新型冠狀病毒SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)平臺的研究進(jìn)展

盛 楠 馬雪萍 逄淑云 宋沁馨,2 鄒秉杰*,3 周國華*,3,4

1(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥理科， 南京210002) 2(藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點實驗室， 中國藥科大學(xué)， 南京 210009) 3(南京大學(xué)生命分析化學(xué)國家重點實驗室， 南京 210093) 4(南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 南京210002)

1 引 言

自2019年12月底出現(xiàn)不明原因引發(fā)的聚集性肺炎感染事件以來[1～3]，新型冠狀病毒迅速蔓延全球。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，截至2020年5月1日，新型冠狀病毒感染人數(shù)超過300萬，疫情已影響215個國家和地區(qū)[4]，對全球人類的健康與生活造成了極大的威脅。

新型冠狀病毒是一種RNA正鏈病毒，與SARS-CoV序列相似性達(dá)79.6%[5]，2020年2月11日，國際病毒學(xué)分類委員會暫將新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2，由其引發(fā)的疾病統(tǒng)稱為COVID-19(Coronavirus disease 2019)[6]。盡管感染SARS-CoV-2的患者也會出現(xiàn)與SARS-CoV和MERS-CoV感染類似的臨床癥狀，如發(fā)熱、干咳、呼吸困難和雙側(cè)磨玻璃密度影等，且病毒潛伏期長，存在無癥狀感染者[7]， 但不同的是，多數(shù)SARS-CoV-2感染患者上呼吸道癥狀并不明顯[8]。此外，SARS-CoV-2表面的S蛋白與人受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的結(jié)合力遠(yuǎn)高于SARS-CoV[9]，這為SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)于SARS-CoV提供了分子基礎(chǔ)。正是由于多方面因素的影響，疫情早期的發(fā)現(xiàn)及防控工作中存在巨大困難，最終出現(xiàn)了SARS-CoV-2感染人數(shù)呈指數(shù)增長的局面。

在缺乏特效藥物并且疫苗尚未問世的情況下，準(zhǔn)確快速地甄別出SARS-CoV-2感染者， 并對其實施隔離是目前疫情防控的最有效手段[10]。核酸檢測在此次疫情防控中起到了至關(guān)重要的作用，尤其對于無癥狀感染者的確診和康復(fù)期患者的出院評判，SARS-CoV-2核酸檢測成為了主要標(biāo)準(zhǔn)[11]。因此，發(fā)展方便、快速、準(zhǔn)確的SARS-CoV-2核酸檢測方法對疫情防控尤其重要。

從疫情爆發(fā)至今，已開發(fā)出多種SARS-CoV-2核酸檢測方法，這些方法原理各異，利用的檢測平臺不同，有各自的優(yōu)缺點與適用范圍。本文將根據(jù)檢測平臺對現(xiàn)有的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)進(jìn)行介紹和比較，為臨床選擇合適的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)提供參考，并對今后建立更安全、更準(zhǔn)確、更快速的病原體核酸檢測技術(shù)平臺提出了展望。

2 基于不同平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

2.1 基于高通量測序平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

DNA高通量測序技術(shù)憑借其直接測定基因組序列、通量高等優(yōu)勢，近年來成為核酸檢測的重要工具，涌現(xiàn)出很多測序平臺，如454焦磷酸測序[12]、Solexa測序[13]等第二代測序平臺，以及SMRT測序[14]、納米孔測序[15]等第三代測序平臺。這些平臺在疾病診斷[16]、微生物群落分析[17]、病原體鑒定[18]等方面應(yīng)用廣泛。此次疫情中的病原體也是通過第二代測序平臺轉(zhuǎn)錄組測序(圖1)分析患者肺泡灌洗液樣本所發(fā)現(xiàn)。測序結(jié)果經(jīng)序列比對顯示，SARS-CoV-2與SL-CoVZC45病毒的序列一致性達(dá)89.1%[19]。得益于高通量測序技術(shù)，研究人員在疫情初期獲得樣本的第一時間進(jìn)行測序， 獲取了SARS-CoV-2的完整序列信息，為后續(xù)建立快速檢測方法提供了基礎(chǔ)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序原理(SBS測序法)Fig.1 Principle of transcriptome sequencing (SBS sequencing)SBS, sequencing by synthesis

