電子順磁共振波譜法測(cè)定三種類胡蘿卜素抗氧化活性

郭學(xué)文,全 力,蔣晨辰,陳 璐,喬俊琴,*,練鴻振

(1.生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心,江蘇南京 210093;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)整合醫(yī)學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

自由基特別是活性氧自由基作為高活性中間體對(duì)人體代謝有著重要影響[1-2]。在病理狀態(tài)下或者衰老過程中,自由基的過量積累產(chǎn)生氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)人體造成危害[3-4],如炎癥[5]、神經(jīng)退行性疾病[6-7]、心血管疾病[8]、糖尿病[9]和癌癥[10-11]等。因此外源抗氧化劑的篩選及其抗氧化能力比較受到人們廣泛關(guān)注[12-14]。

類胡蘿卜素是最常見的外源抗氧化劑之一,其優(yōu)良的抗氧化性來源于不飽和共軛雙鍵結(jié)構(gòu),可清除人體內(nèi)自由基。許多流行病學(xué)研究表明類胡蘿卜素可以降低多種癌癥、心血管疾病及其它慢性疾病的危險(xiǎn)性[15-16]。β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素是人體血清中含量最多的三種類胡蘿卜素,廣泛存在于水果和蔬菜中,其良好的自由基清除能力使得它們可以用作食品抗氧化劑,并用于制造功能性食品及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑[17-19]。

目前測(cè)定物質(zhì)抗氧化活性最常用的方法是紫外-可見分光光度(UV-Vis)法。作為自由基清除劑的抗氧化劑與在紫外-可見光范圍內(nèi)有吸收的自由基反應(yīng),根據(jù)褪色程度確定其抗氧化活性[20-22],但類胡蘿卜素本身在紫外-可見光范圍內(nèi)有吸收,會(huì)對(duì)紫外-可見分光光度法的檢測(cè)造成較大干擾[23-24]。電子順磁共振波譜(EPR)法是檢測(cè)自由基最直接的方法,EPR基于未成對(duì)電子在直流磁場(chǎng)中吸收電磁輻射后從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)這一原理,可以避免類胡蘿卜素自身顏色對(duì)自由基檢測(cè)的干擾[25]。本文基于EPR法探討了1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)濃度與EPR信號(hào)強(qiáng)度關(guān)系,研究了Fenton法產(chǎn)生羥基自由基(·OH)中Fe2+和過氧化氫的濃度及比例對(duì)·OH信號(hào)強(qiáng)度的影響,通過比較β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素對(duì)DPPH·、·OH的清除能力,測(cè)定了三種類胡蘿卜素的抗氧化活性能力,為完善類胡蘿卜素等天然食品添加劑的抗氧化活性能力評(píng)價(jià)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄紅素 純度為80%,上海源葉生物科技有限公司;葉黃素 純度為80%,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;β-胡蘿卜素、DPPH 純度為96%,上海麥克林生化科技有限公司；5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-oxide,DMPO) 純度為96%,東仁化學(xué)科技(上海)有限公司;七水硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 純度97%,江蘇清禾化工有限公司;過氧化氫(H2O2，濃度30 wt%)、乙醇、丙酮 分析純,南京化學(xué)試劑有限公司;去離子水 超純水機(jī)(TM-D24UV純水/超純水一體化系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司)制備。

