鴨血酶解產(chǎn)物亞鐵螯合能力的研究及酶解物的組分分析

楊雁如,劉 洋,孫楊贏,*,潘道東

(1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315800;2.浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315800)

鴨血是肉鴨屠宰過程中產(chǎn)生的一種副產(chǎn)物,含有17%～21%的蛋白質(zhì)且富含微量元素和其它一些生物活性物質(zhì)[1]。但是,我國鴨血資源利用率不高,其中大多數(shù)鴨血直接當(dāng)做廢棄物處理掉,少數(shù)加工成鴨血制品供大家食用。目前市場上的鴨血制品主要是通過制備鴨血豆腐食用[2]。關(guān)于鴨血的報(bào)道也主要集中在鴨血豆腐品質(zhì)的研究,其中有關(guān)鴨血的高值化綜合利用的研究鮮有報(bào)道。如孫月萍等[3]研究發(fā)現(xiàn)魔芋膠和瓜爾豆膠協(xié)同作用可以顯著提高鴨血豆腐的質(zhì)構(gòu)特性。王道營等[4]研究發(fā)現(xiàn)鴨血經(jīng)過超聲波(400 W,6 min)前處理,可以有效提高鴨血豆腐品質(zhì)。鴨血是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源,通過酶法水解可以將難以消化利用的大分子蛋白質(zhì)水解成小分子多肽,不但能夠提供人類營養(yǎng),而且具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的功效[5]。

據(jù)報(bào)道,世界上近五分之一的人口由于缺鐵而出現(xiàn)營養(yǎng)問題,其主要原因是人體攝入和吸收鐵的量不足[6]。鐵能夠以鐵鹽、金屬螯合劑和鐵螯合肽的形式提供。然而,鐵鹽和金屬螯合劑由于其生物利用率低、對腸道有刺激作用等缺點(diǎn)而限制其利用[7]。有研究證明鐵螯合肽在提高生物利用度、吸收性和金屬穩(wěn)定性方面具有較大的優(yōu)勢,成為科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)[8]。李玉珍等[9]利用堿性蛋白酶酶解冷榨花生粕蛋白得到的花生多肽液,其多肽-亞鐵螯合率為85.68%。胡喬遷等[10]以芝麻蛋白為原料,利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了堿性蛋白酶制備芝麻蛋白亞鐵螯合物的工藝,優(yōu)化后酶解產(chǎn)物的亞鐵螯合率為72.36%。酶的選擇在一定程度上會影響酶解最終產(chǎn)物的功能活性。堿性蛋白酶是一種內(nèi)切蛋白酶,可以水解肽鍵、酯鍵、酰胺鍵[11-12]。趙靜[13]探究了堿性蛋白酶等六種不同的蛋白酶對水解豬血紅蛋白的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿性蛋白酶酶解得到的多肽產(chǎn)物亞鐵螯合率最高。但目前對鴨血蛋白螯合肽的研究還不夠深入,利用蛋白酶水解技術(shù)將鴨血蛋白水解成小分子肽是提高利用鴨血蛋白的有效手段之一,同時(shí)說明堿性蛋白酶酶解鴨血前景廣闊。

本實(shí)驗(yàn)以鴨血為原材料,利用堿性蛋白酶水解鴨血獲得小分子肽,通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到制備具有高亞鐵螯合能力的鴨血酶解產(chǎn)物的最優(yōu)工藝,同時(shí)分析酶解產(chǎn)物的氨基酸組成情況,以期促進(jìn)鴨血的高值化利用,為酶法制備鴨血活性肽提供參考,同時(shí)為畜禽加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨血 寧波北侖食品有限責(zé)任公司提供;堿性蛋白酶(比活力>2×105U/g)(食品級)、ferrozine(菲咯嗪)試劑 北京索萊寶科技有限公司;檸檬酸鈉、氫氧化鈉、氯化亞鐵、硝酸鈉、聚乙二醇等 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PL403 電子精密天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;Centrifuge 5804R離心機(jī) 艾本德中國有限公司;Infinite 200 Pro全波長掃描多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司;高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鴨血前處理 以10 g/L的檸檬酸鈉為抗凝劑,按照血液量∶抗凝劑=100∶1添加抗凝劑,混勻[14]。4 ℃下快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,立即用100目篩過濾,去除不可溶性雜質(zhì)。為保證樣品的品質(zhì)以及每次試驗(yàn)樣品的均一性,將抗凝鴨血分裝在50 mL離心管中,真空冷凍干燥,并將凍干后樣品(鴨血粉)于-40 ℃冰箱保存。

