP作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的代謝中間產(chǎn)物,一般情況下其含量較為穩(wěn)定,因此,通過測(cè)定樣品中的ATP含量即可間接獲得樣品中活菌總數(shù)。但若樣品中含有非細(xì)胞性ATP,則檢測(cè)結(jié)果易受影響[27]。

噬菌體是一種能夠感染并殺死微生物的病毒,通過噬菌體受體結(jié)合蛋白(receptor binding proteins,RBPs)與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合,噬菌體這種可特異性結(jié)合宿主的特點(diǎn)賦予了噬菌體很高的生物技術(shù)潛力[62]。近年來,結(jié)合分子生物學(xué)、免疫學(xué)、納米材料學(xué)及其他學(xué)科建立起來的新型噬菌體檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域中顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)。Xu等[63]設(shè)計(jì)了一種以野生型T4噬菌體為識(shí)別元件的新型電化學(xué)生物傳感器用于活病原菌的檢測(cè),該方法顯示出了區(qū)分活菌細(xì)胞和死亡細(xì)菌細(xì)胞的能力,在優(yōu)化固定化條件后,其檢測(cè)下限可達(dá)14±5 CFU/mL。噬菌體不僅具有體積小、結(jié)構(gòu)簡單、易侵襲、價(jià)格便宜等特點(diǎn),還具有區(qū)分活細(xì)菌及死細(xì)菌的能力,使得噬菌體及其代謝產(chǎn)物在病原微生物的檢測(cè)應(yīng)用中受到越來越多的關(guān)注[64]。

2 食源性微生物溯源技術(shù)

2.1 基因分型技術(shù)

近年來,用于微生物溯源檢測(cè)的基因型分型方法主要包括基于基因測(cè)序、基于酶切技術(shù)及基于PCR擴(kuò)增的分型方法。其中,基于基因測(cè)序的分型方法主要包括基于核心基因組多位點(diǎn)序列(core genome multi-locus sequence typing,cgMLST)分型技術(shù)及基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性(whole genome single nucleotide polymorphisms,wgSNP)分型技術(shù);基于PCR擴(kuò)增的分型方法主要包括基于多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(multiple locus variable-number tandem repeat analysis,MLVA)分型技術(shù)、基于規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)分型技術(shù)以及基于重復(fù)序列擴(kuò)增(repetitive sequence-based PCR,rep-PCR)分型技術(shù);基于酶切技術(shù)的分型方法主要是脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技術(shù)[65]。表2對(duì)這幾種分型方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了歸納,在實(shí)際應(yīng)用中,研究者應(yīng)當(dāng)綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)條件合理選擇分型方法。

表2 幾種基因分型技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

2.1.1 基因測(cè)序技術(shù) 基因測(cè)序技術(shù)是收集病原體的遺傳物質(zhì)并擴(kuò)增、測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析進(jìn)行溯源的方法。從1977年第一代DNA測(cè)序技術(shù),即雙脫氧鏈終止法發(fā)展至今,基因測(cè)序技術(shù)經(jīng)歷了一次又一次變革。按測(cè)序原理的不同,該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展可劃分為四個(gè)階段:第一代,雙脫氧鏈終止法,是現(xiàn)在應(yīng)用最多的核酸測(cè)序技術(shù),但這種方法通常耗時(shí)較長,通量低,成本高;第二代,高通量測(cè)序技術(shù),又稱下一代基因測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing,NGS),主要以邊合成邊測(cè)序技術(shù)為代表;第三代,單分子測(cè)序技術(shù),測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增;第四代,納米孔長讀長測(cè)序技術(shù)[69]。

