乳酸菌協(xié)同小麥胚芽油發(fā)酵對黑曲霉生長活性的影響

史夢潔,閆博文,Faizan Ahmed Sadiq,范大明,連惠章,田豐偉,趙建新,*,張 灝,陳 衛(wèi)

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.無錫華順民生食品有限公司,江蘇無錫 214218)

烘焙食品在世界范圍內(nèi)擁有悠久的歷史,而我國烘焙產(chǎn)業(yè)起步較晚,始于上世紀八十年代,長期以來有著廣闊的市場前景。據(jù)統(tǒng)計,我國每年因腐敗變質(zhì)而損失的烘焙食品約占總數(shù)的20%～30%,給市場和社會帶來了極大的經(jīng)濟損失[1]。食品防腐劑能有效防止食物因微生物滋生所引起的腐敗變質(zhì),延長食品的貨架期和食用價值,并具有持續(xù)性的效果[2]。根據(jù)防腐劑來源主要分為化學防腐劑和天然防腐劑。目前,食品工業(yè)中通常以化學防腐劑為主,如山梨酸鉀、苯甲酸鈉和亞硝酸鹽等[3];它具有成本低、效果好等特點。但化學防腐劑的添加可能具有積累性毒性,尤其亞硝酸鹽產(chǎn)生致癌性,因此,化學食品防腐劑的添加量被各國嚴格的控制[4-5]。而天然防腐劑通常是從動植物或微生物代謝產(chǎn)物中分離而來,具有成分天然、無毒的特點,因此,天然防腐劑的開發(fā)與使用成為當今市場的研究熱點。

乳酸菌可代謝產(chǎn)生多種天然防腐劑,由于其被美國食藥管理局認證為GRAS(Generally Regarded As Safe)并通過歐盟的安全資格認定,近年來成為商業(yè)開發(fā)的理想對象,研究者們針對乳酸菌抑菌活性也開展了系列的研究工作[6]。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在發(fā)酵時能夠產(chǎn)生具有抗真菌活性的代謝物,如乙酸、丙酸、苯乳酸、小分子肽、羥基脂肪酸等[7]抑菌活性物質(zhì)。然而,以乙酸和丙酸為例,兩種酸對于黑曲霉的最小抑菌濃度分別為1.38～4.32和0.59～1.48 g/L[8],乳酸菌代謝合成該兩種物質(zhì)的生成量卻較為有限[9-11],分散在食品體系中導致低于活性物質(zhì)本身的最小抑菌濃度,從而造成抑菌效果不佳,限制了其在烘焙食品中的應用。

目前,最新研究證實乳酸菌可代謝亞油酸并將其轉(zhuǎn)化為羥基不飽和脂肪酸,由于該物質(zhì)具有極低的最小抑菌濃度,僅為0.4～0.5 g/L,且乳酸菌可通過自身代謝滿足其合成量,因此,在食品中的應用具有極高的潛力[12]。小麥胚芽油(WG)是一種以小麥胚芽為原料的谷物胚芽油,一方面含有高含量(50%～60%)的亞油酸[13],另一方面具有極高的營養(yǎng)價值。因此,本研究擬采用優(yōu)選乳酸菌與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵,觀察其對黑曲霉生長抑制活性的影響,進而明確其對面包貨架保質(zhì)期的影響,為烘焙面包的天然生物防腐保鮮提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌菌株 江南大學食品生物技術(shù)中心菌庫;黑曲霉 中國普通微生物菌種保藏管理中心;MRS固體培養(yǎng)基 蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,牛肉膏 10.0 g,乙酸鈉2.0 g,葡萄糖20.0 g,磷酸氫二鉀2.6 g,檸檬酸氫二銨10.0 g,硫酸錳0.25 g,硫酸鎂0.5 g,吐溫-80 1.0 mL,瓊脂粉20.0 g,蒸餾水1.0 L,pH6.0～6.4;MRS液體培養(yǎng)基 不添加瓊脂粉，其它同MRS固體培養(yǎng)基;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司;乳酸、乙酸 分析純,國藥集團化學有限公司;胰蛋白酶、過氧化氫酶 分析純,美國Sigma公司;小麥粉 五得利面粉集團有限公司;酵母 安琪酵母股份有限公司;小麥胚芽油 中禾健元生物科技有限公司。