1.2.2 鴨血酶解產(chǎn)物的制備 稱取一定量的鴨血粉,用磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)溶解,配制成蛋白濃度為5%的鴨血溶液,用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至目標(biāo)pH,然后加入一定量的堿性蛋白酶在一定溫度下開始酶解。酶解結(jié)束后,將反應(yīng)液置于95 ℃沸水中滅酶10 min,冷卻后離心(5000 r/min,20 min)取上清液,真空冷凍干燥后得到鴨血酶解產(chǎn)物。

1.2.3 單因素水平設(shè)計(jì) 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn),本實(shí)驗(yàn)中選取酶添加量、pH、酶解溫度和時(shí)間這四個(gè)比較顯著的因素進(jìn)行考察[13,15]。以亞鐵螯合率為主要評價(jià)指標(biāo),水解度為輔助指標(biāo),依次探究酶添加量、pH、酶解溫度和時(shí)間對亞鐵螯合率和水解度的影響。當(dāng)pH為10.0,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為2 h,依次設(shè)定酶添加量為4000、6000、8000、10000、12000 U/g五個(gè)水平;當(dāng)酶添加量為10000 U/g,酶解溫度為50 ℃,酶解時(shí)間為2 h,依次設(shè)定pH為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0五個(gè)水平;當(dāng)酶添加量為10000 U/g,pH為11.0,酶解時(shí)間為2 h,依次設(shè)定酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃五個(gè)水平;當(dāng)酶添加量為10000 U/g,酶解溫度為50 ℃,pH為11.0,依次設(shè)定酶解時(shí)間為1.5、2、2.5、3、4 h五個(gè)水平。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以亞鐵螯合率為因變量,對酶添加量、酶解pH、酶解溫度和酶解時(shí)間這四個(gè)因素進(jìn)行多因素方差分析,最后確定酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間這三個(gè)比較顯著的因素作為自變量,進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn),采用軟件Design-Expert V8.0.6.1分別對其進(jìn)行編碼。表1為響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼表。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼表

1.2.5 水解度(Degree of hydrolysis,DH)的測定 本文采用pH-state法測定,按照1.2.2制備酶解產(chǎn)物。稱取一定量的鴨血粉(經(jīng)1.2.1制備得到),用pH=8的磷酸鹽緩沖液溶解,水解開始時(shí)用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH至目標(biāo)pH,另外在反應(yīng)過程中每隔15 min用0.5 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)一次pH,使反應(yīng)體系pH維持在固定的pH,最后通過加入堿的量來計(jì)算水解度。計(jì)算公式如下:

1.2.6 亞鐵螯合率測定方法 參考Torres-fuentes等[19]方法稍加改動。將100 μg鴨血酶解產(chǎn)物與250 μL醋酸鈉緩沖液(pH5.0,100 mmol/L)混合,加入30 μL氯化亞鐵(0.01%,w/v),在37 ℃下保溫30 min,加入13 μL ferrozine試劑(40 mmol/L)。用蒸餾水替代樣品作總鐵對照,用蒸餾水替代ferrozine試劑作空白對照。最后在562 nm處測定吸光度。

亞鐵螯合率計(jì)算公式如下:

式中:A0為總鐵對照吸光度;A1為樣品吸光度;A2為空白對照吸光度。

1.2.7 分子量的測定 分子量測定采用凝膠滲透色譜(GPC)方法[20]。準(zhǔn)確稱取0.30 g經(jīng)方法1.2.4優(yōu)化后得到的鴨血酶解產(chǎn)物,溶于5 mL 0.1 mol/L的NaNO3溶液中,超聲分散后待測。流動相:0.1 mol/L NaNO3溶液,流速為1 mL/min,紫外檢測波長為220 nm。標(biāo)準(zhǔn)品:不同分子量窄分布聚乙二醇,分子量(Mp)分別為330000、176000、82500、44000、25300、20600、12600、7130、4290、1400、633、430。

1.2.8 氨基酸組成分析 參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[21]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)的Duncan’s Multiple Range Test進(jìn)行多組樣本間顯著性差異分析,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,差異顯著水平設(shè)置為P<0.05。采用Origin 8.0軟件制圖。利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元回歸擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對亞鐵螯合率和水解度的影響 如圖1所示,隨著酶量的增加,亞鐵螯合率和水解度都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)酶添加量為10000 U/g時(shí),水解度和亞鐵螯合率都達(dá)到最大值,分別為23.23%±0.17%、52.32%±1.3%。增加酶的添加量有利于底物與酶充分接觸,加快酶解反應(yīng)速度,提高水解度。當(dāng)加酶量超過10000 U/g,水解度開始下降,是因?yàn)楫?dāng)酶與底物作用達(dá)到最大承載能力,再增加酶量反而會抑制酶解反應(yīng)[22]。亞鐵螯合率下降的原因是過量的酶分子會阻礙中間產(chǎn)物向酶解終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致酶解物的亞鐵螯合率的降低[23]。所以綜上考慮,選取10000 U/g為最佳酶添加量。

圖1 酶添加量對亞鐵螯合率和水解度的影響

2.1.2 pH對亞鐵螯合率和水解度的影響 pH對亞鐵螯合率和水解度的影響如圖2所示。pH從8升到11,亞鐵螯合率隨著pH的升高而升高,之后隨著pH的升高亞鐵螯合率開始下降。水解度與亞鐵螯合率呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,也是隨著pH的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH=11時(shí)水解度達(dá)到最佳,為31.22%±0.26%,此時(shí)亞鐵螯合率為61.27%±0.65%。趙聰?shù)萚24]在研究灰樹花蛋白酶解工藝的試驗(yàn)中研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)類似,隨著pH的升高,亞鐵螯合能力和水解度也均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。酶解反應(yīng)體系中pH的改變會直接影響蛋白酶分子的空間結(jié)構(gòu)、底物分子的解離狀態(tài)以及酶與底物的結(jié)合,從而致使水解度發(fā)生變化,影響酶解產(chǎn)物的螯合活性[25-26]。另外研究表明,過高的pH意味著溶液中OH-離子增加,游離鐵離子與OH-結(jié)合形成羥合Fe2+的機(jī)會增加,也不利于鰲合鐵的生成[27]。同時(shí)在pH為11時(shí),亞鐵螯合率和水解度達(dá)到最高,所以本實(shí)驗(yàn)中選擇pH=11作為最佳酶解pH。

圖2 pH對亞鐵螯合率和水解度的影響

2.1.3 酶解溫度對亞鐵螯合率和水解度的影響 溫度對亞鐵螯合率和水解度的影響如圖3。溫度在40～50 ℃范圍內(nèi),亞鐵螯合率隨著溫度的上升明顯增強(qiáng),在50～60 ℃范圍內(nèi),亞鐵螯合率呈下降趨勢。在50 ℃時(shí)亞鐵螯合率達(dá)到最大,為53.59%±1.10%,此時(shí)水解度為29.20%±0.57%。張墨楠[28]在探究不同溫度對大豆蛋白酶解液亞鐵螯合反應(yīng)的影響時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)亞鐵螯合活性最高,過高或過低的溫度都不利于亞鐵的螯合。隨著溫度的升高,水解度先升高,之后變化不明顯。當(dāng)溫度較低時(shí),酶和蛋白分子的運(yùn)動速率均較低,不利用反應(yīng)的進(jìn)行;當(dāng)溫度過高時(shí),會導(dǎo)致酶活性減弱甚至喪失,抑制反應(yīng)的正向進(jìn)行[29-30]。所以,為獲得具有高亞鐵螯合活性的鴨血酶解產(chǎn)物,選擇溫度50 ℃為最優(yōu)酶解溫度。