傳統(tǒng)的多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法是根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫提供的引物來設(shè)計(jì)PCR以擴(kuò)增待檢測(cè)菌的高保守性管家序列,根據(jù)管家的基因型確定相應(yīng)的ST類型,通過比對(duì)這些管家基因序列的差異對(duì)菌株進(jìn)行分型[68]。閆瑞等[70]將7個(gè)位點(diǎn)的多位點(diǎn)序列(7-loci multilocus sequence typing,7-loci MLST)分型法對(duì)2438株克諾羅菌株進(jìn)行分析,定義了ST4、ST1、ST7和ST13四種主要序列型,由于MLST僅對(duì)選取的7個(gè)管家基因進(jìn)行分型,導(dǎo)致了同一ST型中包含了不相關(guān)菌株,因而溯源效果不佳。Ghanem等[71]將25個(gè)不同的滑膜支原體全基因組序列分成302個(gè)核心基因組,并將這302個(gè)核心基因組其作為cgMLST分型的靶基因(占MS基因組的35.5%),分型結(jié)果顯示,基于cgMLST的系統(tǒng)進(jìn)化樹分型結(jié)果與基于核心基因組單核苷酸多態(tài)性分析及現(xiàn)有的流行病學(xué)信息高度一致,且cgMLST的高分辨力允許在相同MLST類型的樣品之間進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。

與cgMLST類似,wgSNP則是比對(duì)細(xì)菌基因組中的單核苷多態(tài)性的差異而進(jìn)行分型的技術(shù)。Pisarenko等[72]使用wgSNP方法將1961～2016年間從俄羅斯西伯利亞地區(qū)收集的10株炭疽桿菌基因組與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的185株炭疽菌基因組進(jìn)行對(duì)比分析,確定了俄羅斯分離株在炭疽菌全球進(jìn)化系統(tǒng)中的重要地位。

WGS分型結(jié)果準(zhǔn)確率高,常用于臨床疾病診斷、流行病學(xué)研究、毒力基因及耐藥基因篩選[73]。2019年12月,中國湖北省武漢市爆發(fā)了由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所致的肺炎感染,武漢華南海鮮市場曾被認(rèn)為是疫情傳播的“萬惡之源”。Yu等[74]利用WGS對(duì)此次SARS-CoV-2病毒的進(jìn)化和傳播途徑進(jìn)行分析,研究學(xué)者們基于病毒樣本中的120個(gè)變異位點(diǎn)得到了58種單倍型,發(fā)現(xiàn)來自華南海鮮市場患者的病毒基因主要與H1單倍型有關(guān),而作為更古老的H3、H13以及H38單倍型樣本則來源于華南海鮮市場之外,提示武漢華南海鮮市場可能不是此次新型冠狀病毒的發(fā)源地。與傳統(tǒng)分型方法相比,WGS成本低、測(cè)序快,且不同地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室可以通過PulseNet公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分享[75-76]。當(dāng)前,由86個(gè)國家組成的PulseNet國際網(wǎng)絡(luò)已發(fā)展成為一個(gè)全球?qū)嶒?yàn)室網(wǎng)絡(luò),WGS也已成為該網(wǎng)絡(luò)中用于代替分子亞型檢測(cè)法的主要候選者[77],但通常用于WGS的儀器較為昂貴。

2.1.2 基于PCR擴(kuò)增的分型技術(shù) MLVA分型是擴(kuò)增微生物上多個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat,VNTR),擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后根據(jù)不同VNTR位點(diǎn)數(shù)目差異進(jìn)行分型[78]。Hosseini-Nave等[79]用PCR法檢測(cè)了37株腸道聚集性大腸桿菌(entero-aggregativeEscherichiacoli,EAEC)的11個(gè)毒力基因,并以MLVA分析這些菌株的遺傳親緣關(guān)系,發(fā)現(xiàn)EAEC屬于具有多種毒力因子的異質(zhì)性大腸桿菌群。王磊等[80]發(fā)現(xiàn),在一起致瀉性大腸埃希菌所致的感染疫情中,MLVA的分型結(jié)果和脈沖場凝膠電泳(PFGE)的分型結(jié)果一致,但MLVA具有更快速、更簡便、通量更高的特點(diǎn)。