SW-CJ-2F型蘇州安泰凈化工作臺 蘇州安泰凈化公司;GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)、MJP-150型霉菌培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;JY20002 型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;Thermo K3酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司;SM-302N型切片機 無錫新麥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗真菌乳酸菌的初篩 初篩采用雙層平板法,將MRS培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制作下層平板,用乳酸菌在下層平板上劃兩條2 cm長的平行線,平行線間距1 cm,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,將5 mL黑曲霉孢子濃度為106個孢子/mL的PDA半固體培養(yǎng)基倒在下層平板上,輕輕搖晃使上層培養(yǎng)基均勻分布于整個平板,將平板水平放置20 min左右,待其徹底凝固時置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20～24 h。檢驗乳酸菌周圍抑菌圈。根據(jù)抑菌圈大小為抑菌效果做出評價[14]。

1.2.2 抗真菌乳酸菌的復篩

1.2.2.1 乳酸菌無細胞發(fā)酵上清液(CFS)的制備 將菌株從保菌管劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃下活化48 h,液體管傳代兩次。將傳代兩次后的菌液以1%的接種量接種到mMRS(不含乙酸鈉)液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵菌液以10000 r/min離心10 min,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾制得無細胞發(fā)酵液(cell-free fermentation supernatant,CFS),-20 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.2.2.2 黑曲霉孢子懸液的制備 將黑曲霉從保菌管劃線接種于PDA固體培養(yǎng)基上,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d后,倒入無菌水,用接種環(huán)刮取孢子,將孢子液經(jīng)已滅菌的紗布過濾,除去菌絲體即為孢子懸液。孢子懸液經(jīng)充分振蕩后,用血球計數(shù)板測定孢子濃度,將孢子濃度調(diào)整為105個/mL[16]。

1.2.2.3 微孔板法測定乳酸菌無細胞發(fā)酵上清液抑菌率 取無菌的96孔微量滴定板,在每個孔中加入10 μL 用mMRS液體培養(yǎng)基稀釋到105個孢子/mL的黑曲霉孢子液,加入190 μL各條件下乳酸菌無細胞上清液;同時以190 μL的mMRS培養(yǎng)基,加10 μL 105個孢子/mL的孢子液作為對照。將96孔板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h至對照組生長出霉菌菌絲體,每組測定三個平行。酶標儀檢測OD值(580 nm)并計算抑菌率[17]。

抑菌率計算公式為:抑菌率(%)=100-100(ODLAB-ODCFS)/(ODcontrol-ODMRS)

式中:ODLAB表示黑曲霉在乳酸菌CFS中培養(yǎng)36 h的OD值;ODCFS表示乳酸菌CFS的OD值;ODcontrol表示黑曲霉在mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后的OD值;ODMRS表示不添加黑曲霉孢子液的mMRS培養(yǎng)基OD值。

1.2.3 抗真菌乳酸菌無細胞上清液pH的測定 將制備的各菌株無細胞上清液裝入10 mL離心管中,采用pH計測定上清液pH,平行測定3次。

1.2.4 抗真菌乳酸菌與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌率測定及分析

1.2.4.1 小麥胚芽油抑菌率的測定 將小麥胚芽油進行兩倍連續(xù)梯度稀釋,96孔微量滴定板測定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),MIC定義為抑制霉菌生長的最低化合物濃度,每組測定三個平行。在添加黑曲霉孢子懸液之前,層流罩中蒸發(fā)去除作為小麥胚芽油溶劑的乙醇[11]。

1.2.4.2 乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液的制備及抑菌率測定 將乳酸菌接種到液體培養(yǎng)基中,分別添加入濃度為0、10、20、30 μL/mL的小麥胚芽油,以120 r/min的轉(zhuǎn)速進行搖床培養(yǎng)48 h,將發(fā)酵菌液以10000 r/min離心10 min,經(jīng)過濾制得協(xié)同發(fā)酵上清液(Synergistic fermentation supernatant,SFS),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 熱處理對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將乳酸菌SFS分裝于15 mL無菌離心管中,橡皮筋捆綁并置于搪瓷杯中,加入一定量去離子水,在電磁爐上進行加熱,待水沸騰開始計時,15 min后關(guān)掉電磁爐,等待上清液冷卻至室溫。用微孔板法測試其抑菌效果。

