益生菌對(duì)2型糖尿病小鼠的調(diào)節(jié)作用

白 璐,張 喆,梁 曦,呂優(yōu)優(yōu),周 慧,張峻雪,易華西,劉同杰,公丕民,馮麗榮,冷友斌,*,張?zhí)m威,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266000;2.中國(guó)飛鶴有限公司,北京 100015)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病,其中2型糖尿病占糖尿病病例的90%～95%[1]。此外,2型糖尿病還會(huì)引發(fā)許多并發(fā)癥,例如糖尿病腎病、心血管疾病、動(dòng)脈硬化和高血壓等,甚至引起死亡。目前,全球成年人群中2型糖尿病的患病率已達(dá)到8.3%。人口老齡化以及飲食結(jié)構(gòu)變化加劇糖尿病人數(shù)量增加,在我國(guó)每年有130萬(wàn)人死于糖尿病及其并發(fā)癥[2]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明,2型糖尿病的病因除了肥胖、遺傳、胰島素自身功能不全外,還與宿主的腸道菌群密切相關(guān)[3]。與正常人群相比,2型糖尿病患者表現(xiàn)出中度微生物菌群失調(diào)現(xiàn)象[4],擬桿菌豐度下降,機(jī)會(huì)致病菌豐度增加,引起葡萄糖糖耐量、血糖等指標(biāo)的改變,加快2型糖尿病的進(jìn)程[5]。因此,保持體內(nèi)微生物平衡,有利于機(jī)體保持正常的代謝、維持良好的免疫功能預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。乳桿菌和雙歧桿菌、丁酸芽孢桿菌等是腸道微生物內(nèi)一類具有活性的特殊的益生菌群[7],研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充這些有益菌,可增加腸道內(nèi)有益菌、減少有害菌、改變腸道微生物結(jié)構(gòu),從而展示出預(yù)防和治療糖尿病潛力[8],益生菌可以通過增加粘蛋白水平改善腸道屏障功能[9]、增加抗炎癥因子調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[10],通過降低膽固醇水平改善胰島素抵抗,通過減輕氧化應(yīng)激水平減輕組織損傷[11]等途徑改善糖尿病。然而,不同菌株作用效果有差異,菌株間相互作用效果也不同,菌株如何發(fā)揮益生作用及其作用靶點(diǎn)等相關(guān)機(jī)制都有待于進(jìn)一步揭示。

本文首先以α-葡萄糖苷酶活性、疏水性和自聚性為指標(biāo),從34株益生菌中篩選出具有潛在降糖功效和黏附能力的菌株;通過高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)構(gòu)建2型糖尿病小鼠模型,研究膳食補(bǔ)充益生菌對(duì)抗糖尿病的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試益生菌 中國(guó)海洋大學(xué)功能性乳品與益生菌工程實(shí)驗(yàn)室保藏的34株益生菌[12];鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC 53103) ATCC公司;SPF級(jí)C57BL/6J雄性6周齡小鼠 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)為SCXK(魯)20140007;STZ 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;α-葡萄糖苷酶(50 U/mg prot)、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) 上海源葉生物科技有限公司;阿卡波糖 拜爾醫(yī)藥保健有限公司;葡萄糖試劑盒(京食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2401130號(hào)) 中生北控生物科技股份有限公司;糖化血紅蛋白試劑盒(A056-1-1)、胰島素ELISA試劑盒(H203)、腫瘤壞死因子-αELISA試劑盒(H052)、白介素-6 ELISA試劑盒(H007) 南京建成生物工程研究所;碳酸鈉、二甲苯、乙醚、檸檬酸鈉、葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Man Rogosa Sharp(MRS)培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;普通飼料、高脂飼料 均由本實(shí)驗(yàn)室自制，普通飼料脂肪含量10%,高脂飼料脂肪含量40%;二乙基丁酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酸、丁酸、丙酸標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Dr.Ehrensorfer標(biāo)準(zhǔn)品公司。

LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司;TG20KR-D高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;YP202N電子天平 上海精科儀器有限公司;DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;GC6890氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司;GA-3血糖儀 三諾生物傳感有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)菌株接種于MRS培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)18 h,離心(8000 r/min,10 min,4 ℃)收集菌體,并用PBS(pH7.4)緩沖液洗滌3次,最終重懸于PBS(pH7.4)中,調(diào)節(jié)菌液濃度為1×109CFU/mL。其中鼠李糖乳桿菌LGG為商業(yè)菌株,已證實(shí)其在體內(nèi)具有降糖作用[13],本研究以其作為陽(yáng)性對(duì)照菌株。

1.2.2 降糖益生菌的體外篩選

1.2.2.1 益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定 通過α-葡萄糖苷酶抑制率進(jìn)行益生菌降糖功能篩選。按王芬等[14]方法測(cè)定益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。α-葡萄糖苷酶(50 μL,0.1 U/mL)與25 μL益生菌菌懸液(在0.1 mmol/L的PBS(pH6.8)中配制),并在37 ℃下孵育10 min。再加入0.1 mmol/L的PBS中配制的PNPG(25 μL,20 mmol/L)以引發(fā)反應(yīng),并將混合物在37 ℃下水浴20 min,最后加入Na2CO3(100 μL,20 mmol/L)終止反應(yīng),OD405 nm下測(cè)定反應(yīng)吸光值。鼠李糖乳桿菌LGG為陽(yáng)性對(duì)照組,按式(1)進(jìn)行計(jì)算。

式(1)

式中:A1為只含有酶的吸光度;A2為PBS吸光度;A3為含有酶和樣品的吸光度;A4為只含有樣品的吸光度。

1.2.2.2 益生菌疏水性、自聚性測(cè)定 通過疏水性能和自聚性能對(duì)具有良好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株進(jìn)行自身特性評(píng)價(jià)。鼠李糖乳桿菌LGG為陽(yáng)性對(duì)照組。根據(jù)Amany等[15]MATH法測(cè)定菌株的表面疏水性。將培養(yǎng)好的菌株離心(4000 r/min,5 min,4 ℃)收集菌體,用PBS(pH7.4)緩沖液洗滌2次。將收集好的菌體重懸于PBS(pH7.4)中,OD400 nm下調(diào)節(jié)菌懸液吸光度至0.4左右,記為A0。取3 mL菌液與1 mL二甲苯混合,將混合液渦旋30 s后室溫靜置30 min,在OD600 nm下測(cè)定混合溶液中水相的吸光值,記錄為Ax。按式(2)計(jì)算菌株的表面疏水性。

式(2)

根據(jù)Ruth等[16]的方法進(jìn)行自聚性測(cè)定。將過夜培養(yǎng)的菌株離心(4000 r/min,5 min,4 ℃)并收集菌體沉淀物。將沉淀物用PBS(pH7.4)緩沖液洗滌兩次并重懸,記錄OD600 nm下的吸光值為At0。取菌液4 mL渦旋10 s后在室溫下靜置3 h。3 h后,將0.1 mL的上層懸浮液加至3.9 mL的PBS(pH7.4)中,在OD600 nm下測(cè)定吸光度,記錄吸光值為At1。按式(3)計(jì)算菌株自聚性。

式(3)

1.2.3 體內(nèi)探究降糖益生菌的效果及作用機(jī)制

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組設(shè)計(jì) 60只雄性C57BL/6J小鼠,采用Manaer等[17]的方法建立2型糖尿病小鼠模型。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,小鼠飼養(yǎng)于((22±2) ℃,濕度55%±5%,12 h光照/暗循環(huán))的籠子里。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為:正常組(N):普通飼料喂養(yǎng)小鼠,在第5周的第1 d,正常組小鼠用0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH4.4)進(jìn)行腹腔注射。糖尿病組(DM)、阿卡波糖藥物治療組(Acarbose)、LGG治療組(菌株LGG)、J5治療組(菌株J5)和K11治療組(菌株K11)小鼠前4周以高脂飼料喂養(yǎng),并在第5周的第1 d,按照100 mg/kg·bw的劑量腹腔注射STZ(冰上避光,現(xiàn)配現(xiàn)用,溶解于0.1 mmol/L pH4.2的檸檬酸鹽緩沖液中)。在STZ注射的7 d后,測(cè)量所有小鼠血糖,小鼠空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后血糖≥11.1 mmol/L認(rèn)定糖尿病造模成功[18]。從第6～13周開始,小鼠接受普通飼料。從第6周開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,所有小鼠每天灌胃一次,阿卡波糖藥物治療組(Acarbose)灌胃100 mg/kg·bw阿卡波糖溶液;益生菌組灌胃10 mL/kg·bw濃度為1×109CFU/mL的菌液;N組與DM組灌胃10 mL/kg·bw的PBS緩沖液(pH7.4)。

