蒙藥扎沖十三味丸抗風(fēng)濕炎癥性疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

黃先菊，董悅，王晶，佟海英，陳路遙,崔競(jìng)文

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074；2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029)

風(fēng)濕炎癥性疾病包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等多種以炎癥為主要誘導(dǎo)致病因素的風(fēng)濕病，目前此類(lèi)疾病患病率逐漸增加，在不同的年齡段均可發(fā)生，多見(jiàn)于中老年人.扎沖十三味丸又名嘎日迪-13，是蒙藥傳統(tǒng)方劑之一，本方出自《至高要方》，現(xiàn)已被《藥典》收錄.其共由制草烏、沉香、丁香、甘草、木香、訶子、肉豆蔻、石菖蒲、煅磁石、制珊瑚、制珍珠、禹糧土、麝香13味藥組成，在臨床上常用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛等疾病的治療[1-4].但扎沖十三味丸治療風(fēng)濕炎癥性疾病的作用機(jī)制尚未見(jiàn)系統(tǒng)闡明.本方組成復(fù)雜，由8味植物藥、2味動(dòng)物藥及3味礦物藥組成，因植物藥在方中占比較大，且動(dòng)物藥與礦物藥網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)研究較少，數(shù)據(jù)庫(kù)查找相對(duì)比較復(fù)雜，故本研究?jī)H對(duì)扎沖十三味丸中8種植物藥進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析，從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病聯(lián)系起來(lái)，預(yù)測(cè)其植物藥成分作用此類(lèi)疾病的成分靶點(diǎn)，進(jìn)一步預(yù)測(cè)其潛在作用機(jī)制.

1 方法

1.1 扎沖十三味丸活性成分的篩選

通過(guò)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)扎沖十三味丸中草烏、沉香、木香、甘草、丁香、訶子、肉豆蔻以及石菖蒲8種中藥進(jìn)行成分檢索，以口服生物利用度(OB)大于30%及藥物相似度(DL)大于0.18為條件，結(jié)合文獻(xiàn)研究篩選出以上中藥的主要活性成分.

1.2 扎沖十三味丸活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將扎沖十三味丸的活性成分輸入到 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，得到化合物的“Canonical SMILES”，然后將每個(gè)活性成分的“Canonical SMILES”輸入 SwissTarget Prediction 平臺(tái)(http://www.swisstarget prediction.ch/)，物種選擇“人類(lèi)(homo sapiens)”，預(yù)測(cè)扎沖十三味丸活性成分的潛在作用靶點(diǎn).

1.3 扎沖十三味丸抗風(fēng)濕炎癥性疾病的相關(guān)作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(http://omim.org/)及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)3個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“rheumatism”、“rheumatoid”、“arthralgia”及“sciatica”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)基因.將獲得的疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，得出共同靶基因.

1.4 扎沖十三味丸抗風(fēng)濕炎癥性疾病的靶蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

登 錄 Sring 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(https：//string-db.org/)，輸入 1.3 項(xiàng)下收集共同靶基因，設(shè)置物種為“人類(lèi)(homo sapiens)”，最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)，其余參數(shù)保持默認(rèn)，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò).通過(guò) Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建扎沖十三味丸的成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò).

1.5 GO功能富集與 KEGG通路富集分析

將所得的成分與疾病共同靶基因通過(guò)DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體論(Gene Oncology,GO)分類(lèi)富集分析和全基因組及代謝途徑富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)，通過(guò)GO分類(lèi)富集提取靶標(biāo)基因或蛋白質(zhì)的分子功能(Molecular Function,MF)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)，及其所參與的生物學(xué)反應(yīng)(Biological Process,BP)，通過(guò)這三個(gè)功能大類(lèi)，對(duì)一個(gè)基因的功能進(jìn)行多方面的限定和描述。通過(guò)KEGG通路(pathway)富集靶點(diǎn)所涉及的信號(hào)通路，以P< 0.01 及基因數(shù)≥10為條件進(jìn)行靶基因篩選，分析扎沖十三味丸抗風(fēng)濕炎癥性疾病主要信號(hào)通路及生物過(guò)程.

2 結(jié)果

2.1 扎沖十三味丸活性成分及靶點(diǎn)篩選

對(duì)扎沖十三味丸中8種植物類(lèi)中藥進(jìn)行活性成分篩選，按照 OB大于30%，DL大于0.18 的篩選條件，一共獲得93個(gè)活性成分，389個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn).方中各味藥活性成分和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)量見(jiàn)表1，利用 Cytoscape 3.6.1 軟件可構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1.

表1 扎沖十三味丸“中藥-成分-靶點(diǎn)”基本信息

圖1 扎沖十三味丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 扎沖十三味丸抗風(fēng)濕炎癥性疾病活性靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用OMIM等3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索到625個(gè)相關(guān)基因靶點(diǎn).將389個(gè)活性成分靶點(diǎn)與625個(gè)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比，最終得到61個(gè)共有靶點(diǎn)，見(jiàn)表2.并通過(guò) Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建扎沖十三味丸的成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2.

