光譜法和分子對(duì)接技術(shù)研究胡桃醌與人血清白蛋白的相互作用

申炳俊 柳婷婷

(長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130022)

胡桃醌(Juglone，Jug)又名5-羥基-1,4-萘醌、5-羥基-1,4-萘二酮，屬于萘醌類(lèi)化合物。天然Jug存在于胡桃科植物胡桃楸未成熟外果皮、新鮮樹(shù)皮和枝皮中，為民間抗癌驗(yàn)方青龍衣的主要活性物質(zhì)之一[1]。近年來(lái)，Jug具有的顯著抗腫瘤活性引起了研究者廣泛關(guān)注。研究結(jié)果表明，Jug不僅對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤等多種腫瘤有抑制作用[2～5]，而且還具有抗真菌、抗衣原體和抗病毒等多種藥理活性[6～8]。Jug是目前唯一已知的肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(Pin1)抑制劑，能夠抑制Pin1活性， 以阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]， 有望成為預(yù)防和治療腫瘤的藥物。然而，Jug也能引起人纖維細(xì)胞死亡，對(duì)人體細(xì)胞有損傷作用[10,11]，Jug的毒性和合理用藥是需要重點(diǎn)研究的內(nèi)容。目前，Jug的化學(xué)性質(zhì)已明確，有關(guān)細(xì)胞毒活性、抗腫瘤作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)研究也取得了一些研究結(jié)果，但在毒性機(jī)理、體內(nèi)運(yùn)輸性質(zhì)及用藥安全方面仍有待進(jìn)一步研究。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血漿中含量最豐富的非特異性載體蛋白質(zhì)，具有多種功能。藥物進(jìn)入人體血液系統(tǒng)后，大部分先與HSA進(jìn)行可逆結(jié)合，然后進(jìn)行存儲(chǔ)、轉(zhuǎn)運(yùn)、藥效發(fā)揮或毒副作用。藥物與HSA可逆結(jié)合親和性，將直接影響藥物分子在血液中的生物利用率、分布、自由態(tài)濃度和代謝。此外，HSA還是研究藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)制的經(jīng)典模型蛋白，常被用于藥物與蛋白質(zhì)相互作用研究中[12,13]。因此，在分子水平研究藥物與HSA相互作用，不僅對(duì)于闡明藥物發(fā)揮藥理作用的機(jī)制提供依據(jù)，而且對(duì)于揭示體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)、指導(dǎo)臨床合理用藥、開(kāi)發(fā)新藥也具有重要意義。近年來(lái)，大量中藥活性成分與血清白蛋白間相互作用結(jié)果被相繼報(bào)道，其中涉及較多為黃酮類(lèi)和生物堿類(lèi)活性成分，萘醌類(lèi)活性成分研究相對(duì)較少。葛鋒等[14]利用熒光光譜法研究了紫草素(5,8-二羥基-2-[(1R)-1-羥基-4-甲基戊-3-烯基]萘-1,4-二酮)與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合反應(yīng)，獲得了兩者間結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等信息，紫草素分子萘醌結(jié)構(gòu)和多個(gè)羥基使其與BSA之間的結(jié)合以靜電作用為主，同時(shí)伴有氫鍵作用力。王麗娜等[15]用圓二色和拉曼光譜表征了Cu2+/Mn2+存在下白花丹素(5-羥基-2甲基-1,4-萘醌)對(duì)HSA構(gòu)象的影響，HSA與白花丹素作用可改變自身二級(jí)結(jié)構(gòu)、降低α-螺旋含量。Jali等[16]研究了萘醌衍生物與血清白蛋白的選擇性結(jié)合及其對(duì)細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果顯示萘醌衍生物結(jié)構(gòu)直接影響其與BSA結(jié)合常數(shù)。目前，Jug與血清白蛋白的相互作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，Jug是否能與HSA結(jié)合仍需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

本研究以HSA為模型，利用內(nèi)源熒光光譜、紫外吸收光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜以及分子模擬技術(shù)在分子水平上研究Jug與HSA的鍵和模式及作用機(jī)理，得到兩者間結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位置、作用力類(lèi)型以及相互作用過(guò)程中HSA構(gòu)象變化等信息。本研究為闡明Jug在體內(nèi)運(yùn)輸、潛在生物毒害作用和指導(dǎo)臨床合理用藥提供了的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司); F280熒光分光光度計(jì)(天津港東公司); DELTA320型pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司); DC-4006型高精度水浴鍋(上海菁海儀器公司); QL-901型振蕩器(江蘇海門(mén)其林貝爾公司); SG2200HP型超聲波清洗器(上海冠特公司); AB204-S型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