典型的CRISPR-Cas系統(tǒng)通常包括前導(dǎo)序列、CRISPR陣列以及CRISPR相關(guān)蛋白編碼基因(CRISPR associated genes,cas)蛋白組成,CRISPR陣列中的間隔序列的插入或丟失等可準(zhǔn)確反應(yīng)致病菌菌株或血清型間的關(guān)系,因而可用于細(xì)菌分型和流行病學(xué)研究[68]。Xie等[81]用CRISPR分型法對(duì)中國2009～2017年間來自人和動(dòng)物的173株鼠傷寒沙門氏菌及其單相變異沙門氏菌進(jìn)行基因分型,發(fā)現(xiàn)TST4是ST34分離株中最常見的CRISPR型,并揭示豬是我國鼠傷寒沙門氏單相變異菌的主要宿主。

rep-PCR屬于自動(dòng)化的基因分型系統(tǒng),該方法通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌的非編碼重復(fù)序列,將擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳分離后通過分析軟件進(jìn)行分型[82]。Prasertsee等[83]使用rep-PCR分型法分析了從肉類食品和人類病例中分離出來的沙門氏菌血清型間的遺傳相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)從肉類樣品中分離到的沙門氏菌與人病例中的部分沙門氏菌具有完全相同的克隆。研究表明,rep-PCR對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌亞型的鑒別能力與PFGE分型方法類似,rep-PCR可作為單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌亞型的一種替代方法[84]。類似地,李雪等發(fā)現(xiàn),利用rep-PCR方法對(duì)溶藻弧菌分型與PFGE分型結(jié)果一致,且rep-PCR具有更廉價(jià)的特點(diǎn)[82]。

2.1.3 脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù) 脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型技術(shù)被認(rèn)為是沙門氏菌分型檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。用于微生物溯源的PFGE技術(shù)是通過采集患者糞便或其所接觸物品中的微生物,利用限制性內(nèi)切酶將病原微生物DNA切割成許多小片段,按我國流行病致病菌識(shí)別網(wǎng)的規(guī)范,經(jīng)脈沖凝膠電泳分離而對(duì)致病微生物分型[85]。整套的檢測(cè)流程通常包括致病菌的生化鑒定、血清型分析、PFGE電泳、核酸分析及藥敏性分析等[86-87]。因PFGE具有結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、成本低且易普及等優(yōu)點(diǎn),是當(dāng)前國內(nèi)用于食源性微生物(尤其是沙門氏菌)同源性追蹤的最常用技術(shù)[88-89]。在2018年重慶市爆發(fā)的農(nóng)村宴席食物中毒事件中,重慶市疾病預(yù)防控制中心利用PFGE技術(shù)成功判斷了該事件是由餐飲人員在食品加工過程中引入腸炎沙門氏菌所致[90]。與其他基于PCR的分型技術(shù)相比,盡管在常規(guī)瓊脂糖凝膠上分離條帶的PFGE分型技術(shù)操作繁瑣且重現(xiàn)性低,但由于PFGE對(duì)病原體檢測(cè)結(jié)果易于標(biāo)準(zhǔn)化,加上可利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比追蹤,使得PFGE仍是各地疾病預(yù)防控制中心用于病原微生物分型的最常用技術(shù)[91]。

2.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption and ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)是依據(jù)細(xì)菌蛋白指紋圖譜的特異性進(jìn)行分型的方法,當(dāng)激光照射到樣品蛋白與基質(zhì)形成的晶體時(shí),基質(zhì)從激光中獲取能量并將這部分能量傳給蛋白質(zhì)使得蛋白質(zhì)電離,電離形成的分子碎片經(jīng)離子飛行時(shí)間(time of flight,TOF)檢測(cè)器檢測(cè)后可得到檢測(cè)結(jié)果[92]。MALDI-TOF-MS最大的優(yōu)點(diǎn)是可在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確檢出菌屬水平信息,其準(zhǔn)確率通常可維持在92.5%～99.0%[93]。Eiseul等[94]使用MALDI-TOF-MS對(duì)幾種食物中葡萄球菌菌株的種類進(jìn)行鑒定,經(jīng)擴(kuò)展直接轉(zhuǎn)移提取法和甲酸提取法制備菌種并培養(yǎng)24 h后,葡萄球菌菌屬水平信息的鑒定均達(dá)100%準(zhǔn)確率。此外,微生物代謝產(chǎn)物分析及納米磁珠等技術(shù)的使用有效拓寬了MALDI-TOF-MS的應(yīng)用范圍,為MALDI-TOF MS在食品監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)研究領(lǐng)域的推廣及應(yīng)用提供支持[95]。