因此，高通量測序平臺最大的優(yōu)勢在于可發(fā)現(xiàn)未知病原體，并獲得未知病原體的基因全序列，非常適用于疫情爆發(fā)初期病原體的甄別，并為進(jìn)一步開發(fā)病原體核酸檢測方法提供序列信息。此外，采用高通量測序技術(shù)還能實時跟蹤病原體核酸的變異情況，這在病原體溯源、疫苗開發(fā)、疾病流行趨勢的預(yù)判等方面具有重要作用。

然而，高通量測序平臺在進(jìn)行病原體檢測時，常因其儀器價格高、檢測周期長、檢測成本高等問題而難以推廣應(yīng)用。與其它測序平臺相比，納米孔測序技術(shù)讀長更長，可進(jìn)行RNA的直接測序，從測序到出結(jié)果的時間可由數(shù)天縮減至數(shù)小時，并能實時輸出測序結(jié)果，儀器設(shè)備小巧，因此, 在病原體檢測方面具有一定優(yōu)勢。近期，武漢大學(xué)劉天罡教授等組建的聯(lián)合團(tuán)隊開發(fā)了利用MinION納米孔測序平臺建立的靶向多重呼吸道病原體檢測方法[20]，可在6～10 h內(nèi)對包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種呼吸道病毒進(jìn)行檢測。隨著測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信會有更快、更簡便、更準(zhǔn)確的測序技術(shù)問世， 進(jìn)一步推動測序平臺在病原體檢測方面的應(yīng)用。盡管納米孔測序技術(shù)已將高通量測序的單次運行成本由數(shù)萬元降至不足1萬元，但對于臨床應(yīng)用而言檢測成本仍然較高，因此，目前的測序平臺難以實現(xiàn)低成本快速檢測SARS-CoV-2，未能在此次疫情防控中廣泛使用，但在SARS-CoV-2變異、溯源與機(jī)制研究中依然具有不可替代的地位。

2.2 基于實時熒光PCR平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

與高通量測序平臺相比，實時熒光PCR平臺憑借一臺小巧的實時熒光定量PCR儀，即可實現(xiàn)對已知序列靶標(biāo)核酸的高靈敏定量檢測，因其穩(wěn)定可靠、操作簡便，成為目前應(yīng)用最廣的核酸檢測平臺。疫情爆發(fā)的第一時間，各大科研機(jī)構(gòu)和公司根據(jù)SARS-CoV-2基因序列研制了基于實時熒光PCR平臺的SARS-CoV-2核酸檢測方法與試劑盒。這些方法多基于熒光標(biāo)記探針對擴(kuò)增的靶核酸進(jìn)行檢測，其基本原理(圖2)是通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒由RNA序列反轉(zhuǎn)錄為DNA序列，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程; 在PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的靶標(biāo)特異性Taqman探針與靶標(biāo)序列雜交時，標(biāo)記的熒光基團(tuán)會被DNA聚合酶的核酸外切酶活性切割，產(chǎn)生熒光信號，每個循環(huán)的熒光信號被儀器記錄下來，形成擴(kuò)增曲線，根據(jù)CT值可對待測靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測[21]。目前，基于實時熒光PCR平臺的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒多根據(jù)病毒基因組中的開放閱讀框1a/b(Opening reading frame 1ab， ORF1ab)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein， N)和包膜蛋白(Envelope protein， E)基因設(shè)計引物與探針[22]，檢測靈敏度在200～1000 copies/mL范圍內(nèi)。

圖2 RT-PCR檢測原理(Taqman探針法)Fig.2 Principle of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR,Taqman probe technology)

實時熒光PCR平臺具有靈敏度高、特異性好、操作簡單等優(yōu)點，并且大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)均擁有相關(guān)儀器設(shè)備，因此，是SARS-CoV-2核酸檢測所使用的主要技術(shù)平臺。然而，傳統(tǒng)的實時熒光PCR平臺的樣本核酸提取與擴(kuò)增檢測需分開進(jìn)行，對實驗室條件和操作人員要求較高，依賴熒光定量PCR儀，檢測時間需要2～4 h，不利于現(xiàn)場篩查和資源匱乏地區(qū)使用。此外，對于病毒核酸含量低至單拷貝數(shù)量級的樣本，其檢測靈敏度還不夠高，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且受熒光標(biāo)記種類的限制，其檢測靶標(biāo)數(shù)目有限，難以實現(xiàn)多重組合篩查。