1.2.3.2 小鼠血清及組織的處理 第13周(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)),小鼠禁食不禁水12 h后,腹腔注射100 mg/kg·bw的氯胺酮麻醉后,眼球取血,然后脫臼處死。血液在4 ℃下3000 r/min條件下離心10 min,然后用小量程移液槍小心吸取上層液體即為血清,儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆?。在?shí)驗(yàn)的第13周(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)),收集小鼠糞便,冰上放置,然后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冷凍保藏備用。

1.2.3.3 小鼠血糖、口服葡萄糖耐量的測(cè)定 小鼠尾尖取血,利用血糖儀每周測(cè)定所有小鼠空腹血糖值和餐后2 h血糖值。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前(第13周),小鼠禁食12 h,測(cè)定小鼠灌胃葡萄糖溶液(2 g/kg·bw)后0、30、60、90和120 min的血糖變化[19]。根據(jù)血糖值繪制曲線,軟件計(jì)算葡萄糖曲線下面積(AUCglucose)。

1.2.3.4 指標(biāo)檢測(cè) 用ELISA法按照試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中糖化血紅蛋白、血清胰島素、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1),并通過酶標(biāo)儀測(cè)定其含量。并按照式(4)計(jì)算胰島素抵抗指標(biāo)HOMA-IR水平。

式(4)

1.2.3.5 短鏈脂肪酸的分析 參照Tao等[20]所述方法進(jìn)行樣品前處理。稱取0.1 g糞便并加入1200 μL超純水。攪碎混勻后,加入50 μL的50%的濃硫酸酸化,室溫靜置5 min,每分鐘渦旋一次。隨后,4875 r/min離心10 min。收集上清,加入內(nèi)標(biāo)二乙基丁酸50 μL和無(wú)水乙醚300 μL,充分混勻30 s,5000 r/min離心10 min。最后,取乙醚層5 μL用于氣相色譜檢測(cè)。參照王琳琳[21]等所述方法進(jìn)行短鏈脂肪酸分析。采用安捷倫GC6890氣相色譜儀檢測(cè)小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量,所用氣相色譜柱為DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 nm×0.2 μm),所用檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(FID),上樣量為5 μL,不分流,載氣為氮?dú)?流速恒定為1 mL/min,設(shè)定程序溫度和保持時(shí)間分別為:初始溫度100 ℃,0.5 min;以8℃/min升到180 ℃,1 min;20 ℃/min升至220 ℃,5 min;進(jìn)樣口和檢測(cè)器均為250 ℃。通過內(nèi)標(biāo)法分別計(jì)算出乙酸、丙酸、丁酸含量,內(nèi)標(biāo)物為二乙基丁酸。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行組間比較,數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間比較,組間差異檢驗(yàn)采用Duncan檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 降糖益生菌的體外篩選

2.1.1 益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果 抑制α-葡萄糖苷酶的活性可延緩或阻礙碳水化合物的代謝,預(yù)防餐后高血糖的發(fā)生,該酶抑制率通常作為體外篩選降糖物質(zhì)的指標(biāo)[22]。通過α-葡萄糖苷酶抑制率評(píng)估菌株的降糖功能,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,在35株益生菌中,9株菌株可以有效抑制α-葡萄糖苷酶活性,抑制率在5.66%～17.14%之間,其中K11、J5、G15和K14這4株乳桿菌抑制率較高(分別為15.92%±3.40%、13.05%±3.17%、10.78%±2.68%和9.54%±6.61%),該4株菌株對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均可達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照菌株LGG抑制活性的50%[13];其余菌株未檢測(cè)到對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