圖3 溫度對亞鐵螯合率和水解度的影響

2.1.4 酶解時(shí)間對亞鐵螯合率和水解度的影響 不同酶解時(shí)間對亞鐵螯合率和水解度的影響如圖4所示。由圖4可知,亞鐵螯合率隨著酶解時(shí)間的延長先升高后降低,在2 h時(shí)達(dá)到最大值,為61.46%±0.43%。水解度在1.5～3 h內(nèi)隨著酶解時(shí)間的增加而不斷升高,之后再增加酶解時(shí)間水解度變化不大。一般多肽與金屬的螯合反應(yīng)都在較短時(shí)間內(nèi)完成,所以在2 h時(shí)酶解產(chǎn)物的亞鐵螯合率達(dá)到最高[28]。王錚等[31]利用酶解法制備雁血多肽,在探究酶解工藝對水解度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到一定程度時(shí),此后再增加反應(yīng)時(shí)間,水解度幾乎不再增加。隨著酶解時(shí)間的增加,水解度一直呈上升趨勢,尤其在前2 h內(nèi),水解度上升較多。但隨著時(shí)間的延長,反應(yīng)產(chǎn)物積累,抑制了蛋白酶的活力,從而導(dǎo)致水解度上升不明顯,同時(shí)過度水解會不利于亞鐵螯合反應(yīng)。所以選擇2 h為最佳酶解時(shí)間。

圖4 時(shí)間對亞鐵螯合率和水解度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 綜合以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析,以亞鐵螯合率為指標(biāo),應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn),測定結(jié)果如表2所示,共計(jì)17組實(shí)驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 影響亞鐵螯合率各因素交互作用響應(yīng)面如圖5所示。通常來說,兩個(gè)因素間交互作用的顯著性與響應(yīng)面曲線的彎曲程度和等高線的形狀有關(guān),等高線為橢圓型則表示兩個(gè)因素之間交互作用顯著,響應(yīng)面曲線越陡峭表示單個(gè)因素影響越顯著,反之表示不顯著[32]。由圖A2可以看出,酶添加量與酶解溫度交互作用極顯著(P<0.01)。其中,沿X1軸方向的響應(yīng)面坡度明顯比沿X3軸方向的要陡峭(圖A1),說明酶添加量相對于酶解時(shí)間對亞鐵螯合率影響更為顯著。圖A3顯示沿X2軸方向的響應(yīng)面坡度明顯比沿X3軸方向的要陡峭,說明酶解溫度影響更大。從X1與X2交互作用圖中發(fā)現(xiàn)沿X2軸方向的響應(yīng)面坡度比沿X1軸稍微平緩一些,說明酶解溫度的變化對響應(yīng)值的影響更為小一些。該結(jié)論與方差分析結(jié)果一致,再次驗(yàn)證了響應(yīng)面模型的可靠性。

圖5 各因素交互作用對亞鐵螯合率影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證 利用Design Expert軟件的優(yōu)化,得到最佳工藝參數(shù):酶添加量9800 U/g,酶解時(shí)間為2.05 h,溫度為49.6 ℃?？紤]到實(shí)際操作情況,將酶解條件修正為:酶添加量9800 U/g,酶解時(shí)間為2 h,溫度為50 ℃。為驗(yàn)證優(yōu)化后模型的可靠性,做3次平行實(shí)驗(yàn),得到實(shí)際平均亞鐵螯合活性為65.36%,模型預(yù)測的亞鐵螯合率為66.71%。實(shí)際結(jié)果與預(yù)測數(shù)值差異為1.35%,未超過5%,該模型驗(yàn)證合理。

