雷公藤多苷與呋塞米聯(lián)用治療腎病綜合征人體內(nèi)相互作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通路預(yù)測(cè)*

袁薪蕙，李自強(qiáng)，黃宇虹，王保和，杜 犀

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

雷公藤多苷（TG）為中藥雷公藤的提取物，有免疫抑制與抗炎作用，可用于治療原發(fā)性腎病綜合征[1]。呋塞米為臨床常用與首選的治療水腫的袢利尿劑[2]。二者在臨床治療腎病綜合征方面應(yīng)用廣泛。目前這類草藥與化藥聯(lián)用時(shí)人體內(nèi)的藥物相互作用[3]正在成為研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的藥物相互作用研究通常通過人體藥代動(dòng)力學(xué)[4]實(shí)驗(yàn)中血藥濃度差異或藥效學(xué)人體生化指標(biāo)的變化推斷兩藥之間的協(xié)同或拮抗作用，進(jìn)一步深入的機(jī)制研究通常借助于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)，故筆者探索性地采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，在實(shí)驗(yàn)室研究前預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與通路，以期探索在雷公藤多苷與呋塞米共同進(jìn)入人體后可能發(fā)生的藥物相互作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要活性成分預(yù)測(cè) 通過檢索TCMSP、ChEMBL、PubChem Compound數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻(xiàn)獲得TG的化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)及其化學(xué)性質(zhì)和呋塞米的分子結(jié)構(gòu)及其化學(xué)性質(zhì)。保存兩種藥所包含化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式（.sdf格式）或Smiles號(hào)。

根據(jù)類藥五原則[5]篩選TG主要活性成分。類藥五原則要求化合物分子質(zhì)量（MW）≤500、氫鍵給體（n OHNH）≤5、氫鍵受體（n OH）≤10、脂水分配系數(shù)（X LogP）≤5、可旋轉(zhuǎn)鍵 RBN＜10。該原則的目的是篩選出生物體內(nèi)代謝過程中生物利用度更符合口服藥物條件的成分[6]。

1.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

1.2.1 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在PharmmapperServer[6-8]、SEA、Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫輸入1.1獲得的藥物成分，分別獲得并匯總TG和呋塞米人體潛在作用靶點(diǎn)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫，獲得這些靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的人類基因，建立excel數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 人體腎病綜合征潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得人類腎病綜合征疾病的靶點(diǎn)（基因）。

1.2.3 兩藥人體腎病綜合征潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過合并1.2.1與1.2.2靶點(diǎn)，分別獲得TG主要成分、呋塞米分別對(duì)應(yīng)的人體腎病綜合征相關(guān)靶點(diǎn)，進(jìn)行對(duì)比分析，并找出兩藥共同作用靶點(diǎn)。

1.2.4 核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在String數(shù)據(jù)庫分別導(dǎo)入TG與呋塞米的靶點(diǎn)（在1.2.3獲得），獲得兩藥各自靶點(diǎn)間相互作用（PPI）關(guān)系，保存為.TSV格式，把文件中node1和node2數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，獲得參數(shù)Degree，以“Degree≥2倍中位數(shù)”為標(biāo)準(zhǔn)分別篩選出兩藥核心靶點(diǎn)[9]。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.3.1 PPI網(wǎng)絡(luò)圖 分別將1.2.4得到的兩藥核心靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，將node1、node2、Combined score數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，獲得兩藥的靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3.2 核心靶點(diǎn)組織分布預(yù)測(cè) 使用BioGPS數(shù)據(jù)庫，篩選出兩藥核心靶點(diǎn)的主要組織分布（定義該靶點(diǎn)的基因表達(dá)量大于中位數(shù)的組織為靶點(diǎn)的主要分布組織）；使用Cytoscape軟件構(gòu)建作用靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)圖，得出TG、呋塞米治療腎病綜合征主要分布的組織或器官。

1.3.3 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 利用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建兩藥治療腎病綜合征的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

在Systems Dock Web Site Version 2.0網(wǎng)站分別對(duì)TG化合物、呋塞米與其腎病綜合征靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。取TG的Degree排名前4位靶點(diǎn)、呋塞米的全部靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，獲得Docking Score用以評(píng)價(jià)兩藥化合物與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。同時(shí)評(píng)價(jià)與對(duì)比TG、呋塞米與人體腎病綜合征靶點(diǎn)的結(jié)合程度差異。