表1 益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.1.2 益生菌疏水性能和自聚性能 益生菌只有黏附并定殖于腸上皮才能發(fā)揮功效,菌株的定殖黏附能力越好,其發(fā)揮功效的可能性越大。疏水性和自聚性常用于衡量菌株體外黏附能力。在通過α-葡萄糖苷酶抑制率篩選出9株具有潛在降糖功能益生菌的基礎(chǔ)上,測(cè)定其疏水性和自聚性能,一般認(rèn)為,益生菌表面疏水性在20%以上,則具有黏附能力;自聚性小于10%,則認(rèn)為沒有自聚性能[23-24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,G15、J5、K11、YRL45和J23這5株乳桿菌的疏水性均大于20%;在這5株表面疏水性能良好的菌株中G15沒有檢測(cè)到自聚性能。結(jié)合益生菌對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率,菌株J5、K11和G15具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。體外篩選出具有良好降糖能力與益生特性的菌株為:副干酪乳桿菌J5和干酪乳桿菌K11。

圖1 菌株表面疏水性和自聚能力的比較

2.2 體內(nèi)探究降糖益生菌的效果及作用機(jī)制

2.2.1 補(bǔ)充益生菌對(duì)空腹血糖和餐后血糖的影響 空腹血糖≥7.0 mmol/L是糖尿病檢測(cè)最常用的指標(biāo)[18]。空腹血糖結(jié)果如圖2A所示,注射STZ后,造模組小鼠的空腹血糖值≥7.0 mmol/L,造模成功。在第5周到第13周期間,DM組空腹血糖水平顯著高于N組(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)的第13周末,與DM組相比,所有組均顯著降低了小鼠的空腹血糖水平(P<0.05),補(bǔ)充干酪乳桿菌K11和副干酪乳桿菌J5將小鼠空腹血糖降低了37.62%和31.38%(P<0.05),與LGG組不存在顯著性差異。餐后血糖代表葡萄糖負(fù)荷后的血糖水平,餐后血糖≥11.1 mmol/L是早期診斷糖尿病的重要指標(biāo)[18]。餐后血糖結(jié)果如圖2B所示,在實(shí)驗(yàn)的第13周末,與DM組相比,所有組均能顯著降低小鼠的餐后血糖水平(P<0.05),其中效果最好的為K11組,補(bǔ)充干酪乳桿菌K11將餐后血糖降低了36.36%(P<0.05),與Acarbose組和LGG組不存在顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果表明,干酪乳桿菌K11能緩解糖尿病小鼠的高血糖狀態(tài)。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間小鼠血糖水平變化

2.2.2 補(bǔ)充益生菌對(duì)小鼠口服葡萄糖耐量的影響 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)是一種葡萄糖負(fù)荷實(shí)驗(yàn),以衡量胰島β細(xì)胞功能狀況以及機(jī)體對(duì)于血糖的調(diào)節(jié)能力[25]。在實(shí)驗(yàn)的第13周末進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3A所示,糖尿病小鼠在口服葡萄糖溶液30 min內(nèi)血糖迅速上升,并在接下來(lái)的90 min內(nèi)緩慢下降,所有時(shí)間點(diǎn)內(nèi)DM組的血糖值均高于N組(P<0.05)。根據(jù)口服葡萄糖耐量曲線,利用軟件計(jì)算葡萄糖曲線下的面積(AUCglucose)并繪制柱狀圖。AUCglucose數(shù)值越大,證明機(jī)體糖耐量受損越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B所示,與DM組相比,K11組AUCglucose顯著下降了22.72%(P<0.05)。這些結(jié)果表明,補(bǔ)充干酪乳桿菌K11能夠有效緩解2型糖尿病小鼠的糖耐量受損癥狀。