胡桃醌(Jug，純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)用無(wú)水乙醇配制成1.0×10-3mol/L儲(chǔ)備液，使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋成1.0×10-4mol/L。HSA (Sigma公司)用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.40， 含0.1 mol/L NaCl)配制成1.0×10-4mol/L儲(chǔ)備液。Jug和HSA儲(chǔ)備液均于4℃下避光保存。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 熒光光譜和同步熒光光譜在8個(gè)7 mL離心管中，分別加入0、12、24、40、80、120、200和280 μL Jug溶液(1.0×10-4mol/L)，每個(gè)離心管中均移入40 μL HSA儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol/L)，以Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA與Jug的濃度比為1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和1∶7混合液，充分混合，恒溫水浴中靜止30 min，測(cè)量熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(λem)范圍為290～410 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫為10 nm/5 nm。同步熒光光譜測(cè)定溶液配制過(guò)程同熒光光譜，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm對(duì)應(yīng)發(fā)射波長(zhǎng)范圍分別為285～335 nm和310～370 nm。

2.2.2 紫外吸收光譜準(zhǔn)確移取0、12、24、36、48、60、72和84 μL Jug儲(chǔ)備液(1.0×10-3mol/L)于8個(gè)7 mL離心管中，加入120 μL HSA儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol/L)，用Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA與Jug的濃度比為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7混合液，充分混合，室溫(20℃)下反應(yīng)30 min。以相應(yīng)濃度Jug溶液做參比，對(duì)Jug-HSA體系進(jìn)行紫外吸收光譜分析，吸收波長(zhǎng)范圍在200～400 nm。

2.2.3 三維熒光光譜在2個(gè)7 mL離心管中均加入40 μL HSA儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol/L)，將160 μL Jug溶液(1.0×10-4mol/L)加入到其中1個(gè)離心管中，以Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，獲得HSA與Jug的濃度比為1∶0和1∶4混合液，充分混合、室溫(20℃)下靜置30 min，熒光分光光度計(jì)掃描三維熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)范圍為200～350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為250～500 nm，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)間隔均為5 nm，其它參數(shù)設(shè)置與熒光光譜相同。

2.2.4 結(jié)合距離測(cè)定實(shí)驗(yàn)將40 μL HSA儲(chǔ)備液(1.0×10-4mol/L)、Jug溶液(1.0×10-4mol/L)分別加到2個(gè)7 mL 離心管中，以Tris-HCl緩沖液定容至4 mL，充分混合，室溫(20℃)下靜置30 min。測(cè)定HSA溶液熒光發(fā)射光譜，參數(shù)設(shè)置同2.2.1節(jié); 測(cè)定Jug溶液吸收光譜，波長(zhǎng)范圍為200～410 nm。

2.2.5 分子對(duì)接模擬HSA的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Protein Data Bank(蛋白質(zhì)編碼： 4K2C)。Jug的3D結(jié)構(gòu)由Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得(Compound CID: 3806)。利用Auto Dock 4.2.5.1軟件對(duì)Jug與HSA進(jìn)行分子對(duì)接模擬，應(yīng)用Lamarckian Genetic Algorithm算法得到Jug與HSA結(jié)合構(gòu)象，用PyMOL2.3.1.0軟件對(duì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光譜分析

圖1 Jug濃度對(duì)HSA內(nèi)源熒光光譜影響Fig.1 Fluorescence spectra of human serum albumin(HSA) with different concentrations of Juglone (Jug)a-h, CHSA=1.0 μmol/L, CJug=0, 0.3, 0.6, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 μmol/L; i: CHSA=0, CJug=1.0 μmol/L; T=298 K, λex=280 nm

HSA含有1個(gè)色氨酸(Trp)、18個(gè)酪氨酸(Tyr)和30個(gè)苯丙氨酸(Phe)殘基，這些芳香氨基酸特別是Trp214使HSA具有較強(qiáng)的內(nèi)源熒光[17,18]。280 nm光激發(fā)下，HSA最大熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在343 nm， 而Jug僅有微弱的熒光發(fā)射，對(duì)實(shí)驗(yàn)不產(chǎn)生“內(nèi)濾光效應(yīng)”干擾。在模擬人體生理?xiàng)l件下，不同濃度Jug對(duì)HSA熒光光譜影響結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著Jug濃度不斷增加，HSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯減弱趨勢(shì)，熒光發(fā)射峰略藍(lán)移1.7 nm，但峰形沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明HSA生色基團(tuán)所處的微環(huán)境有改變，Jug與HSA發(fā)生了反應(yīng)。