1.3.4 “化合物-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖 在DAVID網(wǎng)站分別對(duì)兩藥靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。參數(shù)設(shè)置為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，Species選擇homo sapiens，選擇functional annotation tool。利用Cytoscape3.6.0軟件繪制“化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行對(duì)比分析。

2 研究結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的確定 通過數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)檢索，共獲得TG中化學(xué)成分48種[10-15]。其中主要化學(xué)成分14個(gè)，為雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內(nèi)酯酮、山海棠素、雷公藤對(duì)琨B、雷公藤對(duì)琨H、雷公藤對(duì)琨A、雷公藤內(nèi)酯三醇、TriptobenzeneH、Triptobenzene A、Triptohairic acid（雷酚萜酸）、Tripterifordin、Triptonolide、Celafurine。其結(jié)構(gòu)式如圖1?；瘜W(xué)性質(zhì)如表1所示。呋塞米分子結(jié)構(gòu)如圖2，化學(xué)性質(zhì)如表2，TG主要化學(xué)成分與呋塞米均符合類藥五原則人體口服藥物條件。

表1 雷公藤多苷主要活性成分及其部分性質(zhì)Tab.1 The main active ingredients and properties of TG

表2 呋塞米化學(xué)性質(zhì)Tab.2 Furosemide chemical properties

2.2 核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2.1 兩藥人體內(nèi)腎病綜合征靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索獲得腎病綜合征相關(guān)人類基因1 124個(gè)；TG主要化合物人體作用靶點(diǎn)共768個(gè)；呋塞米人體作用靶點(diǎn)377個(gè)。合并整理得到TG人體腎病綜合征作用靶點(diǎn)136個(gè)；呋塞米人體腎病綜合征作用靶點(diǎn)81個(gè)。

呋塞米能作用到腎病綜合征所有靶點(diǎn)的7.21%，占呋塞米全部作用靶點(diǎn)的21.54%。TG能作用到腎病綜合征所有靶點(diǎn)的12.19%，占TG所有作用靶點(diǎn)的17.84%。TG覆蓋呋塞米本病作用靶點(diǎn)70個(gè)，占呋塞米本病作用靶點(diǎn)的86.42%，占雷公藤多苷本病作用靶點(diǎn)的51.1%。見圖3。

研究結(jié)果提示TG覆蓋人體腎病綜合征靶點(diǎn)多于呋塞米，且覆蓋呋塞米的大部分腎病綜合征靶點(diǎn)。

2.2.2 核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 篩選出TG核心作用靶點(diǎn)（Degree＞48）26 個(gè)：RELA、GSR、PTGS2、MTOR、NOS2、MMP2、IGF1、MPO、NOS3、SRC、F2、ACE、MAPK1、EGFR、CASP3、JUN、G6PD、IL1B、CYP3A4 、CXCL8、SERPINA1、TP53、MMP9、AKT1、IL6、ALB。

呋塞米核心作用靶點(diǎn)（Degree＞34）10個(gè)：ALB、AKT1、MMP9、MAPK1、EGFR、SRC、CASP3、IGF1、PTGS2、ICAM1。除ICAM1外，均為TG共同的核心作用靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖 核心靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)見圖4。其中左側(cè)為TG的PPI網(wǎng)絡(luò)，右側(cè)為呋塞米的PPI網(wǎng)絡(luò)。圖中圓形代表連接度Degree，圓形越大，提示與其相互作用靶點(diǎn)數(shù)量越多，該靶點(diǎn)的作用越關(guān)鍵。直線反映Combine score。直線越粗，提示Combine score越高，即兩靶點(diǎn)間相互作用越強(qiáng)[9]。