圖3 益生菌對(duì)小鼠OGTT(A)和AUCglucose(B)的影響

2.2.3 補(bǔ)充益生菌對(duì)小鼠糖化血紅蛋白、胰島素水平以及胰島素抵抗的影響 血紅蛋白與葡萄糖經(jīng)過緩慢不可逆的結(jié)合生成糖化血紅蛋白,與血糖高低密切相關(guān)。結(jié)果如圖4A所示,與DM組相比,干酪乳桿菌K11緩解由糖尿病帶來(lái)的糖化血紅蛋白升高效果最好(P<0.05),可將糖化血紅蛋白水平降低18.84%,顯著優(yōu)于LGG組(P<0.05)。在2型糖尿病患者體內(nèi),胰島素水平增高卻無(wú)法發(fā)揮有效作用,即胰島素抵抗。如圖4B所示,DM組小鼠胰島素分泌水平顯著高于N組(69.83%)(P<0.05);K11、LGG、J5組均能夠顯著降低胰島素水平,但各組間不存在顯著性差異(P>0.05);HOMA-IR指數(shù)是衡量機(jī)體胰島素抵抗水平的指標(biāo),如圖4C所示,DM組小鼠HOMA-IR指數(shù)顯著增高(P<0.05);其中補(bǔ)充干酪乳桿菌K11可將HOMA-IR指數(shù)顯著降低37.57%(P<0.05),效果與LGG組不存在顯著性差異,但不及Acarbose組(P<0.05)。這一結(jié)果表明,補(bǔ)充干酪乳桿菌K11能夠較好的緩解由2型糖尿病帶來(lái)的胰島素抵抗(P<0.05)。

圖4 益生菌對(duì)小鼠糖化血紅蛋白(A)、血清胰島素水平(B)和胰島素抵抗(C)的影響

2.2.4 補(bǔ)充益生菌對(duì)小鼠炎癥因子的影響 炎癥因子狀態(tài)在2型糖尿病的發(fā)病過程中也起著非常重要的作用,TNF-α引起胰島素抵抗,而IL-6會(huì)對(duì)胰島細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,進(jìn)而加快糖尿病的進(jìn)程[26]。如圖5所示,2型糖尿病顯著增加了小鼠血清內(nèi)TNF-α水平(47.15%)(P<0.05),其中補(bǔ)充干酪乳桿菌K11可將小鼠血清內(nèi)TNF-α水平顯著降低9.70%(P<0.05),但效果不及LGG組和Acarbose組;與此同時(shí),DM組小鼠體內(nèi)IL-6水平顯著升高(73.36%)(P<0.05),補(bǔ)充干酪乳桿菌K11能夠顯著降低由2型糖尿病帶來(lái)的IL-6水平升高(P<0.05),K11組可將小鼠血清內(nèi)的IL-6水平降低18.54%(P<0.05),效果與LGG組和Acarbose組不存在顯著性差異(P>0.05)。這一結(jié)果表明,干酪乳桿菌K11對(duì)降低TNF-α和IL-6含量效果最為顯著(P<0.05)。

圖5 益生菌對(duì)小鼠促炎因子水平的影響

2.2.5 補(bǔ)充益生菌對(duì)小鼠GLP-1分泌的影響 腸道菌群產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)分子短鏈脂肪酸與G蛋白偶聯(lián)受體GRP43(也被稱為FFAR2)結(jié)合,隨后誘導(dǎo)GLP-1的分泌,GLP-1對(duì)胰島素的合成和釋放以及β細(xì)胞增殖具有實(shí)質(zhì)性影響,并能改善胰島素敏感性[27]。如圖6所示,與N組相比,DM組GLP-1水平顯著降低(P<0.05);補(bǔ)充干酪乳桿菌K11將GLP-1水平顯著增加了38.48%(P<0.05),與LGG組(38.80%)不存在顯著差異(P>0.05)。綜合上述全部生化指標(biāo),K11組展示出了較強(qiáng)的作用,因此,確定K11組為研究對(duì)象測(cè)定其糞便中短鏈脂肪酸含量。

