黃秋葵發(fā)酵酒渣中果膠多糖的提取及理化性質(zhì)分析

吳光斌,周彥強,陳發(fā)河

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建廈門 361000)

黃秋葵(Okra,AbelmoschusesculentusL.Moench),也稱秋葵、羊角菜、羊角豆,起源于非洲,目前在我國南北方均有種植,資源豐富[1-2]。黃秋葵嫩莢中含有大量的粘性多糖物質(zhì),其主要成分包括果膠多糖、阿拉伯聚糖、半乳聚糖及少量糖蛋白[3]。黃秋葵果實的利用方式主要是嫩莢用作烹飪,成熟后的種子留作種用。近年來隨著黃秋葵資源利用的不斷創(chuàng)新,通過改變利用方式以提高其附加值。已有學(xué)者研究了黃秋葵酒的發(fā)酵工藝[17-18],亦有企業(yè)利用黃秋葵研發(fā)出黃秋葵酒,投放市場數(shù)年獲得消費者廣泛認可,但黃秋葵酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量酒渣尚未得到充分利用。

果膠的分子結(jié)構(gòu)通常有三類:半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan,HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(Rhamnogalacturonan I,RG I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(Rhamngalacturonan Ⅱ,RG Ⅱ)[9],黃秋葵果膠多糖分子除了上述的結(jié)構(gòu)外,部分研究證明其糖鏈中還包含有其它的結(jié)構(gòu)[10-12]。研究表明,黃秋葵莢果中含有的果膠多糖物質(zhì)具有抗疲勞[13-14]、增強免疫力[15]、降低血脂[16]等功能。果膠具有的增稠、穩(wěn)定、凝膠和殺菌止血等特性,被廣泛用于食品、紡織、化妝品和制藥等領(lǐng)域,黃秋葵果膠的開發(fā)利用市場前景廣闊。關(guān)于黃秋葵果膠的提取工藝已有文獻報道[2,19-20],劉曉霞[21]研究了黃秋葵花果膠類多糖的提取工藝及其性質(zhì),但利用黃秋葵發(fā)酵酒渣制備果膠多糖的工藝技術(shù)及果膠多糖性質(zhì)鮮有報道。

本文以黃秋葵發(fā)酵酒渣為研究對象,采用酶法提取黃秋葵發(fā)酵酒渣中的果膠多糖,通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝;采用PMP柱前衍生HPLC法測定黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組分,分析了果膠多糖的部分理化特性,以期為黃秋葵發(fā)酵酒渣的綜合利用技術(shù)開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵發(fā)酵酒渣 廈門市如意情有限公司提供,將發(fā)酵后的酒渣曬干,然后粉碎過40目篩得到黃秋葵發(fā)酵酒渣粉,冰箱保存?zhèn)溆?黃秋葵 廈門市如意情有限公司提供,將黃秋葵莢果曬干,然后粉碎過40目篩得到黃秋葵粉,冰箱保存?zhèn)溆?葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、纖維素酶(均為分析純) 國藥集團;鼠李糖、葡萄糖醛酸(均為色譜純) 索萊寶公司;半乳糖醛酸(色譜純) 麥克林公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(純度≥99.9%)、乙腈(色譜純) Sigma公司;纖維素酶(酶活15000 U/g)、半纖維素酶(酶活12000 U/g) 南寧宏博生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(酶活50000 U/g) 索萊寶公司;咔唑、無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(均為分析純) 國藥集團。

Waters 2695高效液相色譜配Waters 2489紫外檢測器 美國Waters公司;高速冷凍離心機 德國Eppendorf;Cary50紫外可見分光光度計 美國Varian;RIOS 8超純水系統(tǒng) 美國Millipore;PE20K型pH計 瑞士Mettler Toledo;WB-14恒溫水浴鍋 德國Memmert;LE204E電子天平 瑞士Mettler Toledo;ULT1386-80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Fisher;MA35快速水分測定儀 賽多利斯;FD-1D-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理 將黃秋葵發(fā)酵酒渣粉和黃秋葵粉,分別用20倍70%的乙醇浸提兩次(室溫,1 h),然后使用5倍氯仿和甲醇的混合溶劑(1∶1,v/v)提取1 h除去色素等雜質(zhì),最后使用丙酮洗滌后60 ℃烘干至恒重,分別得到醇不溶固形物AIS(Alcohol-insoluble solid)備用。