3.2 相互作用機(jī)制分析

3.2.1 熒光猝滅機(jī)制藥物引起蛋白質(zhì)熒光猝滅原因通常有靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是藥物和蛋白質(zhì)在基態(tài)時(shí)結(jié)合，形成不發(fā)熒光的復(fù)合物; 動(dòng)態(tài)猝滅則是藥物和蛋白質(zhì)激發(fā)態(tài)分子間發(fā)生電子或能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。無(wú)論動(dòng)態(tài)猝滅，還是靜態(tài)猝滅，作用過(guò)程均符合Stern-Volmer方程[13,14]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

圖2 不同溫度下Jug與HSA相互作用的Stern-Volmer曲線(xiàn)Fig.2 Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of HSA by Jug at different temperatures

式中，F(xiàn)0和F分別為Jug加入前、后HSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子碰撞過(guò)程速率常數(shù);τ0為HSA熒光壽命，約為1×10-8s; [Q]為Jug平衡濃度(μmol/L);Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。以F0/F對(duì)[Q]做線(xiàn)性擬合，繪制Stern-Volmer曲線(xiàn)(圖2)，可見(jiàn)在3個(gè)不同溫度下，Jug-HSA體系中F0/F-[Q]曲線(xiàn)均在[Jug]/[HSA]=1處出現(xiàn)明顯拐點(diǎn)，說(shuō)明Jug對(duì)HSA熒光猝滅程度和方式與Jug濃度有關(guān)。

將F0/F對(duì)[Q] Stern-Volmer擬合，根據(jù)直線(xiàn)斜率可獲得猝滅常數(shù)Ksv和Kq值。由表1可知，兩個(gè)濃度范圍內(nèi)，Jug對(duì)HSA熒光猝滅常數(shù)Ksv均隨溫度升高而減小，符合靜態(tài)猝滅特征。曲線(xiàn)存在[Jug]/[HSA]=1拐點(diǎn)，說(shuō)明Jug對(duì)HSA的猝滅方式是以靜態(tài)猝滅為主的混合猝滅過(guò)程。3個(gè)溫度條件下的Kq值(1013和1012數(shù)量級(jí))都大于生物大分子的最大分散碰撞猝滅常數(shù)(2×1010L/(mol·s))[15,16]，進(jìn)一步證明Jug和HSA形成了復(fù)合物，引發(fā)其熒光猝滅。

3.2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)蛋白質(zhì)等生物大分子通常有相互獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)。利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線(xiàn)方程(lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q])，可以計(jì)算靜態(tài)猝滅中藥物分子與蛋白質(zhì)間結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)[19]。以不同溫度下的lg(F0-F)/F對(duì)lg[Q]作圖(圖3)，由線(xiàn)性方程截距和斜率求出Jug與HSA的KA和n，結(jié)果見(jiàn)表2。n<1，說(shuō)明在Jug和HSA分子上存在一個(gè)結(jié)合點(diǎn)。在人體生理pH值和溫度下，Jug與HSA間結(jié)合常數(shù)僅為3.72×102L/mol(310 K)，這較文獻(xiàn)[14]報(bào)道的萘醌類(lèi)化合物紫草素與牛血清白蛋白間結(jié)合常數(shù)5.91×104L/mol(309 K)小2個(gè)數(shù)量級(jí)。原因在于紫草素比Jug多1個(gè)8-羥基和1個(gè)2-[(1R)-1-羥基-4-甲基戊-3-烯基]基團(tuán)，即紫草素分子有3個(gè)羥基，而Jug分子有1個(gè)羥基。此結(jié)果說(shuō)明萘醌類(lèi)化合物羥基數(shù)量可以影響其與HSA結(jié)合常數(shù)大小。Jug與HSA間結(jié)合能力偏弱，血漿中HSA運(yùn)輸和儲(chǔ)存Jug能力不強(qiáng)。由此推斷，游離態(tài)和Jug-HSA復(fù)合物應(yīng)是Jug在血液循環(huán)中的兩種運(yùn)輸方式。

表1 不同溫度下Jug對(duì)HSA的熒光猝滅常數(shù)

圖3 不同溫度下Jug和HSA相互作用的lg[(F0-F)/F]-lgCJug圖Fig.3 lg[(F0-F)/F] vs lgCJug graph describing the interaction of HSA and Jug at different temperatures