網(wǎng)絡(luò)圖顯示，TG 的 ALB、AKT1、IL6、TP53、CXCL8、CASP3、PTGS2、MMP9、MAPK1、IL1B、NOS3 幾個(gè)靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)聯(lián)系較為密切，作用較為關(guān)鍵。呋塞米的核心靶點(diǎn)數(shù)量較少，其兩兩之間均有聯(lián)系，故地位同等。但是相互作用強(qiáng)度各不相同。圖中顯示，SRC與MMP9、IGF1、MAPK1、EGFR，EGFR與MAPK1，IGF1與ALB、MAPK1、AKT1的結(jié)合強(qiáng)度高于其他靶點(diǎn)。

2.4 兩藥核心靶點(diǎn)組織分布預(yù)測(cè) 圖中三角形為藥物靶點(diǎn)，圓形為組織或器官。三角形越大，提示靶點(diǎn)分布的組織數(shù)量越多；圓形越大，提示該組織的靶點(diǎn)數(shù)量越多。圖中直線表示靶點(diǎn)與組織的分布關(guān)系。直線越粗，提示在該組織中靶點(diǎn)的基因表達(dá)量越大。

兩藥共同的主要組織分布有肝、骨髓、全血、平滑肌、肺、全腦、腦橋、扁桃體、子宮、前列腺、心肌細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞等。靶點(diǎn)在上述組織基因表達(dá)量也高于其他組織。TG靶點(diǎn)單獨(dú)分布較多的組織有小腸、氣管、睪丸等，呋塞米靶點(diǎn)單獨(dú)分布較多的組織有胸腺、松果體、小腦腳掌、腎上腺皮質(zhì)等。見圖5。

2.5 化合物-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 兩藥化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖6。其中方形為藥物成分，圓形為靶點(diǎn)。綠色部分為TG主要化學(xué)成分作用的腎病綜合征核心靶點(diǎn)，紅色部分為呋塞米及其腎病綜合征核心作用靶點(diǎn)。黃色部分為TG與呋塞米共同作用的人體內(nèi)腎病綜合征核心靶點(diǎn)，分別為AKT1、ALB、MMP9、MAPK1、SRC、IGF1、EGFR、CASP3、PTGS3。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 Score越大，提示兩者結(jié)合活性越好。Score＞4.25認(rèn)為具有一定結(jié)合活性；Score＞5.0認(rèn)為結(jié)合活性較好；Score＞7.0認(rèn)為具有強(qiáng)烈結(jié)合活性[16]。TG的Docking score平均值5.748，最大值7.885，最小值4.113?？傮w上，化合物與靶點(diǎn)蛋白具有較好的結(jié)合活性。呋塞米分子對(duì)接驗(yàn)證的Docking score平均值4.51，最大值5.148，最小值3.569。測(cè)試靶點(diǎn)中只有ALBU、CASP3與呋塞米結(jié)合較好；SRC和ICAM和呋塞米一定程度上能夠結(jié)合。其他均Score值較低或無法獲得。對(duì)比研究顯示，呋塞米的化學(xué)性質(zhì)雖然也同樣符合類藥物原則，但是分子對(duì)接驗(yàn)證顯示與雷公藤多苷主要活性物質(zhì)相比，呋塞米與人體腎病綜合征靶點(diǎn)的結(jié)合活性較差。

2.7 化合物-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖 篩選出兩藥基因百分比＞10%且P＜0.01的信號(hào)通路?；衔?靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖見圖7。其中綠色部分為TG化合物及其作用靶點(diǎn)，黃色部分為TG與呋塞米共同作用靶點(diǎn)，紫色箭頭圖標(biāo)為兩藥通過作用于靶點(diǎn)在人體內(nèi)干預(yù)到的信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)圖7提示，TG與呋塞米雖作用靶點(diǎn)不全相同，但均可作用到這些信號(hào)通路，所以在藥效或藥代動(dòng)力學(xué)方面有相互協(xié)同作用或其他藥物相互作用。

3 結(jié)論

雷公藤多苷與呋塞米共同使用在治療人類腎病綜合征方面存在潛在的體內(nèi)藥物相互作用。兩藥共同作用于人體多個(gè)組織中的多個(gè)靶點(diǎn)。其中ALB、AKT1、MMP9、MAPK1、EGFR、SRC、CASP3、IGF1、PTGS2為兩藥潛在的共同核心靶點(diǎn)。它們通過干預(yù)TNF、MAPK、Toll樣受體等多條信號(hào)通路影響疾病治療。