EMX 10/12電子順磁共振波譜儀 德國(guó)Bruker公司;G-9S紫外可見分光光度計(jì) 南京菲勒儀器有限公司;KH-300DB型超聲儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EPR檢測(cè)方法 用毛細(xì)管(內(nèi)徑0.9～1.0 mm)取100 μL樣品溶液,再將毛細(xì)管放入順磁石英管(內(nèi)徑4 mm)進(jìn)行EPR檢測(cè)。EPR測(cè)試參數(shù)如下:中心磁場(chǎng):3480 Guass;掃場(chǎng)寬度:150 Guass;微波功率:20 mW;調(diào)制頻率:100 kHz;放大倍數(shù):2×103;調(diào)制幅度:1 Guass;時(shí)間常數(shù):40.96 ms;掃場(chǎng)時(shí)間:83.89 s;掃描次數(shù):1;測(cè)試溫度:室溫。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.2.2.1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取一定質(zhì)量的DPPH粉末,用乙醇超聲溶解配制成5 mmol/L儲(chǔ)備液備用。實(shí)驗(yàn)時(shí),用乙醇分別稀釋為濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、1.00和2.00 mmol/L的DPPH溶液,按1.2.1中方法進(jìn)行EPR測(cè)定,建立DPPH的EPR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 DMPO-OH標(biāo)準(zhǔn)曲線和Fe2+與H2O2比例探索 稱取一定質(zhì)量的FeSO4·7H2O粉末,用去離子水超聲溶解配制成5 mmol/L的FeSO4溶液作為儲(chǔ)備液;量取一定體積的H2O2溶液,用去離子水配制成50 mmol/L的H2O2儲(chǔ)備液;DMPO用去離子水配制成1 mol/L的溶液。考察Fe2+與H2O2不同比例時(shí)的EPR信號(hào)時(shí),取20 μL DMPO溶液,分別加入20 μL FeSO4儲(chǔ)備液和2、10、20、30 μL H2O2儲(chǔ)備液,加去離子水至總體積為400 mL,此時(shí)混合液中FeSO4和H2O2摩爾比分別為1∶1、1∶5、1∶10、1∶15,反應(yīng)5 min后立即按1.2.1中方法進(jìn)行EPR測(cè)定;建立DMPO-OH的EPR標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),取20 μL DMPO溶液,加入一定量的FeSO4儲(chǔ)備液和H2O2儲(chǔ)備液,加去離子水至總體積為400 mL,使混合液中FeSO4和H2O2濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L,反應(yīng)5 min后立即按1.2.1中方法進(jìn)行EPR檢測(cè),建立DMPO-OH的EPR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 自由基清除率測(cè)定 取番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素粉末,分別用丙酮超聲溶解,配制成1、2、3、4、5、6 mmol/L的待測(cè)樣品溶液備用。

1.2.3.1 DPPH·清除率的測(cè)定 根據(jù)Bartoszek等[26]的方法稍作調(diào)整。分別取40 μL不同濃度的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素樣品溶液(空白組取等量的丙酮溶液),加入到40 μL 5 mmol/L的DPPH溶液中,加乙醇使總體積為400 μL,混合均勻后按1.2.1中方法進(jìn)行EPR檢測(cè),其中考察濃度為0.2 mmol/L和0.5 mmol/L 的類胡蘿卜素對(duì)DPPH·清除率隨時(shí)間的變化時(shí),將混合溶液黑暗條件下分別靜置30、60、150、210、270、330 min后進(jìn)行檢測(cè);考察濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mmol/L的類胡蘿卜素對(duì)DPPH·清除率時(shí),將混合溶液黑暗條件下靜置160 min后進(jìn)行檢測(cè)。自由基清除率(Radical scavenging activity,RSA)的計(jì)算公式為RSA(%)=(A0-A)/A0×100,其中A0為空白組特征峰的二次積分值,A為樣品組特征峰的二次積分值。

1.2.3.2 ·OH清除率的測(cè)定 根據(jù)Kladna等[27]的方法稍作調(diào)整。取40 μL不同濃度的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素樣品溶液(空白組取等量的丙酮溶液),加入20 μL FeSO4溶液(5 mmol/L)、20 μL DMPO溶液(1 mol/L),混合均勻后加入20 μL H2O2溶液(50 mmol/L),加去離子水使總體積為400 μL,混合均勻后立即按1.2.1中方法進(jìn)行EPR檢測(cè)。其中考察DMPO-OH信號(hào)隨時(shí)間的變化時(shí),將混合溶液黑暗條件下分別靜置5、10、15、20、25、30 min后進(jìn)行檢測(cè);考察濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mmol/L的類胡蘿卜素對(duì)·OH清除率時(shí),將混合溶液液黑暗條件下靜置5 min后進(jìn)行檢測(cè)。RSA(%)=(H0-H)/H0×100,其中H0為空白組第二特征峰的峰高,H為樣品組第二特征峰的峰高。