2.3 基于數(shù)字化平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

基于實時熒光PCR的SARS-CoV-2核酸檢測存在弱陽性、假陰性結(jié)果的原因除了樣本儲存或提取外，檢測方法本身靈敏度不夠高也是重要因素。當(dāng)病毒載量較低時，單個反應(yīng)中有效病毒核酸可能只有單拷貝數(shù)量級，需要具有單分子檢測能力的技術(shù)才能減少假陰性結(jié)果。數(shù)字化核酸檢測平臺是一種能對靶標(biāo)分子直接計數(shù)的平臺[23]，它利用微液滴生成系統(tǒng)或微反應(yīng)單元陣列芯片，將核酸擴(kuò)增檢測體系(通常為PCR)分成上萬個均勻的微小反應(yīng)單元(圖3)，每個反應(yīng)單元中只有單個或零個靶標(biāo)核酸分子，反應(yīng)結(jié)束后，對每個反應(yīng)單元的陰陽性計數(shù)，根據(jù)泊松分布原理即可獲得起始靶標(biāo)核酸的絕對濃度。因此，基于數(shù)字化平臺的核酸檢測方法可以準(zhǔn)確測定起始濃度低至單拷貝的靶標(biāo)核酸，解決了SARS-CoV-2檢測因病毒載量低而產(chǎn)生的假陰性問題。

圖3 數(shù)字化PCR檢測原理Fig.3 Principle of digital PCR

目前，已用于SARS-CoV-2檢測的數(shù)字化平臺主要為基于自動化微滴芯片的數(shù)字PCR技術(shù)。在體系中加入RNA模板后，經(jīng)一步反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，通過3種熒光標(biāo)記探針分別在每個反應(yīng)單元中報告SARS-CoV-2的ORF1ab基因、N基因及內(nèi)控基因擴(kuò)增產(chǎn)物，最終通過計算陽性微液滴的數(shù)目，可在2.5 h內(nèi)對SARS-CoV-2進(jìn)行高靈敏、高特異檢測。有研究比較了微液滴數(shù)字化PCR(ddPCR)和實時RT-PCR(兩種方法的靶基因均為ORF1ab基因和N基因)對323例新冠病毒感染患者樣本的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)高病毒載量的95例樣本兩種方法一致性為100%，而低病毒載量的樣本中存在不一致的檢測結(jié)果，其中67例RT-PCR檢測為單基因陽性的樣本中有41例ddPCR檢測為雙基因陽性，161例RT-PCR檢測為陰性的樣本中有4例ddPCR檢測為陽性，這些RT-PCR檢測為假陰性的樣本經(jīng)ddPCR顯示病毒絕對量為11.1～123.2 copies[24]，表明數(shù)字化PCR技術(shù)用于SARS-CoV-2檢測更靈敏。此外，由于數(shù)字化PCR技術(shù)定量分析性能更好，可用于疾病發(fā)展不同階段的SARS-CoV-2含量監(jiān)測, 進(jìn)而對病情進(jìn)行評估。

盡管數(shù)字化平臺在檢測靈敏度和定量性能方面優(yōu)于其它平臺，但數(shù)字化檢測平臺的儀器設(shè)備較昂貴，檢測通量有限，不適于對大量樣本進(jìn)行檢測。此外，受限于熒光檢測通道，該平臺難以對多靶標(biāo)進(jìn)行多重檢測。

2.4 基于核酸質(zhì)譜平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

核酸質(zhì)譜平臺采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)對核酸片段進(jìn)行分析[25,26]，常見的檢測原理如圖4所示。首先制備核酸樣本并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增富集靶標(biāo)序列，然后與基因特異性引物結(jié)合進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，純化后的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步與芯片基質(zhì)共結(jié)晶, 并在質(zhì)譜儀上檢測，期間核酸分子將受激光激發(fā)電離為單電荷離子在電場中飛行，由于飛行時間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子在質(zhì)譜儀真空管中的飛行時間可以直接獲知其分子量，從而分析出待測基因信息。

圖4 核酸質(zhì)譜法檢測原理Fig.4 Principle of mass spectrometry for nucleic acid analysisMALDI-TOF-MS, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry.