4 討論

雷公藤多苷由雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內(nèi)酯酮等多種有效成分協(xié)同發(fā)揮藥效，通過純化保留并加強(qiáng)了中藥雷公藤的藥效[17]。呋塞米為常用的治療水腫的袢利尿劑。兩者通過同時(shí)口服進(jìn)入人體后或存在草藥與化藥之間的相互作用。

本研究討論的雷公藤多苷14種主要活性成分進(jìn)入人體內(nèi)，通過作用于腎病綜合征相關(guān)的靶點(diǎn)和靶點(diǎn)兩兩之間的相互作用，分布于體內(nèi)各個(gè)組織器官，同時(shí)作用于通路中的這些靶點(diǎn)，而對(duì)體內(nèi)信號(hào)通路產(chǎn)生影響，從而干預(yù)疾病的發(fā)展。這是符合中草藥多靶點(diǎn)多通路[18]治療疾病的特點(diǎn)的。而呋塞米作為單一成分藥效精專的化藥，本研究顯示它也會(huì)作用到部分相同靶點(diǎn)，對(duì)這些信號(hào)通路產(chǎn)生某種程度的影響。所以提示兩藥間確是存在相互作用。但二者也存在差異。從數(shù)量上來看，呋塞米治療腎病綜合征的核心靶點(diǎn)（10）不及TG的一半（26），從結(jié)合強(qiáng)度上來看，TG與靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度均較好，而呋塞米僅與部分靶點(diǎn)一定程度結(jié)合，兩者Docking score的平均值相差1個(gè)等級(jí)?？梢?，TG對(duì)信號(hào)通路的影響程度是明顯大于呋塞米的。

但是這并不能說明在治療腎病綜合征方面TG優(yōu)于呋塞米。兩者并無藥效上的可比性。TG的藥效主要集中在抗炎、免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)方面。而呋塞米類抗利尿劑主要通過抑制腎小管對(duì)NaCl的重吸收，改變滲透壓梯度差，達(dá)到利尿的效果。兩者的治療原理和側(cè)重點(diǎn)是不同的。從藥效上看，兩者分別從抗炎、免疫調(diào)節(jié)和利尿多個(gè)方面對(duì)腎病綜合征產(chǎn)生分工明確的協(xié)同治療作用。呋塞米在專于利尿的同時(shí)，對(duì)雷公藤多苷多靶點(diǎn)多通路調(diào)節(jié)產(chǎn)生一定協(xié)同作用，可進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。推測(cè)呋塞米很可能因改善Na+的重新收，影響滲透壓，在直接產(chǎn)生利尿作用影響水液代謝的同時(shí)，改善了細(xì)胞環(huán)境，從而間接地影響了代謝通路。

筆者認(rèn)為：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的本質(zhì)是數(shù)據(jù)挖掘，通過對(duì)已有的數(shù)據(jù)一系列整合，針對(duì)新問題得出新結(jié)論。本研究的意義在于在實(shí)驗(yàn)研究前為兩藥相互作用的靶點(diǎn)和通路提供一定的線索，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)有的放矢，節(jié)約經(jīng)費(fèi)。但是本研究同時(shí)存在一些不足之處。首先討論范圍集中在TG符合類五原則的14種化學(xué)成分，而實(shí)際臨床使用的雷公藤多苷片包含這些以外的其他很多種成分如雷公藤紅素等[19]。其次本研究主要討論的核心靶點(diǎn)、組織以及通路是按照排名截取的關(guān)鍵部分，并不能代表全部。比如在組織分布中，TG的主要結(jié)合靶點(diǎn)分布于小腸，而呋塞米未顯示小腸，但是在實(shí)際人體中不能排除呋塞米的某些非關(guān)鍵靶點(diǎn)分布于小腸。此外，本研究目的是討論兩藥在治療腎病綜合癥方面的相互作用，故首先檢索了腎病綜合征相關(guān)人類靶點(diǎn)。如果針對(duì)其他疾病靶點(diǎn)進(jìn)行研究，可能會(huì)為藥物尤其是中草藥擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供理論上的可能性。這也拓寬了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用范圍。