圖6 益生菌對(duì)小鼠血清GLP-1的影響

2.2.6 補(bǔ)充益生菌對(duì)小鼠糞便中短鏈脂肪酸水平的影響 短鏈脂肪酸是腸道菌群的主要產(chǎn)物,主要由乙酸、丙酸和丁酸組成。短鏈脂肪酸除了可以為宿主提供能量外,還具有調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用[28]。2型糖尿病會(huì)導(dǎo)致機(jī)體糞便短鏈脂肪酸含量降低,引起腸道微生物代謝活性的改變和腸道菌群生態(tài)失調(diào)[29]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,與N組相比,糖尿病小鼠糞便中乙酸、丙酸以及丁酸含量顯著降低(P<0.05)。K11組能夠顯著改善由2型糖尿病帶來(lái)的短鏈脂肪酸降低,與DM組相比,補(bǔ)充干酪乳桿菌K11可分別將乙酸、丙酸、丁酸水平提升69.61%、16.07%以及52.69%,與LGG組不存在顯著性差異(P>0.05)。由以上結(jié)果可知,干酪乳桿菌K11對(duì)提升糖尿病小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量效果顯著(P<0.05)。短鏈脂肪酸可與FFAR2和FFAR3受體結(jié)合,促進(jìn)GLP-1的釋放,最終發(fā)揮調(diào)控血糖的作用[30]。

圖7 益生菌對(duì)小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響

3 討論

2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病率不斷增高,嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[31]。2型糖尿病的典型特征就是血糖異常和胰島素抵抗。胰島素抵抗引起的血糖異常往往會(huì)導(dǎo)致一系列的健康問題。因此,穩(wěn)定血糖和改善胰島素抵抗是糖尿病治療和預(yù)防中最重要的環(huán)節(jié)。近來(lái)研究表明腸道微生物,特別是益生菌對(duì)防治糖尿病起到重要作用,但其機(jī)制尚不完全明確[32]。因此,本研究通過體外篩選出功能性益生菌,并在體內(nèi)評(píng)價(jià)益生菌對(duì)2型糖尿病小鼠模型的降糖作用及緩解胰島素抵抗的效果。

α-葡萄糖苷酶抑制劑作為治療糖尿病的一大類藥物,可以有效地減少餐后高血糖的發(fā)生[33]。已有研究表明,鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌以及雙歧桿菌等對(duì)α-葡萄糖苷酶有著良好的抑制效果[14]。本文采用以α-葡萄糖苷酶為指標(biāo)衡量菌株的功能特性,以菌株的黏附能力衡量其自身特性,從多株益生菌中篩選與降低血糖相關(guān)的菌株。本研究確定,在34株供試菌中K11、J5和G15這3株乳桿菌表現(xiàn)出了與鼠李糖乳桿菌LGG相同的良好抑制α-葡萄糖苷酶的能力。菌株的黏附能力是益生菌發(fā)揮其功效的重要前提,菌株的疏水性和自聚性與細(xì)胞黏附特性密切相關(guān),是衡量其體外黏附能力的常用指標(biāo)[22]。目前,以疏水性和自聚性作為篩選指標(biāo)衡量益生菌的性能已得到普遍認(rèn)可。本研究發(fā)現(xiàn),干酪乳桿菌K11有著良好的疏水性和自聚性能,副干酪乳桿菌J5有著良好的疏水性,但自聚性較弱。陽(yáng)性對(duì)照菌株LGG表面疏水能力較弱,這會(huì)阻礙其在腸道中定殖及持續(xù)發(fā)揮作用,這可能也是每天需要補(bǔ)充益生菌一次甚至更多次才有效的原因。另外,已有研究報(bào)道益生菌發(fā)揮作用與其菌體成分有關(guān),不是活菌也會(huì)產(chǎn)生功能性[34]。杜蘭蘭等在研究益生菌黏附特性時(shí)發(fā)現(xiàn),類植物乳桿菌L-ZS9疏水性和黏附性均優(yōu)于LGG,這與本研究研究相一致[35]。結(jié)合對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用,選取干酪乳桿菌K11和副干酪乳桿菌J5作為目標(biāo)降糖菌株,選取鼠李糖乳桿菌LGG為陽(yáng)性對(duì)照菌株進(jìn)行后續(xù)降糖作用機(jī)制的研究。