在中國醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會發(fā)布的第二批新冠肺炎疫情防治急需醫(yī)學(xué)裝備目錄中， Clin-ToF I飛行時間質(zhì)譜儀、Clin-ToF II飛行時間質(zhì)譜儀等入選，表明核酸質(zhì)譜平臺也可用于SARS-CoV-2的檢測。

核酸質(zhì)譜最大的優(yōu)勢在于可區(qū)分僅有單個堿基序列差異的寡核苷酸片段，這使多重檢測無需熒光標(biāo)記，僅通過質(zhì)量標(biāo)簽即可實現(xiàn)，因此檢測試劑的成本更低，檢測通量更高。然而，運用核酸質(zhì)譜平臺檢測靶標(biāo)核酸，需經(jīng)歷樣本前處理、PCR產(chǎn)物制備、產(chǎn)物純化和質(zhì)譜分析等多個步驟，操作繁瑣，且樣本處理要求高，MALDI不同的基質(zhì)成分也會直接影響信號的檢測。

2.5 基于紙基分析平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

紙基分析平臺是一類在紙上完成生物化學(xué)分析的檢測平臺[27]，常見的為試紙條技術(shù)[28]，降低了對儀器設(shè)備的依賴。通常，紙基分析平臺與核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)偶聯(lián)以進(jìn)一步降低對儀器設(shè)備的依賴，如基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)的試紙條[29]、基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification， RPA)的試紙條[30]等。以LAMP反應(yīng)為例，常見的試紙條檢測原理如圖5所示，63℃(60℃～65℃)恒定溫度下，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在3對LAMP引物(F3-B3、FIP-BIP和LF-LB)和具有鏈置換活性的Bst聚合酶作用下，生成大量帶標(biāo)記的靶標(biāo)LAMP產(chǎn)物; 隨后將產(chǎn)物加入試紙條的樣品墊，在緩沖液作用下層析移動，并與結(jié)合墊處修飾的膠體金作用。由于結(jié)合墊處的膠體金修飾有抗體和鏈霉親和素，當(dāng)存在靶標(biāo)序列時，發(fā)生免疫親和作用，試紙條上檢測線和質(zhì)控線位置均會出現(xiàn)肉眼可見的有色條帶； 而無靶標(biāo)時， 只有質(zhì)控線位置出現(xiàn)有色條帶。 因此，通過肉眼觀察可直接判斷陰陽性。

圖5 基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT-LAMP)試紙條的檢測原理Fig.5 Detection principle of test strip based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)

2017年出現(xiàn)的基于Cas13與RPA擴(kuò)增偶聯(lián)的SHERLOCK技術(shù)[31]已被用于檢測SARS-CoV-2，該方法設(shè)計了特異性檢測病毒刺突蛋白(Spike protein，S)基因和ORF1ab基因的核酸試紙條，1 h內(nèi)可完成檢測，靈敏度低至10～100 copies/μL[32]。此外，有研究報道將Cas12與RT-LAMP(反轉(zhuǎn)錄LAMP)偶聯(lián)，建立了基于試紙條可視化檢測SARS-CoV-2的方法，可在45 min內(nèi)檢測濃度低至10 copies/μL的RNA提取物[33]，為SARS-CoV-2現(xiàn)場快速檢測產(chǎn)品的開發(fā)提供了思路。

基于紙基分析平臺的SARS-CoV-2檢測技術(shù)采用恒溫擴(kuò)增反應(yīng)，不需要精密儀器，擴(kuò)增速度快，將擴(kuò)增產(chǎn)物加到試紙條上或?qū)⒃嚰垪l插入結(jié)束后的反應(yīng)體系中即可顯示結(jié)果，無需依賴專業(yè)分析設(shè)備，通過觀察顏色，肉眼可直接判斷有無靶標(biāo)病毒，因此操作簡便，檢測速度快，能滿足即時檢測的需求，特別適合實驗設(shè)備簡陋地區(qū)或應(yīng)急情況下的病原體核酸檢測。然而，以試紙條為代表的紙基分析平臺尚未兼容SARS-CoV-2的提取和純化操作，檢測反應(yīng)仍需在管內(nèi)進(jìn)行，需要開管進(jìn)行試紙條顯色反應(yīng)，存在產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險。此外，紙基分析平臺檢測通量低，多數(shù)方法無法定量分析，因此只能用于病原體核酸的低通量定性檢測。