1.2.4.4 中和pH對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將乳酸菌SFS用2 mol/L NaOH溶液進行中和[6],調(diào)節(jié)pH到6.6,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾制得無菌體中和SFS,置于50 mL無菌離心管中保存。微孔板法測試中和處理上清液的抑菌效果。

1.2.4.5 蛋白酶及過氧化氫酶處理對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 將乳酸菌SFS用1.0 mol/L NaOH調(diào)至胰蛋白酶作用的最佳pH7.4,加入胰蛋白酶使其終濃度為1 mg/mL。37 ℃下處理4 h,調(diào)pH至代謝產(chǎn)物初始pH。微孔板法檢測其抑菌效果。

取2.0 mL的菌株發(fā)酵液,將其pH調(diào)為7.0,加入20 mg過氧化氫酶,輕輕搖晃至溶解,置于37 ℃保溫2 h,再將pH調(diào)為排除酸作用時所確定的對照pH,以未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液作為對照,測定抑菌活性。

1.2.5 抗真菌乳酸菌與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵在吐司面包中的應用研究

1.2.5.1 乳酸菌協(xié)同小麥胚芽油發(fā)酵組面包 將45 mL發(fā)酵乳桿菌菌液、1.5 mL小麥胚芽油和45 g小麥粉,混合均勻,置于恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)箱溫度設置為37 ℃,恒溫培養(yǎng)24 h;稱取175 g小麥粉、45 g乳酸菌協(xié)同小麥胚芽油發(fā)酵制得的酸面團、4 g安琪酵母粉、4 g鹽和45 mL水置于攪拌缸內(nèi)混合8 min,攪拌得到用于制作面包的混合面團并置于30 ℃醒發(fā)箱醒發(fā)25 min;將面團分成小劑,搟制排氣,面餅卷起置于烤盒中,再一次醒發(fā)成形,設置醒發(fā)箱溫度37 ℃,相對濕度85%,醒發(fā)105 min;然后將醒發(fā)的面包面團置于烤箱內(nèi),180 ℃烘烤25 min,冷卻至室溫;面包切片噴灑黑曲霉孢子液進行保質(zhì)期測定。

1.2.5.2 不同組別的制備 對照組面包的制作:乳酸菌發(fā)酵組面包:與1.2.5.1的區(qū)別是酸面團發(fā)酵時不添加小麥胚芽油,其他制作步驟同上。

化學酸化組面包:制備用乙酸乳酸混合物酸化的酸面團吐司面包作為對照:用0.27%的乙酸(100% w/w)和乳酸(85% w/v)的混合物以1∶4的比例將面團酸化至pH4.1～4.4。

普通對照組面包:面團通過將200 g面粉與120 mL水、4 g鹽、4 g糖和4 g酵母混合制備面團,面團和烘烤的方法與酸面團面包的生產(chǎn)相同[18]。

添加小麥胚芽油組面包:將200 g面粉與1.5 mL小麥胚芽油、120 mL水、4 g鹽、4 g糖和4 g酵母混合制備面團,面團和烘烤的方法與酸面團面包的生產(chǎn)相同。

丙酸鈣(GAP)組面包:將200 g面粉與120 mL水、4 g鹽、4 g糖、0.5 g丙酸鈣和4 g酵母混合制備面團,面團和烘烤的方法與酸面團面包的生產(chǎn)相同[27]。

1.2.5.3 加速貯藏實驗測定面包無霉菌保質(zhì)期 將各組面包切片,每組切片設置三個平行;在面包切片表面均勻噴灑濃度為8×104個/mL的孢子液,PET包裝袋包裝,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱觀察霉菌生長情況,以出現(xiàn)霉菌斑點作為觀察截止點[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為三次平行測量的平均值,運用SPSS軟件進行方差分析(ANOVA)和最小顯著差異分析(LSD),顯著差異df水平取P<0.05。研究數(shù)據(jù)處理均采用Origin 8.0軟件分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗真菌乳酸菌的初篩

黑曲霉為發(fā)酵米面食品中常見腐敗真菌,因此,本文以黑曲霉作為指示菌,通過雙層平板法從40株乳酸菌中篩選得到12株具有抗真菌活性的乳桿菌,其抗真菌活性的強弱根據(jù)抑菌圈的形態(tài)及大小進行選擇。若抑菌圈邊界分明,圈內(nèi)清晰透明,縱向直徑大于1.5 cm為抗真菌活性較強的菌株;若抑菌圈邊界模糊,有少量菌絲體生長,縱向直徑在1～1.5 cm之間則為抗真菌活性中等的菌株;幾乎沒有抑菌圈的菌株則認為其不具有抗真菌活性,通過圖1可以觀察到雙層平板法篩選菌株對于黑曲霉菌絲體的生長抑制具有明顯差異。本研究篩選得到的12株乳酸菌為雙層平板法中具有較強和中等抗真菌活性的菌株,并對其進行后續(xù)篩選研究。