3.2.3 熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力Jug分子中有1個(gè)羥基，氫鍵作用力可能參與Jug和HSA相互作用過(guò)程。通常藥物小分子與蛋白質(zhì)間主要通過(guò)氫鍵、范德華力、靜電引力以及疏水作用力等非共價(jià)方式結(jié)合，形成超分子復(fù)合物[20]。Jug和HSA間的作用力類(lèi)型可根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變(ΔH)和熵變(ΔS)的大小、正負(fù)判斷[21]。在模擬人體生理?xiàng)l件下，HSA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不會(huì)降解，Jug-HSA體系熱力學(xué)參數(shù)僅與Jug和HSA相互作用有關(guān)。根據(jù)Van′t Hoff定律[19,22]：

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(2)

lnKA=-ΔH/RT+ΔS/R

(3)

計(jì)算獲得Jug與HSA之間的ΔH、ΔS和ΔG值，結(jié)果見(jiàn)表2。ΔG<0，表明反應(yīng)可自發(fā)進(jìn)行; 由ΔH<0和ΔS<0確定， Jug和HSA之間作用力主要是范德華力和氫鍵。

表2 Jug-HSA體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

3.2.4 結(jié)合距離藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合距離可以利用F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[23]進(jìn)行計(jì)算，能量轉(zhuǎn)移效率(E)、臨界距離(R0)和結(jié)合距離(r)關(guān)系如下：

(4)

R06=8.79×10-25K2N-4φJ(rèn)

(5)

(6)

式中，K2為偶極空間取向因子(取值2/3)，N為介質(zhì)的折射率(取值1.336)，φ為供體在無(wú)受體存在時(shí)的熒光量子產(chǎn)率(取值0.118)，F(xiàn)(λ)為供體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度，ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。

圖4 HSA的熒光發(fā)射光譜(a)和Jug紫外吸收光譜(b)的重疊圖Fig.4 Overlap spectrum of fluorescence emission of HSA (a) and absorbance spectrum of Jug (b)CHSA=CJug=1.0 μmol/L, T=298 K

HSA熒光光譜和Jug吸收光譜的重疊圖見(jiàn)圖4。根據(jù)公式(4)～(6)求得Jug與HSA濃度比為1∶1時(shí)， 重疊積分J=3.77×10-15(cm3·L)/mol，能量轉(zhuǎn)移效率E=0.21，臨界距離R0=2.09 nm，結(jié)合距離r=2.61 nm。r<7 nm且滿(mǎn)足0.5R0R0，表明非輻射能量轉(zhuǎn)移對(duì)熒光猝滅的貢獻(xiàn)較小，Jug對(duì)HSA內(nèi)源熒光猝滅機(jī)制主要為靜態(tài)猝滅，這與熒光猝滅機(jī)制結(jié)論一致。

3.3 Jug對(duì)HSA構(gòu)象影響分析

3.3.1 紫外吸收光譜分析紫外吸收光譜是研究藥物小分子對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)影響的一種有效方法。HSA在278 nm處的紫外吸收主要由Trp和Tyr殘基苯雜環(huán)π→π*躍遷引起，可反映蛋白質(zhì)芳香族氨基酸殘基信息[24]。Jug位于249.5 nm的吸收峰，則是由其分子1,4-萘醌結(jié)構(gòu)π→π*躍遷引起。為了更加準(zhǔn)確地體現(xiàn)出不同濃度Jug對(duì)HSA紫外吸收光譜影響，以相應(yīng)濃度Jug溶液為參比液，掃描Jug-HSA體系的紫外光譜，結(jié)果見(jiàn)圖5(曲線(xiàn)a→h)。隨著Jug濃度增加，HSA在278 nm處的光吸收值逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明Jug使HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

3.3.2 同步熒光光譜分析同步熒光光譜具有簡(jiǎn)化光譜、窄化譜帶和較少光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)，常被用于研究蛋白質(zhì)發(fā)光基團(tuán)構(gòu)象變化。通常情況下，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm同步熒光光譜能夠選擇性地呈現(xiàn)Tyr和Trp殘基特征熒光。根據(jù)最大發(fā)射波長(zhǎng)和強(qiáng)度變化可以獲得蛋白質(zhì)相應(yīng)氨基酸殘基微環(huán)境極性的改變信息，進(jìn)而可以判斷藥物小分子對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響[13,25]。隨著研究體系中Jug濃度增大，Tyr和Trp殘基的同步熒光猝滅效果明顯(圖6)。代表Trp的熒光猝滅程度(30.84%)顯著大于Tyr (16.80%)，表明HSA與Jug結(jié)合部位更靠近Trp。Tyr殘基最大發(fā)射波長(zhǎng)略藍(lán)移0.7 nm，表明與Jug作用在一定程度上影響了HSA構(gòu)象，主要引起Tyr殘基附近微環(huán)境疏水性增加，對(duì)Trp影響甚微。