2.6 基于微流控平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

傳統(tǒng)的生化檢測方法包括樣本制備、試劑處理、生化反應(yīng)發(fā)生和檢測多個階段，而微流控平臺則能將傳統(tǒng)的多步或全部操作整合到一個小型平臺上。如在紙基平臺片上發(fā)展出的微流控平臺檢測技術(shù)，即紙芯片技術(shù)[34]，樣本的核酸提取與檢測操作均整合在紙基芯片上，通過折紙工藝或紙制移動閥操縱反應(yīng)的進(jìn)行[35, 36]。然而，紙芯片技術(shù)人工操作多、靈活性差，仍處于實驗室研究階段，尚未用于SARS-CoV-2的檢測。目前，發(fā)展較為成熟的微流控平臺通常以具有良好的光學(xué)透明性、電絕緣性及反應(yīng)惰性的材料(石英、聚二甲基硅氧烷等)加工制成的微流控芯片技術(shù)為主，大小僅為幾平方厘米，利用微通道、微泵、微型進(jìn)樣閥和微型出口等裝置構(gòu)成允許少量液體流動的自動操縱系統(tǒng)[37]，達(dá)到了快速、高效、準(zhǔn)確地分析檢測樣本的目的。由于微流控平臺配套的儀器體型小，質(zhì)量輕便，因此，特別適合醫(yī)療資源缺乏地區(qū)檢測項目的開展，助力病原體的現(xiàn)場快速篩查和檢測。

博奧晶典生物公司開發(fā)了六項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒 (恒溫擴(kuò)增芯片法)，配合該公司的恒溫擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀，在簡單的樣本核酸提取后，混合核酸擴(kuò)增試劑即可上樣芯片， 在微流控平臺自動進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，1.5 h內(nèi)完成包括SARS-CoV-2在內(nèi)6種呼吸道病毒的檢測，對SARS-CoV-2能達(dá)到每反應(yīng)檢測15 copies病毒分子的靈敏度，為新冠疫情防控工作提供了高效的檢測工具。

基于微流控芯片平臺的SARS-CoV-2檢測技術(shù)將樣本檢測的多步反應(yīng)集成在了體積微小的芯片上，對檢測試劑和樣本的需求量都大大減少，且反應(yīng)速度快、自動化程度高，通過精巧的芯片設(shè)計提高了核酸檢測通量。然而，目前多數(shù)商品化微流控芯片平臺仍無法兼容樣本核酸提取的步驟，尚未實現(xiàn)全自動化的核酸檢測目標(biāo)。此外，芯片的設(shè)計和制作成本較高，有待進(jìn)一步優(yōu)化方案， 降低檢測成本。

2.7 基于整合型自動化平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)

在不同核酸檢測技術(shù)平臺中，核酸提取操作是實現(xiàn)病原體準(zhǔn)確檢測的重要環(huán)節(jié)。常規(guī)的核酸提取分為手動提取和儀器自動化提取兩種方式，但在實際檢測過程中均需人工將提取產(chǎn)物加入檢測體系，當(dāng)處理含傳染性較強(qiáng)的病毒樣本時, 會增加實驗人員的感染風(fēng)險。為了避免單獨進(jìn)行樣本核酸提取操作產(chǎn)生的問題，整合型自動化核酸檢測平臺應(yīng)運而生，這是一類集樣本提取、核酸檢測和結(jié)果輸出于一體的封閉式自動化核酸檢測系統(tǒng)，既可避免過多的人工操作帶來的誤差和生物安全問題，也可避免樣本檢測時的交叉污染風(fēng)險。