圖1 抗真菌活性乳酸菌初篩雙層平板結(jié)果示意圖

2.2 抗真菌乳酸菌的復篩及發(fā)酵上清液pH測定

基于初篩結(jié)果,通過微孔板法進行復篩驗證。由于乙酸鈉在培養(yǎng)乳酸菌的MRS培養(yǎng)基中具有抑制真菌生長的作用,因此在初篩和復篩實驗中對培養(yǎng)基進行了改良,防止黑曲霉受到乙酸鈉的干擾而抑制生長[20-21]。通過抑菌率計算公式計算乳酸菌無細胞上清液對黑曲霉的抑制率。此外,為了探究pH是否是影響乳酸菌CFS抑菌率的直接因素,對12株乳桿菌上清液進行pH測定,如表1所示。結(jié)果表明,乳酸菌CFS抑菌率并未隨著pH的升高而規(guī)律下降,即低pH并不是導致其具有較高抑菌活性的直接原因,這與吳燕等[22]的研究結(jié)果相似。然而,低pH卻是乳酸菌抗真菌活性提高的必要條件,根據(jù)經(jīng)典的“弱酸理論”,低酸環(huán)境可使乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機酸進入真菌細胞膜釋放氫離子酸化細胞質(zhì),造成質(zhì)子梯度的崩潰,從而產(chǎn)生抑菌作用[9,23-24]。

表1 乳酸菌株無細胞上清液pH及微孔板法抑菌率

2.3 抗真菌乳酸菌與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌率測定及分析

2.3.1 小麥胚芽油抑菌率的測定 為了明確小麥胚芽油對黑曲霉生長情況的影響,以乙醇作為溶劑,通過微孔板法測定不同濃度梯度下小麥胚芽油的抑菌活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥胚芽油對黑曲霉并未表現(xiàn)出抗真菌活性(數(shù)據(jù)未列出),因此可排除小麥胚芽油對黑曲霉抑菌活性的影響。

2.3.2 乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌率測定 為了驗證乳酸菌與小麥培養(yǎng)油協(xié)同發(fā)酵對黑曲霉生長抑制活性的影響,基于復篩實驗結(jié)果,分別選取2株抑菌率大于85%的菌株(LP9/LF45)和3株抑菌率小于55%的菌株(LF5/LF27/LP36),將其與不同濃度梯度的小麥胚芽油共同發(fā)酵,并對其發(fā)酵上清液抑菌率進行測定,結(jié)果如圖2所示。

圖2 復篩菌株與不同濃度小麥胚芽油SFS抑菌率

由圖2可知,2株抑菌率大于85%的菌株,在添加不同濃度的小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵后,其抑菌率未出現(xiàn)顯著變化,這可能與這兩株菌初始抑菌率較高,加入小麥胚芽油共發(fā)酵后效果不明顯或未與其產(chǎn)生代謝反應有關(guān);而3株抑菌率小于55%的菌株,在添加不同濃度的小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵后,發(fā)酵乳桿菌LF5的協(xié)同發(fā)酵上清液隨小麥胚芽油添加濃度的增加而抑菌率提高,其他兩株菌株協(xié)同發(fā)酵上清液的抑菌率則并未表現(xiàn)出顯著提升。Black等[12]證實Lactobacillushammesii可代謝亞油酸生成羥基脂肪酸,該物質(zhì)具有較低的MIC值,通過與細胞膜相互作用,提高膜通透性,進而產(chǎn)生抑菌作用[11]。由此推測,發(fā)酵乳桿菌LF5可能代謝利用小麥胚芽油生成具有良好抑菌活性成分,使得其共發(fā)酵上清液的抑菌率發(fā)生明顯的提升。