圖6 Jug濃度對(duì)HSA Δλ=15 nm(A)和Δλ=60 nm(B)同步熒光光譜的影響Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of Jug-HSA at (A) Δλ=15 nm and (B) Δλ=60 nmCHSA=1.0 μmol/L, CJug (a～h)=0， 0.3, 0.6, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 μmol/L; T=298 K

3.3.3 三維熒光光譜分析三維熒光光譜體現(xiàn)的是熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和發(fā)射波長(zhǎng)(λem)同時(shí)變化的信息，它是另外一種證實(shí)HSA構(gòu)象和發(fā)光基團(tuán)微環(huán)境是否發(fā)生改變的有效方法[26]。HSA與Jug作用前后的三維立體熒光光譜圖及三維熒光等高線(xiàn)如圖7和圖8所示。HSA三維熒光光譜圖中，Peak a為瑞利散射峰(λex=λem)，Peak 1(λex/λem/Intensity，230 nm/348.3 nm/153.0)為HSA多肽骨架結(jié)構(gòu)熒光特征峰，Peak 2(λex/λem/Intensity，285 nm/348.3 nm/1329.8)為T(mén)rp、Tyr和Phe的重疊熒光峰。隨著Jug的加入，HSA的Peak 1(Intensity，104.4)和Peak 2(Intensity，818.5)的強(qiáng)度均有所降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)都藍(lán)移了0.9 nm。二級(jí)結(jié)構(gòu)峰Peak 1強(qiáng)度降低及略藍(lán)移現(xiàn)象，表明Jug的加入引起了蛋白多肽鏈發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致HSA構(gòu)象改變; Peak 2強(qiáng)度降低及藍(lán)移現(xiàn)象，顯示HSA中熒光基團(tuán)微環(huán)境非極性略增，這與Δλ=15 nm同步熒光光譜結(jié)果一致。瑞利散射峰Peak a降低，說(shuō)明與Jug作用破壞了HSA表面保護(hù)水層，使原本較為分散的蛋白質(zhì)變得更加分散，蛋白質(zhì)粒徑減小，Jug-HSA體系瑞利散射強(qiáng)度降低。

圖7 HSA溶液的三維熒光光譜圖(A)和等高線(xiàn)圖(B)Fig.7 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA solution (A) and its contours (B)CHSA=1.0 μmol/L, T=298 K

圖8 HSA與Jug作用后的三維熒光光譜圖(A)和等高線(xiàn)圖(B)Fig.8 Three-dimensional fluorescence spectra of Jug-HSA solution (A) and its contours (B)CHSA=1.0 μmol/L, CJug=4.0 μmol/L, T=298 K

3.4 分子對(duì)接模擬分析

圖9 (A) Jug在HSA上的結(jié)合位置; (B) 放大的Jug與HSA分子對(duì)接模擬圖; (C)Jug和HSA相互作用圖Fig.9 (A) Binding site of Jug in HSA; (B) Enlarged binding mode between Jug and HSA; (C) Molecular modeling of interaction between Jug and HSA

4 結(jié) 論

在模擬人體生理?xiàng)l件下，采用內(nèi)源熒光光譜、紫外吸收光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)Jug與HSA之間的結(jié)合過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，Jug主要通過(guò)氫鍵、范德華力和疏水作用力，與HSA自發(fā)形成摩爾比為1∶1的復(fù)合物。結(jié)合過(guò)程使HSA構(gòu)象輕微改變，導(dǎo)致相關(guān)發(fā)光基團(tuán), 尤其是Tyr殘基周?chē)h(huán)境疏水性有所增加，兩者間結(jié)合距離為2.61 nm。分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)一步解釋并驗(yàn)證了光譜分析的正確性，并給出了Jug在HSA亞域ⅢA結(jié)合位置以及參與氫鍵、范德華力和疏水相互作用的主要氨基酸殘基。Jug與HSA間結(jié)合常數(shù)為102數(shù)量級(jí)(310 K)，其值偏小，說(shuō)明游離態(tài)和Jug-HSA復(fù)合物應(yīng)是Jug在血液循環(huán)中的兩種運(yùn)輸方式。本研究為深入理解Jug在體內(nèi)的運(yùn)輸儲(chǔ)藏過(guò)程和用藥安全性評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。