1.2.3.3 UV-Vis法對(duì)比 根據(jù)Zhang等[28]的方法稍作調(diào)整。取30 μL 5 mmol/L的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素樣品溶液(空白組取等量的丙酮溶液),加入到30 μL 5 mmol/L的DPPH溶液中(類胡蘿卜素自身吸光度測(cè)定時(shí)以等體積乙醇代替DPPH),加乙醇使總體積為3 mL,混合均勻后黑暗處?kù)o置30 min后加入比色皿中,然后置于UV-Vis檢測(cè)517 nm波長(zhǎng)處的吸光度,光譜掃描波長(zhǎng)范圍:200～800 nm。RSA(%)=[H0-(H-Hc)]/H0×100,其中H0為空白組517 nm處吸光度,H為樣品組517 nm處吸光度,Hc為類胡蘿卜素自身517 nm處吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用Bruker WinEPR Processing 2.22軟件對(duì)EPR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用Origin 8.5對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·清除率

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基,可以通過EPR直接測(cè)定其EPR信號(hào)譜圖,圖1為不同濃度DPPH的EPR譜圖及歸一化的二次積分值與濃度關(guān)系曲線。由圖1可知,在0.01～1.00 mmol/L范圍內(nèi)DPPH濃度(C)與EPR譜圖二次積分值(I)成良好的線性關(guān)系,線性方程I=1.3033C+0.0028,相關(guān)系數(shù)R2=0.9949。因此,可以通過監(jiān)測(cè)DPPH的EPR二次積分值來反映DPPH的濃度變化,進(jìn)而用于DPPH·清除率的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)時(shí),固定DPPH初始濃度為0.5 mmol/L用于類胡蘿卜素對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定。

圖1 不同濃度DPPH的EPR譜圖(A)及積分值與濃度關(guān)系圖(B)

圖2顯示了濃度分別為0.2、0.5 mmol/L的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·(0.5 mmol/L)清除率隨時(shí)間的變化。由圖2可知,隨時(shí)間的延長(zhǎng),三種類胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率均增大,且呈現(xiàn)前期隨時(shí)間增大迅速增大,后期增大趨勢(shì)變緩的趨勢(shì),300 min后清除率幾乎保持不變。對(duì)同種類胡蘿卜素,高濃度(0.5 mmol/L)的類胡蘿卜素對(duì)DPPH·清除率高于低濃度(0.2 mmol/L)。其中,番茄紅素對(duì)DPPH·的清除速率最快,濃度為0.2和0.5 mmol/L的番茄紅素對(duì)DPPH·的清除率在30 min時(shí)分別達(dá)到54.0%和74.8%,在60 min時(shí)分別達(dá)到65.4%和90.1%,在270 min時(shí)達(dá)到了97.4%和100.0%。相同濃度的葉黃素對(duì)DPPH·的清除率略高于β-胡蘿卜素,在330 min時(shí),0.2 mmol/L葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率分別為44.8%和41.1%,0.5 mmol/L的葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率分別為67.1%和56.9%,均高于0.2 mmol/L的番茄紅素對(duì)DPPH·的清除率。

圖2 番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·清除率隨時(shí)間的變化

圖3為不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素在160 min時(shí)的DPPH·清除率,DPPH·清除率隨著類胡蘿卜素濃度的增大而增大,其中番茄紅素對(duì)DPPH·的清除率最大。濃度為0.1 mmol/L的番茄紅素對(duì)DPPH的清除率達(dá)到78.3%,濃度為0.1 mmol/L的β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率僅為30.1%,略高于0.1 mmol/L的葉黃素對(duì)DPPH·的清除率(25.2%)。但隨著濃度的增大,葉黃素對(duì)DPPH·的清除率逐漸高于β-胡蘿卜素,濃度達(dá)到0.6 mmol/L時(shí),番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率分別為95.4%、76.7%和47.7%。這是由于共軛雙鍵數(shù)越多自由基清除能力越強(qiáng),番茄紅素共軛雙鍵數(shù)為13個(gè),大于葉黃素和β-胡蘿卜素,而雖然葉黃素與β-胡蘿卜素共軛雙鍵數(shù)均為10個(gè),但葉黃素端環(huán)上的羥基提高了類胡蘿卜素自由基清除活性[29]。