1.2.2 黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的提取 分別稱取一定量的上述AIS,按比例加入提取溶劑超純水和酶,使用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH;在一定溫度下水浴振蕩提取一定時間后,8000 r/min離心10 min收集濾液;濾液于45 ℃下旋蒸濃縮;冷卻后加入三倍體積的95%乙醇,4 ℃放置過夜,4000 r/min下離心10 min。最后得到的沉淀分別用75%乙醇和無水乙醇洗滌,復(fù)水溶解后在-40 ℃、真空度低于60 Pa條件下冷凍干燥,分別得到黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖產(chǎn)品,用于后續(xù)的分析測試與比較。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 酶的類型對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 固定料液比1∶35,提取時間8 h,加酶量1.5%,使用鹽酸和NaOH溶液調(diào)整pH,分別使用纖維素酶(pH=4.5,溫度45 ℃),半纖維素酶(pH=5.0,溫度50 ℃)和木瓜蛋白酶(pH=5.0,溫度55 ℃)進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.3.2 酶的添加量對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 使用水作為提取溶劑,固定料液比1∶35,提取時間8 h,溫度45 ℃,使用鹽酸和NaOH溶液調(diào)整pH為4.5,分別添加纖維素酶0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.3.3 料液比對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 使用水作為提取溶劑,提取時間8 h,纖維素酶添加量1.0%,溫度45 ℃,使用鹽酸和NaOH溶液調(diào)整pH為4.5,分別使用料液比1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.3.4 pH對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 使用水作為提取溶劑,固定料液比1∶35,提取時間8 h,溫度45 ℃,纖維素酶添加量1.0%,選擇提取液的pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0下進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.3.5 提取時間對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 使用水作為提取溶劑,固定料液比1∶35,提取時間8 h,溫度45 ℃,纖維素酶添加量1.0%,使用鹽酸和NaOH溶液調(diào)整pH為4.5,選擇提取時間分別為4、6、8、10、12、14 h下進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.3.6 提取溫度對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 使用水作為提取溶劑,固定料液比1∶35,提取時間8 h,纖維素酶添加量1.0%,使用鹽酸和NaOH溶液調(diào)整pH為4.5,選擇提取溫度分別為35、37.5、40.0、42.5、45、50、55 ℃下進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.3.7 提取次數(shù)對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖提取率的影響 使用水作為提取溶劑,固定料液比1∶35,提取時間8 h,溫度45 ℃,纖維素酶添加量1.0%,使用鹽酸和NaOH溶液調(diào)整pH為4.5,選擇提取次數(shù)分別為1、2、3、4進行提取,平行測定三次取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的提取工藝 采用響應(yīng)面法來優(yōu)化黃秋葵酒渣中果膠多糖的提取工藝。根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,以果膠多糖的提取率為響應(yīng)值,選擇提取pH、提取溫度、提取料液比這三個對黃秋葵酒渣果膠多糖提取率影響較大的因素,使用Design-Expert 8.0.6,利用Box-Benhnken的設(shè)計原理,進行三因素三水平的響應(yīng)面分析,對黃秋葵酒渣果膠多糖的提取工藝進行優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計因素與水平見表1。

表1 Box-Benhnken試驗設(shè)計因素和水平

1.2.5 黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖及其理化性質(zhì)指標的測定

1.2.5.1 水分含量的測定 采用快速水分測定儀測定黃秋葵酒渣果膠多糖的水分含量。

1.2.5.2 pH的測定 參照QB 2484-2000《食品添加劑 果膠》中的方法,用pH計測定黃秋葵酒渣果膠的pH。

1.2.5.3 果膠多糖含量的測定 對復(fù)水溶解后的果膠多糖溶液,使用苯酚硫酸比色法[23]測定果膠多糖的含量。標準曲線的制作方法:配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL的8個濃度的半乳糖溶液,各取1 mL加入具塞玻璃試管中,再加入1 mL 6%的苯酚溶液,混勻后加入5 mL濃硫酸,沸水浴20 min。使用蒸餾水做對照,測定490 nm的吸光度。