2.3.3 不同處理對乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液抑菌性能的影響 為了進一步探究發(fā)酵乳桿菌LF5與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵上清液中抗真菌活性成分的物質(zhì)基礎,通過對其上清液進行熱處理、中和pH、蛋白酶和過氧化氫酶處理,并以具有良好抗真菌活性的植物乳桿菌LP9-小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵上清液作為對照,初步分析發(fā)酵乳桿菌LF5與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵上清液中具有抗真菌活性的物質(zhì)組分,結(jié)果如表2所示。

表2 不同處理條件下乳酸菌協(xié)同發(fā)酵上清液對黑曲霉的抑菌率結(jié)果

由表2可知,加熱處理和過氧化氫酶處理后LP9-小麥胚芽油組與LF5-小麥胚芽油組抑菌率并未發(fā)生顯著變化,由此推測其抗真菌活性物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性,且排除了體系中可能含有過氧化氫所產(chǎn)生的抗真菌活性;經(jīng)蛋白酶處理后,LP9-小麥胚芽油組抑菌活性略有降低,說明其抑菌成分中含有部分蛋白類物質(zhì),如抗菌活性肽等。而經(jīng)pH中和后,兩組抑菌率發(fā)生顯著下降(P<0.05),說明協(xié)同發(fā)酵上清液中抗真菌活性組分仍主要以有機酸為主,此外還含有部分具有良好熱穩(wěn)定性的抗真菌活性成分有待進一步研究。Liang等[25]通過高速逆流色譜檢測發(fā)現(xiàn)乳酸菌可代謝植物籽油中亞油酸生成一種單羥基不飽和脂肪酸,并證實了該物質(zhì)對菌絲體真菌及酵母的抑制效果。而小麥胚芽中亞油酸含量較高,故推測發(fā)酵乳桿菌LF5與小麥培養(yǎng)油協(xié)同發(fā)酵抑菌活性的提升可能與乳酸菌代謝亞油酸產(chǎn)生具有良好抗真菌活性的羥基脂肪酸有關(guān)。

2.4 抗真菌乳酸菌與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵在吐司面包中的應用研究

為了驗證乳酸菌與小麥胚芽油協(xié)同發(fā)酵對延長面包貨架保質(zhì)期的影響,研究采用優(yōu)選乳酸菌與小麥培養(yǎng)油共發(fā)酵方式制備酸面團,并用于吐司面包的制作。將面包切片表面均勻噴灑一定量的黑曲霉孢子液,觀察并記錄面包切片表面霉菌生長情況,如圖3所示。

圖3 不同發(fā)酵方式吐司面包的無霉菌保質(zhì)期貯藏對比

由圖3貯藏實驗比較可知,小麥胚芽油組和發(fā)酵乳桿菌LF5組制得面包,與普通對照組面包的霉菌生長情況相似,均在2～3 d出現(xiàn)肉眼可見霉菌;丙酸鈣組和植物乳桿菌LP9組則在第4 d出現(xiàn)肉眼可見霉菌。與其他組別相較,化學酸化組第6 d才觀察到霉菌的生長,說明有機酸組分和低pH環(huán)境仍是抑制霉菌生長的有效辦法[26-27]。此外,植物乳桿菌LP9/發(fā)酵乳桿菌LF5協(xié)同小麥胚芽油發(fā)酵制得面包,兩組均在第5 d發(fā)現(xiàn)肉眼可見霉菌。Mattia等[27]曾采用哈馬斯氏乳桿菌協(xié)同蓖麻油酸發(fā)酵同樣有效抑制了酸面團面包的霉菌生長。由此說明,篩選得到的乳酸菌協(xié)同小麥胚芽油發(fā)酵可明顯提升抗真菌活性,且有助于延長面包的貨架保質(zhì)期。

3 結(jié)論

乳酸菌抑制黑曲霉的生長主要與其代謝產(chǎn)生有機酸組分以及創(chuàng)造的低pH環(huán)境有關(guān),且其與小麥培養(yǎng)油一同培養(yǎng)可代謝生成具有良好熱穩(wěn)定性的抗真菌活性物質(zhì),這可能與乳酸菌代謝小麥胚芽油中的亞油酸生成具有良好抗真菌活性的羥基脂肪酸有關(guān),且該協(xié)同作用具有菌株特異性。通過采用優(yōu)選乳酸菌協(xié)同小麥胚芽油發(fā)酵制備酸面團面包可知,該方法可有效延緩黑曲霉的生長,延長面包貨架保質(zhì)期,這也為乳酸菌在發(fā)酵米面食品中的應用提供新的思路與方向。