2.3 鴨血酶解產(chǎn)物分子量分布

鴨血酶解產(chǎn)物分子量分布結(jié)果如圖6和表4所示。相比于大分子蛋白質(zhì)和單一氨基酸,小分子多肽更易被人體吸收利用,所以對酶解液分子量分布的考察極為重要[33]。由圖6和表4可知,經(jīng)過堿性蛋白酶酶解后得到的鴨血酶解產(chǎn)物,其相對分子質(zhì)量小于1500 Da的組分占比為72.01%,其中小于800 Da的組分占比為39.66%。Vattem等[34]、Guo等[6]、Lee等[35]利用酶解技術(shù)分別從蛋清蛋白源、阿拉斯加鱈魚皮和豬血漿蛋白制備得到鐵螯合肽,其分子量均小于1500 Da。此外,Cian等[36]從酶解紅藻蛋白中制備得到兩個(gè)多肽組分,分子量分別為270和1013 Da,其中270 Da的多肽比1013 Da的多肽亞鐵螯合活性更強(qiáng)。以上研究表明,多肽的分子量大小與金屬的螯合能力有著一定的相關(guān)性,低分子量多肽具有相對更強(qiáng)的螯合能力[37]。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線和酶解液分子量分布圖

表4 不同分子量分布

2.4 鴨血酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

酶解產(chǎn)物的螯合活性不僅取決于肽的分子量大小,它和組成多肽的氨基酸序列及其中的特殊基團(tuán)也有很大的關(guān)系[38]。由表5可知,酶解產(chǎn)物中氨基酸總量約占76.25%。其中Lys、Glu、Asp、His含量較高,分別占總氨基酸含量的10.25%、13.95%、9.67%、8.89%。Wu等[39]研究鱈魚皮明膠水解物的氨基酸組成發(fā)現(xiàn),除了Gly、Pro、Ala含量較高,與金屬螯合活性有關(guān)的Lys、Glu、Asp、His分別占氨基酸總量的2.7%、9.0%、5.7%、1.3%。Glu和Asp因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠與亞鐵等金屬離子結(jié)合,形成穩(wěn)定的金屬螯合物[40]。不同的氨基酸對鐵螯合活性的貢獻(xiàn)與原料的種類有一定的關(guān)系。如在乳清蛋白酶解產(chǎn)物中,Ala、Lys和Phe對鐵螯合活性貢獻(xiàn)最大[41]。Lucia等[42]在研究酵母蛋白亞鐵螯合肽時(shí)發(fā)現(xiàn),His、Lys和Arg含量較水解物中有所提高。此外,酶的選擇和酶解過程的控制都會影響最終酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分布。堿性蛋白酶為非特異性蛋白酶,其酶切的肽段中Glu、Lys等氨基酸含量較多,因此具有較高的亞鐵螯合活性[6,24]。有研究發(fā)現(xiàn),具有較好亞鐵螯合能力的多肽通常還與Cys、Arg、Ser等氨基酸有著緊密的聯(lián)系[39,43]。通過氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn),堿性蛋白酶作用于鴨血蛋白形成的小分子多肽具有良好的亞鐵螯合活性。

表5 酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以亞鐵螯合率為指標(biāo),結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到堿性蛋白酶水解鴨血制備具有高亞鐵螯合活性的酶解產(chǎn)物的最優(yōu)酶解工藝為:酶添加量為9800 U/g、溫度為50 ℃、pH11、時(shí)間為2 h,在此工藝下模型預(yù)測亞鐵螯合率為66.71%,實(shí)際亞鐵螯合率可達(dá)65.36%,實(shí)際結(jié)果與預(yù)測值之間的誤差為1.35%,模型驗(yàn)證合理。酶解產(chǎn)物中分子量低于1500 Da的小肽占比為72.01%,氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn),酶解產(chǎn)物中具有亞鐵螯合活性多肽的氨基酸(Lys、Glu、Asp、His)含量較高,分別占總氨基酸含量的10.25%、13.95%、9.67%、8.89%,這些氨基酸對亞鐵離子有較強(qiáng)的螯合作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)鴨血等畜禽血液鐵螯合肽提供了理論依據(jù)。