果膠多糖得率(%)=(溶液的體積×多糖濃度)/酒渣的質(zhì)量×100。

1.2.5.4 半乳糖醛酸含量的測定 采用咔唑硫酸法測定其半乳糖醛酸的含量[23]。

標準曲線的制作:稱取咔唑0.150 g定容至100 mL乙醇溶液中,得到1.5 g/L的咔唑溶液。配制10、20、30、40、50、60、70 μg/mL半乳糖醛酸溶液,各取1 mL于試管中,然后各加入濃硫酸6 mL,混合均勻;沸水浴15 min,冷卻至室溫后加入1.5 g/L咔唑溶液1 mL,混合均勻,室溫下避光放置1 h;以超純水為空白測定526 nm波長下的吸光度(A)。以測得的吸光度(A)為縱坐標,半乳糖醛酸的含量為橫坐標,繪制標準曲線,得到標準曲線回歸方程為:Y=0.0051X-0.0110(R2=0.9955)。

1.2.5.5 蛋白質(zhì)含量的測定 采用福林酚法[24-25]略作修改測定果膠多糖中的蛋白質(zhì)含量。

溶液的配制A液:1 g Na2CO3溶于50 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中;B液:0.5 g CuSO4·5H2O溶于100 mL 1%(w/v)的酒石酸鉀鈉中。甲液:取50 mL A液與1 mL B液混合。乙液:索萊寶福林酚溶液。

標準曲線的制作使用牛血清白蛋白作為標準品。配制濃度為50、100、150、200、250 μg/mL的牛血清白蛋白。取1 mL標準溶液或待測溶液,加入甲液5 mL,振蕩均勻后靜止10 min;再加入0.5 mL乙液,準確靜止30 min。以超純水為空白測定其650 nm下的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標,標準溶液中牛血清白蛋白的濃度為橫坐標,制作標準曲線。

樣品的測定配制一定濃度的果膠多糖溶液,取1 mL進行測定。其操作方法與標準曲線的制作方法相同。根據(jù)樣品的吸光度值結(jié)合標準曲線即可得出蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.6 酯化度的測定 參照國標GB/25533-2010等方法[26-28]測定,并稍作修改。稱取2 g果膠多糖于燒杯中,加入50 mL鹽酸-乙醇溶液(濃鹽酸:75%乙醇=1∶100,v/v),攪拌10 min;過濾,真空抽吸濾干后用鹽酸-乙醇溶液洗滌6次,每次用10 mL,再用乙醇溶液數(shù)次沖洗直至濾出物不含氯離子,最后用20 mL無水乙醇沖洗濾干,在105 ℃下干燥2 h,冷卻后稱重。

稱取0.5 g干燥后的果膠樣品于250 mL具塞錐形瓶,滴加少量無水乙醇潤濕。加入100 mL超純水振蕩至完全溶解。以酚酞為指示劑,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定,記錄下所消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液的體積V1。加入20.0 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉溶液,振搖后靜置15 min,加入20.0 mL 0.5 mol/L鹽酸標準滴定溶液進行中和,振搖至粉紅色消失。最后使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定,記錄下此步驟所消耗的0.1 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液的體積為V2。酯化度按照以下公式(1)計算:

酯化度(%)=V2/(V1+V2)×100

式(1)

1.2.5.7 色差分析 黃秋葵酒渣果膠多糖的色差,使用指標L*、a*、b*和ΔE表示,在Brookfield SC-80C型自動色差儀上進行測定,一式三份,結(jié)果取平均值。其中L*代表明度;a*代表紅綠色度,a*>0代表紅色,a*<0表示綠色;b*代表黃藍色度,b*>0表示黃色,b*<0表示藍色;ΔE表示色差。

1.2.5.8 單糖組成的分析 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化HPLC法測定黃秋葵果膠多糖的單糖組成[29]。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮為柱前衍生化試劑,結(jié)合反相高效液相色譜法,建立同時測定黃秋葵多糖中8 種單糖組分的方法。采用Infinity Lab Poroahell C18色譜柱為固定相,流動相為磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH6.85)-乙腈(82∶18,V/V),流速為1.0 mL/min,柱溫25 ℃,紫外檢測器,波長250 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚硫酸比色測定果膠多糖的標準曲線

使用苯酚硫酸比色測定果膠多糖的含量,實驗得到的標準曲線其線性關(guān)系良好,R2為0.9989(圖1),此方法可用于黃秋葵果膠多糖含量的測定。

圖1 苯酚-硫酸法標準曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶的類型對果膠多糖得率的影響 黃秋葵的細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和糖蛋白等物質(zhì)構(gòu)成,所以分別考察提取體系中酶的類型對果膠多糖得率的影響,并將不同酶的類型與未加酶的提取結(jié)果進行比較,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同類型的酶對果膠多糖得率的影響