第一個整合型自動化分析平臺為GeneXpert快速檢測系統(tǒng)，其核心為一臺能實現(xiàn)全自動樣品制備和檢測的實時熒光定量PCR儀。只需在系統(tǒng)配套的封閉式卡盒中加入采集的原始樣本，儀器裝載卡盒后, 將自動完成樣本裂解、核酸提取、定量PCR檢測等一系列操作，并輸出反應(yīng)結(jié)束后的分析結(jié)果，達(dá)到 “Sample in-Anwser out”(樣本進(jìn)-結(jié)果出)的效果。目前已開發(fā)出基于GeneXpert快速檢測系統(tǒng)的新產(chǎn)品Xpert?Xpress SARS-CoV-2，可在45 min內(nèi)完成樣本的定性檢測，大大提高了SARS-CoV-2的檢測效率。然而, GeneXpert平臺的研發(fā)主要基于PCR類方法[38]，這類方法需要熱循環(huán)過程，對溫控要求高，因此儀器價格昂貴; 此外，該平臺試劑耗材成本也較高，不適于臨床推廣。因此，發(fā)展恒溫條件下的核酸擴(kuò)增和檢測技術(shù)將有利于自動化檢測儀器的成本控制，進(jìn)而降低臨床樣本的檢測成本。RNA實時熒光恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)(Simultaneous amplification and testing, SAT)是一種RNA檢測新技術(shù)，該技術(shù)通過逆轉(zhuǎn)錄將T7啟動子引入cDNA中，生成DNA雙鏈后，再由T7 RNA聚合酶催化反應(yīng)生成多個含靶標(biāo)序列的RNA分子，隨后進(jìn)入下一輪RNA逆轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄循環(huán)，全程由能結(jié)合靶標(biāo)RNA的分子信標(biāo)實時報告檢測信號，整個反應(yīng)在42 ℃ 進(jìn)行，實現(xiàn)了恒溫條件下RNA靶標(biāo)的高效擴(kuò)增與檢測[39]。2020年3月， 上海仁度生物公司基于全自動SAT核酸分析系統(tǒng)(AutoSAT)成功開發(fā)了全自動SARS-CoV-2核酸檢測平臺，實現(xiàn)了“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的封閉式自動化檢測，可對單個樣本或批量樣本進(jìn)行處理，第一個樣本從進(jìn)樣到出報告時間為90 min，24 h內(nèi)可完成700個樣本的批量檢測。

基于整合型自動化平臺的SARS-CoV-2檢測技術(shù)將樣本提取、核酸檢測與結(jié)果輸出整合在一套系統(tǒng)內(nèi)，達(dá)到了“樣本進(jìn)-結(jié)果出”式全自動檢測病原體核酸的目的，該平臺無需專業(yè)的實驗操作人員和嚴(yán)格的實驗室環(huán)境，儀器便攜，且檢測效率高、重復(fù)性好，因此特別適合病原體現(xiàn)場快速篩查。然而，目前整合型自動化平臺仍處在發(fā)展階段，儀器和耗材的價格較高，多數(shù)儀器單次運行的檢測通量較低，因此，在臨床推廣前尚有較大的發(fā)展空間。

上述技術(shù)平臺在核酸檢測方面具有各自的優(yōu)勢與不足(表1)，因此，在應(yīng)用這些技術(shù)檢測SARS-CoV-2時，需根據(jù)實際情況選擇技術(shù)平臺。如在資源緊張的應(yīng)急情況下，適合選用紙基分析平臺和微流控平臺，實現(xiàn)對SARS-CoV-2的現(xiàn)場快速篩查; 當(dāng)樣本提取獲得的核酸濃度較低或常規(guī)檢測結(jié)果呈弱陽性時，適合選用數(shù)字化平臺，實現(xiàn)對低病毒載量樣本的準(zhǔn)確檢測。

3 結(jié)論與展望

目前，世界范圍內(nèi)COVID-19的確診人數(shù)仍在增加，SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展。本文從核酸檢測技術(shù)平臺出發(fā)，介紹了SARS-CoV-2的主要檢測技術(shù)，由于不同技術(shù)平臺在核酸檢測方面具有各自的優(yōu)勢與不足，在實際應(yīng)用中需根據(jù)實際情況和具體要求選擇檢測方法。通過比較發(fā)現(xiàn)，具有檢測快速、成本低廉、不依賴大型設(shè)備等優(yōu)勢的POCT(Point-of-care testing)類技術(shù)，在對SARS-CoV-2檢測時， 也暴露出安全性不足、靈敏度低等問題。為了應(yīng)對SARS-CoV-2等具有傳染性強(qiáng)、 潛伏期長等特點的惡性病毒， 核酸檢測技術(shù)平臺的后續(xù)發(fā)展需重視兩點：檢測方法需特異性好、靈敏度高、反應(yīng)速度快; 儀器設(shè)備需人工操作少、通量高、制造成本低且更為便攜?，F(xiàn)有的全自動一體化SARS-CoV-2檢測平臺通量較低，多數(shù)平臺只能通過并行運行多臺儀器設(shè)備提高檢測通量，無疑增加了儀器設(shè)備的成本。因此，發(fā)展高通量、全自動病原體檢測平臺是今后發(fā)展的趨勢與面臨的挑戰(zhàn)。

表1 常見SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)平臺的比較