2型糖尿病是一種以血糖升高、胰島素抵抗為特征的慢性代謝疾病[36],補(bǔ)充益生菌可以抑制患者或小鼠的血糖升高。在本研究中補(bǔ)充干酪乳桿菌K11和副干酪乳桿菌J5能夠顯著降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖和餐后血糖,這可能是菌株能夠增加葡萄糖的利用,從而抑制了餐后高血糖的發(fā)展[19]。糖化血紅蛋白是用來(lái)反應(yīng)一定時(shí)間內(nèi)血糖水平的重要指標(biāo),因?yàn)樗c葡萄糖分子和紅細(xì)胞中的血紅蛋白的緩慢、不可逆的結(jié)合有關(guān)[37]。補(bǔ)充干酪乳桿菌K11和副干酪乳桿菌J5可以有效降低糖化血紅蛋白含量,證明其對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力是較為持久的。以上這些研究表明,補(bǔ)充益生菌可以通過降低空腹血糖、餐后血糖水平以及糖化血紅蛋白含量來(lái)改善2型糖尿病血糖控制情況,其中干酪乳桿菌K11的功效強(qiáng)于副干酪乳桿菌 J5。2型糖尿病患者體內(nèi)胰島素水平增高,但由于無(wú)法發(fā)揮正常功效而產(chǎn)生胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),常用HOMA-IR指數(shù)衡量胰島素抵抗水平。Hu等[38]研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充益生菌可以降低糖尿病患者胰島素水平以及HOMA-IR指數(shù),減輕胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。這些研究結(jié)果表明,益生菌對(duì)于血糖調(diào)節(jié)的有益功效,可能是基于改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)的;本研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充干酪乳桿菌K11對(duì)改善糖尿病小鼠的糖耐量受損有著良好的功效。2型糖尿病小鼠的空腹胰島素水平以及HOMA-IR指數(shù)綜合衡量了機(jī)體的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),干酪乳桿菌K11可以恢復(fù)糖尿病帶來(lái)的胰島素水平升高和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

短鏈脂肪酸是腸道內(nèi)微生物重要代謝產(chǎn)物之一,在2型糖尿病小鼠體內(nèi)短鏈脂肪酸含量的降低會(huì)導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂并加劇胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[39]。本研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充干酪乳桿菌K11顯著增加了糖尿病小鼠糞便中乙酸、丙酸以及丁酸含量。益生菌可以通過促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,進(jìn)而對(duì)L細(xì)胞上G蛋白偶聯(lián)受體FFAR2和FFAR3進(jìn)行激活,促進(jìn)GLP-1的釋放[40],降低炎癥因子最終改善胰島素抵抗和高血糖狀態(tài)[41]。GLP-1是一種參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的腸促胰島素激素,干酪乳桿菌K11作為一種新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑能夠顯著增加小鼠血清內(nèi)GLP-1的含量。同時(shí),短鏈脂肪酸還可以降低炎癥因子的水平,最終改善胰島素抵抗[42],已有研究表明短鏈脂肪酸含量的增加可以通過激活FFAR2和FFAR3受體,進(jìn)而刺激GLP-1的分泌,基于短鏈脂肪酸-G蛋白偶聯(lián)受體-GLP-1這一途徑,改善了糖尿病小鼠的炎癥狀態(tài),最終達(dá)到降低糖尿病小鼠的血糖、改善胰島素抵抗的功效。

4 結(jié)論

本研究通過α-葡萄糖苷酶抑制率、表面疏水性和自聚能力指標(biāo)篩選出具有潛在降糖功效和良好腸道黏附能力的干酪乳桿菌K11和副干酪乳桿菌J5。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充干酪乳桿菌K11可以維持血糖穩(wěn)定、改善胰島素分泌、減輕胰島素抵抗,并可以有效降低糖尿病小鼠血清中炎癥因子TNF-α及IL-6水平,最終改善了糖尿病小鼠的糖代謝紊亂,其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸含量刺激血糖代謝靶向通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。未來(lái)需進(jìn)一步研究益生菌是如何調(diào)控短鏈脂肪酸參與改善機(jī)體血糖代謝,緩解2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。