圖3 不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率(160 min)

利用UV-Vis法同樣進(jìn)行了DPPH·清除率測(cè)定。實(shí)驗(yàn)證明,三種類胡蘿卜素自身在517 nm處均有不同程度的吸收(圖4)。當(dāng)作用時(shí)間為30 min時(shí),扣除溶劑空白和類胡蘿卜素自身吸收后,番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·的清除率分別為48.15%、17.83%和10.23%,與EPR等比例濃度測(cè)試結(jié)果(74.85%、18.49%、8.71%,見圖2)相比,兩種方法測(cè)得的三種類胡蘿卜素抗氧化能力具有較高的相關(guān)性,但清除率有所差別,尤其是番茄紅素。這可能是由于番茄紅素在517 nm處有較強(qiáng)吸收,與DPPH光譜特征峰最大吸收嚴(yán)重重疊造成,即使進(jìn)行了人為背景扣除,仍會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果造成較大干擾。

圖4 番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素和DPPH的UV-Vis吸收光譜

2.2 番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿卜素對(duì)·OH清除率

采用Fenton法產(chǎn)生·OH(Fe2++2H2O2=Fe3++2·OH+2H2O),Fe2+和H2O2比例不同會(huì)影響反應(yīng)過程,產(chǎn)生的·OH量也不同。由于·OH是一種短壽命的氧自由基,在水溶液中壽命只有10-9s,不能直接在室溫檢測(cè)得到EPR信號(hào),必須加入自由基捕獲劑與其形成比較穩(wěn)定的自由基加合物。DMPO是一種常用的羥基自由基捕獲劑,與·OH結(jié)合后會(huì)生成DMPO-OH加和物,其EPR譜顯示出強(qiáng)度比為1∶2∶2∶1的四線譜。圖5是用DMPO作為自由基捕獲劑得到的不同比例的Fe2+和H2O2反應(yīng)后DMPO-OH的EPR譜圖和信號(hào)強(qiáng)度圖。在Fe2+濃度一定時(shí),隨著Fe2+∶H2O2比例的減小(即H2O2濃度的增大),DMPO-OH信號(hào)強(qiáng)度呈先增大后基本不變的趨勢(shì),因此本文羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)所選用Fe2+∶H2O2濃度比為1∶10。

圖5 不同比例的Fe2+和H2O2反應(yīng)后DMPO-OH的EPR譜圖(A)和信號(hào)強(qiáng)度圖(B)

實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)Fe2+∶H2O2比例固定時(shí),DMPO-OH的信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨Fe2+和H2O2濃度的增大而增加。以DMPO-OH第二條峰峰值強(qiáng)度對(duì)Fe2+濃度(Fe2+∶H2O2=1∶10)進(jìn)行曲線擬合,結(jié)果如圖6所示。由圖可知,Fe2+濃度在0.05～0.30 mmol/L范圍內(nèi)與DMPO-OH強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,線性方程I=8510.86C+321.27,相關(guān)系數(shù)R2=0.9914。說明Fe2+:H2O2比例固定時(shí),Fe2+濃度與DMPO-OH信號(hào)強(qiáng)度成正比,即產(chǎn)生的·OH濃度與DMPO-OH信號(hào)強(qiáng)度呈正比,通過測(cè)定類胡蘿卜素加入前后DMPO-OH強(qiáng)度變化,可用于計(jì)算·OH的清除率。實(shí)驗(yàn)時(shí),固定Fe2+濃度為0.25 mmol/L用于類胡蘿卜素對(duì)·OH清除率的測(cè)定。通過DMPO捕獲劑捕獲到的自由基加合物雖然比原有的·OH穩(wěn)定,但也會(huì)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生明顯衰減(圖7),對(duì)·OH清除率測(cè)定造成影響,因此實(shí)驗(yàn)加入DMPO捕獲劑后需在5 min內(nèi)完成EPR的檢測(cè)。