由圖2可知,纖維素酶和半纖維素酶都顯著地提高了果膠多糖得率(P<0.05),木瓜蛋白酶對果膠多糖得率的影響不顯著。其中纖維素酶提取果膠多糖的得率最高,為5.05%,是未加酶的1.7倍。這可能是因為果膠多糖常與纖維素和半纖維素通過共價鍵或者離子鍵連接在一起,而纖維素酶中的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶能夠有效地破壞細胞壁的纖維素結(jié)構(gòu),松散的細胞壁可以促進果膠多糖物質(zhì)的溶出,從而使果膠多糖的提取率顯著提高[30]。因此,后續(xù)的實驗選擇纖維素酶作為實驗用酶。

2.2.2 纖維素酶的添加量對果膠多糖得率的影響 酶的添加量對果膠多糖得率有一定的影響,由圖3可以看出,得率隨著加酶量的增大而增大。當(dāng)加酶量小于1.0%時,果膠多糖得率隨著酶添加量的增加而迅速增加;但當(dāng)加酶量大于1.0%時,果膠多糖得率的增加趨勢減緩?？赡茉蚴敲笣舛鹊脑龃罂墒姑概c底物原料更多的接觸,使得纖維素更多的分解,從而釋放出來更多的果膠多糖;但加酶量大于1.0%時,在相同的酶解時間內(nèi),果膠多糖得率的提高趨勢減緩,可能是由于在該底物濃度下,酶濃度已經(jīng)趨于飽和,細胞內(nèi)果膠多糖已大部分溶出,繼續(xù)增加纖維素酶用量還會使其水解產(chǎn)物較大程度地水解為小分子物質(zhì),在水溶液中與果膠多糖競爭,最終使果膠多糖溶解變得更慢。同時,過高的酶添加量也會顯著增加成本。綜合考慮,選擇1.0%為該酶的最佳添加量。

圖3 不同的酶添加量對果膠多糖得率的影響

2.2.3 料液比對果膠多糖得率的影響 由圖4可知,隨著料液比增大,當(dāng)料液增加為1∶35時,達到最大值5.13%,料液比繼續(xù)再增大時,果膠多糖得率略有下降。在較低的料液比時,酶濃度較大,雖然酶分子與底物可充分接觸,但因其果膠多糖濃度過高,固液相的濃度差過小,果膠多糖受該溫度下溶解度的限制,其提取率并不高[31]。而料液比較大時,酶濃度較低,短時間內(nèi)果膠多糖不能被充分提取;料液比過大不但增加了溶劑的使用,而且增加了后續(xù)濃縮和干燥過程的時間和成本。綜合考慮,選擇1∶35作為最佳料液比進行提取。

圖4 料液比對黃秋葵果膠多糖得率的影響

2.2.4 pH對果膠多糖得率的影響 由圖5可知,pH為5.0時,果膠多糖得率最高。pH高于或低于5.0時果膠多糖得率均有所下降。不同來源的纖維素酶的最適pH可能會有一定的差異,其最適pH大多在4.5～5.0之間。pH的改變會使得酶的構(gòu)象發(fā)生變化[32],酶分子的空間結(jié)構(gòu)會隨著溶液pH的不同而變化,在最佳pH下,酶分子上活性基團的構(gòu)象最適于與底物結(jié)合。實驗結(jié)果表明,pH5.0時果膠多糖得率最高。

圖5 不同pH對果膠多糖得率的影響

2.2.5 提取時間對果膠多糖得率的影響 圖6可知,黃秋葵酒渣果膠多糖得取率隨著酶解時間的增加不斷提高,但當(dāng)提取時間大于10 h后,果膠多糖得率增加趨于平緩。這說明增加酶解時間可以使纖維素酶對細胞壁中的纖維素物質(zhì)充分酶解,從而提高果膠多糖的提取率,但酶解時間的繼續(xù)增加并沒有顯著提升果膠多糖的提取率。其原因可能是過長的提取時間使得酶的催化活性降低,進而在提取后期對果膠多糖得率影響不大;并且過長的提取時間使大量的酒渣內(nèi)雜質(zhì)溶解進入提取液,同時產(chǎn)生大量的酶解產(chǎn)物與果膠多糖分子競爭,從而影響果膠多糖的提取[21]。所以,綜合考慮后選擇10 h作為提取時間較為合適。