表2 扎沖十三味丸治療風(fēng)濕炎癥性疾病的作用靶點(diǎn)

圖2 扎沖十三味丸成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 共同靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò) STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 61個(gè)映射得到的風(fēng)濕炎癥性疾病交集靶點(diǎn)，構(gòu)建預(yù)測(cè)扎沖十三味丸治療風(fēng)濕炎癥性疾病靶點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見(jiàn)圖3.利用 Cytoscape 3.2.1軟件的篩選工具，篩選出該網(wǎng)絡(luò)中degree值大于30的靶蛋白，分別為凝血因子Ⅹ(F10)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、β2腎上腺素能受體(ADRB2)、前列腺素 G/H 合酶 1(PTGS1)、絲裂原活化蛋白激酶 14(MAPK14).

圖3 扎沖十三味丸抗風(fēng)濕炎癥性疾病靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集分析

GO功能分析結(jié)果顯示，以靶點(diǎn)數(shù)大于10且P<0.01 為篩選條件，可篩選出參與藥效的主要分子功能(MF)有蛋白結(jié)合、酶結(jié)合及蛋白質(zhì)均聚活性功能；參與藥效的主要細(xì)胞組分(CC)有細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞表面等；參與藥效的主要生物學(xué)過(guò)程(BP)有炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、NF-kappaB轉(zhuǎn)錄因子活性正調(diào)控、基因表達(dá)正調(diào)控、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控等.其所包含的靶點(diǎn)數(shù)見(jiàn)圖4.

圖4 GO功能富集分析

2.5 KEGG富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示，以靶點(diǎn)數(shù)大于10且P<0.01為篩選條件，篩選出主要信號(hào)通路有18條，作用靶點(diǎn)及其所在信號(hào)通路見(jiàn)表3.

表3 KEGG通路富集

結(jié)果顯示：扎沖十三味丸中活性成分通過(guò)作用于人體中風(fēng)濕炎癥性的相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)體內(nèi)信號(hào)通路如 TNF 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、癌癥通路、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用信號(hào)通路等產(chǎn)生影響，最終影響疾病的發(fā)生發(fā)展，見(jiàn)圖5.

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

近年來(lái)，對(duì)于風(fēng)濕炎癥性疾病[5-7]中的RA的相關(guān)機(jī)制研究較多，研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在RA的發(fā)病機(jī)制中有著重要作用，MMPs失調(diào)會(huì)影響腫瘤壞死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)等上調(diào)或抑制[8-9].還有研究表明JAK2/STAT3信號(hào)通路廣泛參與了 RA 患者滑膜細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管翳形成和機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程[10]，如何通過(guò)減少滑膜細(xì)胞的增殖、促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡和抑制對(duì)風(fēng)濕因子的分泌都成為臨床治療中的重要研究方向.扎沖十三味丸在蒙醫(yī)藥理論中，為治療白脈病之方.白脈病系指赫依、血交博，損及白脈引起的以麻木、腫痛、萎縮、拘攣為特征的病證，又稱(chēng)“白痹”[11-12].本方功能祛風(fēng)通竅、舒筋活血、鎮(zhèn)靜安神、除“協(xié)日烏素”，能主治半身不遂、左右癱瘓、口眼歪斜、四肢麻木、腰腿不利、語(yǔ)言不清、筋骨疼痛、神經(jīng)麻痹、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)疼痛[13].

在現(xiàn)代研究與經(jīng)典理論背景下，本研究在扎沖十三味丸治療類(lèi)似疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方面，得到了大量相關(guān)靶點(diǎn)基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶系(MMP1/MMP3/MMP8/MMP9)、白介素(IL-2/IL-6/IL-8/IL1A/IL1B)、趨化因子(CXCL10/CXCL11/CCL2)、TNF等炎癥相關(guān)靶點(diǎn)基因，結(jié)果與已有的研究相關(guān)疾病結(jié)果符合.通過(guò)GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)：與細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程相關(guān)的結(jié)果共有6條，如炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等，與已有研究也較符合.KEGG通路富集結(jié)果顯示：扎沖十三味丸可能通過(guò)TNF、破骨細(xì)胞分化、Toll樣受體、癌癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、MAPK、細(xì)胞因子受體相互作用等信號(hào)通路對(duì)風(fēng)濕炎癥性疾病發(fā)揮作用，而這類(lèi)通路與細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥/免疫反應(yīng)也密切相關(guān)，其結(jié)果與GO分析也較為符合.

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法[14]得出:扎沖十三味丸治療風(fēng)濕炎癥性疾病可能是通過(guò)TNF、破骨細(xì)胞分化等信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程產(chǎn)生影響而發(fā)揮作用，該預(yù)測(cè)的成分、靶點(diǎn)、途徑等具有可信性，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究提供較為可靠的依據(jù).