圖6 DMPO-OH強(qiáng)度與Fe2+濃度關(guān)系曲線(Fe2+∶H2O2=1∶10)

圖7 DMPO-OH強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線

圖8為不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素在5 min時(shí)的·OH清除率,由圖8可知,·OH清除率隨著類胡蘿卜素濃度的增大而增大。低濃度時(shí),葉黃素對(duì)羥基自由基清除能力最強(qiáng),β-胡蘿卜素次之,番茄紅素最弱。濃度為0.1 mmol/L的葉黃素、β-胡蘿卜素和番茄紅素對(duì)·OH的清除率分別為13.1%、5.7%和3.7%。隨著濃度的增大,番茄紅素對(duì)·OH的清除能力顯著增強(qiáng),而葉黃素和β-胡蘿卜素的清除能力增強(qiáng)較緩,濃度高于0.3 mmol/L時(shí),三種類胡蘿卜素對(duì)·OH的清除能力為:番茄紅素>葉黃素>β-胡蘿卜素。濃度為0.6 mmol/L的番茄紅素對(duì)·OH的清除率達(dá)到56.6%,而相同濃度的葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)·OH的清除率分別僅為29.1%和14.0%。此結(jié)果與劉科梅[29]利用UV-Vis法所測(cè)三種類胡蘿卜素對(duì)·OH的清除能力趨勢(shì)一致。類似的,對(duì)于·OH而言,其本身沒有顏色特征峰,采用UV-Vis法檢測(cè)時(shí)均需另加顯色劑(如水楊酸鈉,與·OH反應(yīng)生成紫色產(chǎn)物,在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收)[29-30],因此,類胡蘿卜素自身的光譜干擾仍然會(huì)影響清除率的準(zhǔn)確測(cè)定。

圖8 不同濃度番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)羥基自由基的清除率(5 min)

綜上,三種類胡蘿卜素對(duì)DPPH·和·OH均有一定的清除能力,在類胡蘿卜素濃度大于0.3 mmol/L時(shí)對(duì)DPPH和羥基自由基的清除率均為:番茄紅素>葉黃素>β-胡蘿卜素,說明三種類胡蘿卜素中番茄紅素的抗氧化活性最強(qiáng),葉黃素次之,β-胡蘿卜素最弱。對(duì)比DPPH·與羥基自由基清除率,三種類胡蘿卜素對(duì)·OH的清除率較低,且·OH清除率測(cè)定的誤差較大,一方面是因?yàn)椤H的清除率測(cè)定是在5 min內(nèi)完成的,由DPPH·不同時(shí)間清除率測(cè)定(圖2)可知,三種類胡蘿卜素對(duì)自由基的清除需要一定的時(shí)間,短時(shí)間內(nèi)清除率較低;另一方面是因?yàn)轭惡}卜素是脂溶性的,而·OH產(chǎn)生體系是水相的,在水相中類胡蘿卜素溶解性受到影響。與UV-Vis相比,EPR作為一種直接檢測(cè)自由基變化的技術(shù),不受溶液顏色和濁度的影響,在對(duì)于本文三種類胡蘿卜素自由基清除能力表征方面,具有一定優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本文基于電子順磁共振波譜法測(cè)定,通過比較番茄紅素、葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)DPPH·和·OH清除能力的大小,研究了三種類胡蘿卜素抗氧化活性能力。結(jié)果表明:兩種自由基在一定濃度范圍內(nèi)與其EPR信號(hào)強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,適合用于清除率測(cè)定。三種類胡蘿卜素對(duì)兩種自由基均有一定清除作用,且類胡蘿卜素濃度越大,自由基清除率越高,抗氧化活性越強(qiáng)。其中,番茄紅素的抗氧化活性能力最強(qiáng),葉黃素次之,β-胡蘿卜素最弱。該研究結(jié)果可為完善類胡蘿卜素等天然食品添加劑的抗氧化能力評(píng)價(jià)方法提供依據(jù)。