圖6 不同提取時間對果膠多糖得率的影響

2.2.6 提取溫度對果膠多糖得率的影響 由圖7知,隨著溫度從35 ℃增加到40 ℃,果膠多糖得率增加到了最大值。之后再升高溫度,果膠多糖得率逐漸降低。溫度對果膠多糖得率的影響主要有兩個方面:一是溫度影響溶質(zhì)的擴散系數(shù)、大分子溶液的粘度以及某些物質(zhì)的溶解度,較高的提取液溫度可以使整個體系黏度降低,傳質(zhì)速率加快,果膠多糖的溶解度變高,致使果膠多糖得率提高;二是溫度可以影響酶的活性,高于或者低于酶的最適溫度都會使酶的活性不能充分發(fā)揮。因此,40 ℃是該提取體系的最適溫度。

圖7 不同提取溫度對果膠多糖得率的影響

2.2.7 提取次數(shù)對果膠多糖得率的影響 從圖8中可以看出,隨著提取次數(shù)的增加,黃秋葵酒渣果膠多糖得率也隨之增加。但是提取次數(shù)超過2次過后,其累計得率的增加幅度變小。提取次數(shù)的增加會使得后續(xù)的濃縮和醇沉更為復(fù)雜,增加成本和時間。所以,提取次數(shù)應(yīng)選擇2次為宜。

圖8 提取次數(shù)對果膠多糖得率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化黃秋葵酒渣果膠多糖的提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果見表2和表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 響應(yīng)面方差分析表

根據(jù)表2和表3的試驗結(jié)果,使用Design Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)分析,并將試驗數(shù)據(jù)回歸擬合二次多項方程模型,得到黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖得率R對提取溫度(A)、提取pH(B)、液料比(C)的二次多項回歸模型為:

R=+6.97+0.19A+0.27B+0.26C+0.18AB-0.19AC-0.21BC-0.57A2-0.76B2-0.23C2

2.3.2 試驗因素交互作用對響應(yīng)值影響的3D分析 如圖9所示,溫度(A)和pH(B)對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖得率的交互影響顯著(P<0.05)。當(dāng)pH一定時,黃秋葵果膠多糖得率隨提取溫度的升高先增大后減小,果膠多糖得率在40 ℃左右達到最大值。而當(dāng)固定提取溫度時,提取率隨著pH的增大先升高后降低,在pH為5.1達到最大值。這是由于pH和溫度都會顯著影響酶的活性,大于或小于最佳溫度和pH都會使得酶活性降低,從而使得率隨之降低。

圖9 提取溫度和pH交互作用對果膠多糖得率的影響

如圖10所示,提取溫度(A)和提取料液比(C)之間也有顯著的交互作用(P<0.05)。當(dāng)提取溫度不變時,增加料液比,果膠多糖得率先逐漸增加,而后增速漸緩,超過最高點后略有下降;而提取料液比不變時,果膠多糖得率隨提取溫度的增大先升高后下降,在40 ℃左右提取率達到最大值。

圖10 提取溫度和料液比交互作用對果膠多糖得率的影響

提取液pH和料液比的交互作用對得率的影響顯著(P<0.05)。圖11顯示了在提取料液比1∶35、pH為5(中心點值)條件下,料液比和提取液pH對得率的影響。在不同pH下,料液比對黃秋葵果膠多糖提取的影響不同,pH較低時,料液比的變化對黃秋葵果膠多糖得率的影響更為明顯,料液比的增大使得率先增大后減小;當(dāng)pH在5.0附近時,得率不再明顯變化。而當(dāng)料液比不變時,pH的增大會使提取率先增大后減小。

圖11 提取液pH和料液比交互作用對果膠多糖得率的影響

2.3.3 最佳提取工藝及驗證實驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件求解回歸方程,得到黃秋葵酒渣中果膠多糖的最佳提取工藝條件為:提取溫度44.5 ℃、pH=5.14、液料比1∶35.7、提取時間10 h、提取2次,果膠多糖的理論得率達6.74%;按照調(diào)整后的工藝條件:提取溫度45 ℃、pH=5.5、液料比1∶36、提取時間10 h、提取2次;經(jīng)過3次驗證實驗,實際得率為6.85%±0.21%,與理論預(yù)測值的相對誤差為1.6%,說明用響應(yīng)面對黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖的提取進行工藝優(yōu)化具有實際意義。