2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是利用標(biāo)記基因獲取微生物蛋白指紋圖譜,通過對(duì)比圖譜差異來對(duì)被污染物及污染源進(jìn)行分析的電泳技術(shù)。1993年,Muyzer等[96]首次將DGGE應(yīng)用于微生物群落研究;同年,許偉等[97]基于16S rDNA開發(fā)了PCR-DGGE技術(shù)。PCR-DGGE技術(shù)發(fā)展至今已廣泛用于被污染水體中細(xì)菌種群的遺傳多樣性分析,該項(xiàng)技術(shù)最大特點(diǎn)是能夠在微生物群落組成不斷變化的過程中實(shí)施動(dòng)態(tài)分析[98-99]。Kanchana等[100]在PCR-DGGE的基礎(chǔ)上提出了逆轉(zhuǎn)錄酶—PCR-DGGE的技術(shù),并將這種技術(shù)與常規(guī)PCR-DGGE一同用于混合弧菌的鑒定。結(jié)果顯示,引入逆轉(zhuǎn)錄酶的方法使得分析結(jié)果具有更高的靈敏度。作為病原菌溯源分型的又一利器,PCR-DGGE不僅檢測(cè)性高、分辨率好,而且無需對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。因此,這種方法不僅適用于分析水環(huán)境及土壤中微生物群落的組成及變化,還可以用于環(huán)境中的未知微生物群落的探索,是一項(xiàng)非常具有應(yīng)用前景的技術(shù)[101]。

2.4 微生物源示蹤技術(shù)

水是生命之源,也是食源性微生物大范圍傳播的重要媒介,人類的生活無一例外離不開水,受污染的水體用于人們的生活及農(nóng)作物灌溉無疑是影響人類健康的重大風(fēng)險(xiǎn)因素。傳統(tǒng)的微生物示蹤(microbial source tracking,MST)技術(shù)主要是基于糞便指示菌(fecal indicator bacteria,FIB)的檢測(cè),但這種方法僅能表示水體被污染的程度,卻不能指示污染的來源[102]。因此,孫志浩等[103]尋找了如糞便厭氧菌、噬菌體及指示病毒作為替代指示微生物以拓寬MST的應(yīng)用。此外,基于第二代測(cè)序衍生的兩種技術(shù),一種是引入操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)概念的技術(shù),另一種是SourceTracker程序,使得MST可以在更寬的范圍內(nèi)追溯糞便污染來源。引入OTU聚類分析的高通量測(cè)序技術(shù)不僅減少了測(cè)序的工作量,而且還能自動(dòng)識(shí)別并去除一些測(cè)序錯(cuò)誤的序列,有效提高了分析準(zhǔn)確性[104]。Clairessa等[105]應(yīng)用由Scott教授及其團(tuán)隊(duì)開發(fā)的Source Tracker軟件基于貝葉斯算法對(duì)目標(biāo)樣本及微生物源樣本的群落構(gòu)成分析,根據(jù)分析結(jié)果可預(yù)測(cè)目標(biāo)樣本中的微生物在各微生物源樣本中所占的比例。然而,盡管MST技術(shù)的應(yīng)用已較為普遍,但其檢測(cè)結(jié)果易受地理?xiàng)l件及環(huán)境氣候的影響,且不同地區(qū)人體及動(dòng)物腸道菌群存在較大的差異性,加上目前尚未出現(xiàn)能表征不同水體中病原菌污染的替代指示微生物,使得MST難以建立出一套標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方案[103]。

3 結(jié)論及展望

本文綜述了近年來用于食源性微生物檢測(cè)及溯源的新興技術(shù),并簡要評(píng)述了這些技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。在微生物的檢測(cè)方法中,免疫學(xué)檢測(cè)方法的突出特點(diǎn)就是高特異性,且不需要大型儀器,但基于免疫學(xué)的方法通常需要獲得數(shù)量足夠多的純化細(xì)菌,免疫磁性分離技術(shù)恰可代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測(cè)方法中富集細(xì)菌這一步驟,可有效縮短檢測(cè)時(shí)間;分子檢測(cè)方法通常具有快速、高效的特點(diǎn),其中應(yīng)用較為廣泛的是PCR法,將PMA、EMA及鉑類化合物應(yīng)用到PCR方法中可克服傳統(tǒng)PCR方法無法區(qū)分存活細(xì)菌和死亡細(xì)菌缺點(diǎn),但基于分子檢測(cè)的方法通常試劑盒較貴;生物傳感器具有分析效率高、檢測(cè)成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),在食源性微生物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中發(fā)揮著重要作用[59];基于儀器的分析方法具有樣品消耗量低、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),但也存在樣品處理時(shí)間長、檢測(cè)難以標(biāo)準(zhǔn)化等不足;ATP生物發(fā)光技術(shù)具有省時(shí)、便捷、可現(xiàn)場檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),但其檢測(cè)結(jié)果易受非細(xì)胞性ATP的干擾;噬菌體檢測(cè)技術(shù)具有易侵襲、特異性強(qiáng)、價(jià)格便宜的特點(diǎn),但噬菌體的宿主譜較窄,往往只對(duì)細(xì)菌某種血清型或分離株有特異性[106]。在微生物溯源方法中,基因分型技術(shù)應(yīng)用較廣,且cgMLST、wgSNP及MLVA分型方法的結(jié)果均可數(shù)字化,便于建庫;cgMLST分型方法分辨率高、復(fù)現(xiàn)性強(qiáng),計(jì)算量較wgSNP少,而wgSNP則更適用于揭示病原菌進(jìn)化史;基于CRISPR的分型技術(shù)通量高;rep-PCR分型操作簡便且復(fù)現(xiàn)性高;PFGE分辨能力高、分型能力強(qiáng)且分型成本低,但操作過程較為繁瑣;MALDI-TOF-MS具有分析速度快、通量高等特點(diǎn),但此類方法需建立出相應(yīng)的特征菌圖譜庫[92];微生物示蹤技術(shù)則主要用于水體中糞便污染菌的溯源,但該種方法受環(huán)境、地區(qū)影響大,難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)。

綜上所述,基于免疫學(xué)及分子生物學(xué)的微生物檢測(cè)方法應(yīng)用較廣,這些方法檢測(cè)特異性高,且通常不需要較高的操作技術(shù)即可完成;生物傳感器及儀器分析法檢測(cè)方法具有快速、簡便的特點(diǎn),但它們需要有大型儀器設(shè)備支撐,若實(shí)驗(yàn)條件滿足,此類檢測(cè)方法在微生物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中可發(fā)揮著重要作用。在各類溯源方法中,各類基因分型方法在完善了微生物信息數(shù)據(jù)庫后,方可顯示出強(qiáng)大的溯源能力;而PFGE則較適用于應(yīng)對(duì)地方性小范圍的微生物溯源分析。

總之,食源性致病微生物的檢測(cè)及溯源在食品安全監(jiān)管中至關(guān)重要,隨著新材料新技術(shù)發(fā)展,食源性微生物的檢測(cè)和溯源方法正朝著超靈敏、高通量、更快速的方向發(fā)展,同時(shí),多種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的方法在食源性致病菌的檢測(cè)及溯源中發(fā)揮了重要的作用。食源性致病菌爆發(fā)的感染呈現(xiàn)區(qū)域化、全球化的趨勢(shì),因此,建立并完善微生物相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫,為各國應(yīng)用微生物感染時(shí)快速準(zhǔn)確地查找微生物來源、進(jìn)而采取及時(shí)有效的措施具有重大的意義。同時(shí),為保障人民免受食源性致病菌侵?jǐn)_、減少國家經(jīng)濟(jì)損失,國家政府應(yīng)加大對(duì)食品安全檢測(cè)技術(shù)研發(fā)及微生物信息收集網(wǎng)絡(luò)建設(shè)的資金和人員投入,讓食品衛(wèi)生安全監(jiān)管的成果惠及百姓。