2.4 黃秋葵酒渣果膠多糖主要理化性質(zhì)分析

酶法提取的黃秋葵酒渣果膠多糖的主要理化性質(zhì)如表4所示。與從黃秋葵中提取得到的果膠多糖比較從黃秋葵酒渣中提取得到果膠多糖的蛋白質(zhì)含量較低,灰分和半乳糖醛酸含量較高,具有較高的酯化度。原料經(jīng)過了發(fā)酵、蒸餾等加工,可能導(dǎo)致部分半乳糖醛酸的損失、酯化度的改變、灰分的增加和其它性質(zhì)的變化;半乳糖酸酸含量較低可能是由于黃秋葵果膠多糖本身特性決定的。

表4 黃秋葵酒渣果膠多糖的主要理化性質(zhì)

色差分析的結(jié)果如表5。色澤是評價果膠多糖的一個指標。其色差指標中的L*、a*、b*、ΔE分別代表明度、紅綠色調(diào)、黃藍色調(diào)和色差。結(jié)果表明,從黃秋葵發(fā)酵酒渣中提取的果膠多糖明度相對偏低,介于黃色和綠色之間,其色差值遠低于白板的色差值;直接從黃秋葵中提取的果膠多糖具有較高的明度,其色差值與白板的色差值接近。其原因可能是發(fā)酵過程中混入了其他雜質(zhì),導(dǎo)致灰分和色素含量過高,使其色差偏大。

表5 黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的色差分析

2.5 黃秋葵果膠多糖的單糖組成

采用PMP柱前衍生HPLC法檢測黃秋葵酒渣果膠多糖和黃秋葵果膠多糖的單糖組成,7種單糖組分的含量如表6所示。實驗結(jié)果顯示,兩種原料提取的黃秋葵果膠多糖和黃秋葵發(fā)酵酒渣果膠多糖均含有甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖,這表明這兩種果膠多糖均屬于酸性雜多糖,7種單糖組分分別占這兩種來源的果膠多糖的54.7%和52.3%。

表6 黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組成(n=3)

黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組分的摩爾比例如圖12?？梢钥吹桨l(fā)酵后黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組分發(fā)生了部分變化。其中變化較為明顯的有鼠李糖的含量由20.0%減少到8.8%,半乳糖醛酸由22.3%增加到25.6%,葡萄糖由2.7%增加到30.6%,半乳糖醛酸由46.2%減少到20.4%,阿拉伯糖由4.8%增加到8.7%。在果膠多糖的結(jié)構(gòu)中,葡萄糖是不常見到的[9,33]。細胞壁中的葡萄糖通常以纖維素的形式存在,而纖維素結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定且不溶于水。發(fā)酵后的酒渣果膠多糖中葡萄糖比例的大幅度增加可能與發(fā)酵過程中葡萄糖類的多糖(如淀粉或白砂糖)的大量添加有關(guān)。鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸含量的變化可能與黃秋葵的成熟度以及不同的品種有關(guān),而阿拉伯糖的增加可能與纖維素酶對細胞壁的破壞有關(guān)。

圖12 黃秋葵果膠多糖和黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖摩爾比例(n=3)

3 結(jié)論

本文以黃秋葵發(fā)酵酒渣為原料,通過單因素實驗和響應(yīng)面分析試驗對黃秋葵酒渣中果膠多糖的提取工藝進行了優(yōu)化,優(yōu)化后的條件為:提取溫度45 ℃、pH=5.5、液料比1∶36、提取時間10 h、提取2次,果膠多糖的理論得率達6.74%,經(jīng)過驗證實際得率為6.85%±0.21%。

黃秋葵酒渣果膠多糖的主要理化性質(zhì)研究表明:酯化度為74.45%、半乳糖醛酸含量為20.07%、灰分含量為8.52%、蛋白質(zhì)含量為2.24%、干燥失重率為18.06%、pH為6.47。采用PMP柱前衍生HPLC法測定黃秋葵酒渣果膠多糖的單糖組分表明,從黃秋葵酒渣中提取的果膠多糖屬于酸性雜多糖,其單糖摩爾比例為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖為5.2∶8.8∶0.8∶25.6∶30.6∶20.4∶8.7。